專利名稱：肽與核酸類似物諸如pna、lna、或嗎啉代之間的綴合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于抗擊傳染性微生物(特別是細菌)的新型藥物。更具體的說，本發明涉及肽核酸(PNA)序列，而且對它們進行了修飾，從而獲得抗感染特性增強的新型PNA分子。
背景技術：
自二十世紀四十年代發現青霉素以來，一直在尋找新的藥物。已經發現了或者由早已存在的藥物發展了許多藥物或抗生素。然而，這些年來許多細菌菌株針對一種或多種目前可用藥物產生了抗性，而這些藥物在過去是有效的。目前臨床醫生使用的抗生素藥物的數目超過100種。
大多數抗生素是天然微生物群體的產物，而在這些群體中發現的抗性可以在物種間傳播，而且似乎是病原體在來自農業和醫學中所用抗生素的選擇壓力下獲得這些抗性的(Davis，1994)。在包含化學改變或降解抗生素的酶的編碼基因的細菌中可能產生抗生素抗性。另一種可能性是，細菌編碼使細胞壁不能透過抗生素的酶，或者編碼在抗生素能夠發揮其作用前將其由細胞內逐出的流出泵。
由于抗生素抗性細菌病原體的出現，目前正需要新的治療策略。避免由抗性基因引起的問題的一種策略是由不存在特異抗性的新型化學藥品種類開發抗感染藥物。
反義試劑也為抗擊疾病提供了新策略，以及在藥物設計中采用新型化學藥品種類的機會。
寡核苷酸能夠以幾種方式與天然DNA和RNA相互作用，其中之一是在寡核苷酸與單鏈核酸之間形成雙鏈體，另一種是在寡核苷酸與雙鏈DNA之間形成三鏈體。
來自基礎研究的結果是鼓舞人心的，而且針對病毒基因和引起疾病的人類基因的反義寡核苷酸藥物配方正在進行臨床試驗。針對細菌基因的有效反義抑制可能也具有廣泛應用，然而，很少嘗試將反義技術延伸至細菌。
肽核酸(PNA)是在某些方面與寡核苷酸及其類似物相似因而可模仿DNA和RNA的化合物。在PNA中，寡核苷酸的脫氧核糖主鏈被假肽主鏈替代(Nielsen等人，1991(29))(

圖1)。每個亞基或單體具有天然發生的或非天然發生的核堿基附著于該主鏈。這樣的一種主鏈是由重復單位N-(2-氨乙基)甘氨酸通過酰胺鍵相連而構成的。PNA通過Watson-Crick堿基配對和螺旋形成與互補核酸發生雜交(Egholm等人，1993(30))。假肽主鏈提供了優越的雜交特性(Egholm等人，1993(30))、對酶促降解的抗性(Demidov等人，1994(31))、和多種化學修飾的途徑(Nielsen和Haaima，1997(32))。
PNA結合DNA和RNA而形成PNA/DNA或PNA/RNA雙鏈體。根據Tm測定，產生的PNA/DNA或PNA/RNA雙鏈體的結合親和力大大高于相應的DNA/DNA或DNA/RNA雙鏈體。高度熱穩定性可能要歸功于因PNA中性主鏈而缺乏電荷排斥。除了親和力提高以外，PNA還顯示結合DNA的特異性也提高了。當PNA/DNA雙鏈體錯配熔解時，看到Tm相對于DNA/DNA雙鏈體下降8-20℃。
此外，同型嘧啶PNA寡聚物與DNA或RNA寡聚物中的序列互補靶形成極其穩定的PNA2-DNA三鏈體。最后，PNA可通過螺旋侵入而結合雙鏈DNA或RNA。
PNA相對于寡核苷酸的一個優點是，PNA聚酰胺主鏈(其上附著有適當的核酸堿基或其它側鏈基團)不被核酸酶或蛋白酶識別，因而不被切割。結果，PNA對酶促降解具有抗性，從而與核酸和肽不同。
對于反義應用，與靶結合的PNA能夠引起DNA和RNA聚合酶、逆轉錄、端粒酶、和核糖體的空間位阻(Hanvey等人，1992(33)；Knudsen等人，1996(34)；Good和Nielsen，1998(39，40)等)。
使用反義試劑常常遇到的困難是細胞攝取。可以設想用于改進攝取的多種策略，而且據報導使用脂質(Lewis等人，1996(35))、包囊(Meyer等人，1998(36))、和載體策略(Nyce和Metzger，1997(37)；Pooga等人，1998(38))改進了真核細胞的攝取。
WO 99/05302公開了由PNA與轉運肽transportan構成的PNA綴合物，這種肽可用于轉運穿過脂膜和將PNA投遞至與胞內多核苷酸相互接觸。
US-A-5 777 078公開了成孔化合物，它包含識別靶細胞并連接成孔劑(諸如細胞外毒素)的投遞劑。該化合物與藥物(諸如PNA)一起施用。
作為用于微生物的反義試劑，PNA可能具有獨特優勢。已經證明，當靶向大腸桿菌rRNA和mRNA時，用于細菌應用的基于PNA的反義試劑能夠控制細胞生長和生長表型(Good和Nielsen，1998a、b(39，40)和WO 99/13893)。
然而，這些公開都沒有討論轉運PNA穿過細菌細胞壁和細胞膜的方法。
此外，對于細菌應用，預計攝取不好，因為細菌具有針對外來分子的嚴格屏障，而且包含核酸堿基的反義寡聚物對于有效攝取顯得太長。Good和Nielsen(1998a、b(39，40))獲得的結果指出，PNA寡聚物通過被動擴散穿過脂雙層不易進入細菌細胞。
US-A-5 834 430公開了增強劑(諸如陽離子短肽)在加強抗生素效力中的使用。所述試劑與抗生素共施用。
WO 96/11205公開了PNA綴合物，其中綴合部分可置于PNA主鏈的末端或非末端部位，以使PNA發揮功能。綴合部分可以是報告酶或分子、類固醇、碳水化合物、萜、肽、蛋白質等。據稱，除了其它特性外，綴合物可擁有改進的轉移特性以穿過細胞膜。然而，WO 96/11205沒有公開可穿過細菌膜的綴合物。
WO 98/52614公開了增強跨生物膜(如細菌細胞壁)轉運的方法。依照該出版物，生物學活性劑(諸如PNA)可以綴合轉運聚合物以增強跨膜轉運。轉運聚合物由6-25個亞基構成；其中至少50％包含胍基和/或脒基側鏈。優選轉運聚合物是含9個精氨酸的多肽。
因而，盡管先前使用PNA技術獲得了有希望的結果，然而仍非常需要開發有效抗擊微生物的新型PNA反義藥物。
發明概述本發明涉及用于抗擊細菌的新策略。先前已經顯示，反義PNA能夠抑制細菌生長。然而，由于PNA穿過細菌細胞壁的擴散緩慢，因而PNA作為抗生素的實際應用在以前是不可能的。依照本發明，可以通過連接增強PNA活性的肽或肽樣序列來修飾PNA，從而實現可耐受濃度的實際應用。
令人驚訝地發現，通過摻入肽可以觀察到抗感染效果增強。經修飾PNA分子的重要特征似乎是包含特別是帶正電荷且親脂性的氨基酸或氨基酸類似物的模式。在肽相對于PNA序列的不同取向中都發現抗感染效果。
因而，本發明涉及式(I)的經修飾PNA分子，及其制藥學可接受鹽類肽-L-PNA(I)其中L是接頭或鍵，肽是任何氨基酸序列，且PNA是肽核酸。
更具體的說，本發明涉及式(I)的經修飾PNA分子肽-L-PNA(I)其中肽是陽離子肽或陽離子肽類似物或功能相似部分(moiety)，肽或肽類似物具有式(II)C-(B-A)n-D (II)，其中A由1-8個不帶電荷的氨基酸和/或氨基酸類似物構成，B由1-3個帶正電荷的氨基酸和/或氨基酸類似物構成，C由0-4個不帶電荷的氨基酸和/或氨基酸類似物構成，D由0-3個帶正電荷的氨基酸和/或氨基酸類似物構成，n是1-10，且氨基酸和/或氨基酸類似物的總數是3-20個。
在一個實施方案中，本發明的肽含有2-60個氨基酸。
氨基酸可以是帶負電荷、不帶電荷、或帶正電荷的天然發生的、經重排的、或經修飾的氨基酸。
在本發明的一個優選實施方案中，肽包含2-18個氨基酸，最優選5-15個氨基酸。
在本發明的另一個優選實施方案中，通式(II)中的A由1-6個不帶電荷的氨基酸和/或氨基酸類似物構成，且B由1或2個帶正電荷的氨基酸和/或氨基酸類似物構成。在另一個實施方案中，A由1-4個不帶電荷的氨基酸和/或氨基酸類似物構成，且B由1或2個帶正電荷的氨基酸和/或氨基酸類似物構成。
在本發明的優選實施方案中，將通式(I)的經修飾PNA分子用于治療或預防由大腸桿菌(Escherichia coli)或萬古霉素抗性腸球菌(諸如糞腸球菌(Enterococcus faecalis)和屎腸球菌(Enterococcusfaecium))引起的感染或者由甲氧西林抗性和甲氧西林-萬古霉素抗性金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)引起的感染。
通過氨基(N末端)或羧基(C末端)末端使肽連接PNA序列。
在優選的實施方案中，通過羧基末端使肽連接PNA序列。
在本發明中，通式(I)的化合物可以制備成制藥學可接受鹽類的形式，尤其是酸加成鹽，包括有機酸和無機酸的鹽類。這些鹽類的范例包括有機酸諸如甲酸、延胡索酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、水楊酸等的鹽類。合適的無機酸加成鹽包括氫氯酸、氫溴酸、硫酸、磷酸等的鹽類。制藥學可接受的無機酸或有機酸加成鹽的其它范例包括熟練技術人員知道的Journal of Pharmaceutical Science，662，1977中所列的制藥學可接受鹽類。
制藥學可接受的酸加成鹽還意欲包括本發明化合物能夠形成的水合物。
可以作為化合物合成的直接產物來獲得酸加成鹽。或者，可以將游離堿溶于含適當酸的合適溶劑中，并通過蒸發溶劑或將鹽與溶劑分開的其它方式來分離鹽。
使用熟練技術人員知道的方法，本發明的化合物可以與標準低分子量溶劑形成溶劑合物。
在本發明的另一個方面，將經修飾PNA分子用于藥物制造，該藥物用于治療或預防傳染性疾病或者用于給無生命物品消毒。
在另一個方面，本發明涉及用于治療或預防傳染性疾病或者用于給無生命物品消毒的組合物。
在還有一個方面，本發明涉及傳染性疾病的治療或預防或者對無生命物品的處理。
在還有一個方面，本發明涉及可用于本發明的經修飾PNA分子中的特異性有利反義PNA序列的鑒定方法。
在還有一個方面，本發明涉及能夠結合DNA和RNA兩者的其它反義寡核苷酸。
寡核苷酸類似物是具有能夠使其通過Watson-Crick堿基配對與mRNA中的靶序列發生雜交而在靶序列中形成RNA/寡聚物雙鏈體的核苷酸堿基(核堿基(nucleobases))序列和亞基-亞基主鏈的寡聚物。寡核苷酸類似物可以具有與靶序列完全互補或近乎互補的序列，只要形成的雜交雙鏈體結構具有足夠的穩定性來阻斷或抑制包含靶序列的mRNA的翻譯。
本發明的寡核苷酸類似物選自國際PCT公開文本WO99/14226中所述的鎖定核苷類似物(Locked Nucleoside Analogues)(LNA)；國際PCT公開文本WO98/03533中所述的寡核苷酸；或反義寡聚物，特別是國際PCT公開文本WO98/32467中所述的嗎啉代類似物。
收入PCT公開文本WO99/14226、WO98/03533、和WO98/32467作為參考。
因而，本發明的其它優選化合物是通式(III)的經修飾寡核苷酸肽-L-Oligon (III)其中L是接頭或鍵，
肽是任何氨基酸序列，且Oligon指寡核苷酸或其類似物。
附圖簡述圖1顯示了DNA和PNA寡聚物的化學結構。
圖2顯示了使用SMCC綴合的原理。
圖3顯示了編碼PBP1A的mrcA(ponA)基因的核苷酸序列。基因序列(編號X02164)得自EMBL序列數據庫(Heidelberg，德國)(Broome-Smith等人，Eur JBiochem，147437-446，1985(41))。鑒定了兩個可能的起始密碼子(已標明)。顯示了第1-2688位堿基(以終止密碼子結束)。
圖4顯示了編碼PBP2的mrdA基因的核苷酸序列。序列(編號AE000168，第4051-5952位堿基，編號1-2000)得自位于NCBI(Genbank，國家生物技術信息中心(National Centre forBiotechnology Information)，美國)的大腸桿菌基因組數據庫。起始密碼子已標明。
圖5顯示了用于綴合肽與PNA的基于琥珀酰亞胺基(succinimidyl)的不同連接基團的化學結構。
發明詳述反義PNA能夠以基因和序列特異性方式抑制細菌基因的表達(Good和Nielsen，1998a、b(39，40)和WO 99/13893)。可證明該方法可作為功能基因組學的工具和新型抗微生物藥物的來源。然而，需要改進標準PNA以提高反義效力。對活性的主要限制似乎是進入細胞。細菌有效排除大分子量外來化合物的進入，而且先前體外和細胞測定的結果似乎顯示細胞屏障限制反義效果。因此，本發明關注用于改進反義效力活性的策略。
不限于理論，認為陽離子短肽可導致細菌細胞壁的PNA攝取得到改進。認為短肽通過穿透細胞壁來發生作用，使得經修飾PNA分子能夠穿過細胞壁而到達細胞內結構，諸如基因組、mRNA、核糖體等。然而，到達核酸靶的改進或結合PNA的改進可能也增加觀察到的整體效果。
依照本發明，用活性增強短肽修飾的PNA分子能夠在納摩爾濃度特異且有效的抑制細菌基因。這個濃度的反義效力與該技術的實際應用是一致的。認為本發明第一次證明了具有某種陽離子且親脂性氨基酸模式的肽可以作為載體用于將試劑和其它化合物投遞到微生物(諸如細菌)中。此外，本發明使得有可能以有效的且患者可接受的濃度施用PNA。
因此，本發明涉及有以下通式的新型經修飾PNA分子肽-L-PNA其中L是接頭或鍵，PNA是肽核酸序列，且肽是陽離子肽或肽類似物或功能相似部分，肽或肽類似物具有通式C-(B-A)n-D，其中A由1-8個不帶電荷的氨基酸和/或氨基酸類似物構成，B由1-3個帶正電荷的氨基酸和/或氨基酸類似物構成，C由0-4個不帶電荷的氨基酸和/或氨基酸類似物構成，D由0-3個帶正電荷的氨基酸和/或氨基酸類似物構成，n是1-10，且氨基酸和/或氨基酸類似物的總數是3-20。
在經修飾肽核酸(PNA)分子的一個優選組中，A由1-6個不帶電荷的氨基酸和/或氨基酸類似物構成，且B由1或2個帶正電荷的氨基酸和/或氨基酸類似物構成。在另一個優選組中，A由1-4個不帶電荷的氨基酸和/或氨基酸類似物構成，且B由1或2個帶正電荷的氨基酸和/或氨基酸類似物構成。
術語“陽離子氨基酸和氨基酸類似物”和“帶正電荷的氨基酸和氨基酸類似物”應當理解為在生理學pH帶正電荷的天然或非天然發生的任何氨基酸或氨基酸類似物。相似地，術語“不帶電荷的氨基酸或氨基酸類似物”應當理解為在生理學pH不帶電荷的天然或非天然發生的任何氨基酸或氨基酸類似物。
在帶正電荷的氨基酸和氨基酸類似物中可以提到賴氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg，R)、二氨基丁酸(DAB)、和鳥氨酸(Orn)。熟練技術人員知道帶正電荷的其它氨基酸和氨基酸類似物。
在不帶電荷的氨基酸和氨基酸類似物中可以提到天然發生的氨基酸丙氨酸(Ala，A)、纈氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、異亮氨酸(Ile，I)、脯氨酸(Pro，P)、苯丙氨酸(Phe，F)、色氨酸(Trp，W)、甲硫氨酸(Met，M)、甘氨酸(Gly，G)、絲氨酸(Ser，S)、蘇氨酸(Thr，T)、半胱氨酸(Cys，C)、酪氨酸(Tyr，Y)、天冬酰胺(Asn，N)、和谷氨酰胺(Gln，Q)，非天然發生的氨基酸2-氨基丁酸、β-環己基丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、正亮氨酸、和苯甘氨酸。熟練技術人員知道不帶電荷的其它氨基酸和氨基酸類似物。
優選的是，不帶電荷的氨基酸和氨基酸類似物選自天然發生的非極性氨基酸Ala，Val、Leu、Ile、Phe、Trp、和Met，或者非天然發生的非極性氨基酸β-環己基丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、和正亮氨酸。
術語“功能相似部分(moiety)”定義為覆蓋在功能上模仿上文定義的肽因而賦予PNA分子以與上文定義的包含天然和非天然氨基酸的肽相同的有利特性的所有肽樣分子。
依照本發明的優選經修飾PNA分子的范例是(Lys Phe Phe)3Lys-L-PNA及其包含至少3個氨基酸的任何亞基。一種優選肽是(LysPhe Phe)3(SEQ ID NO1)。其它包括(Lys Phe Phe)2Lys Phe(SEQID NO2)、(Lys Phe Phe)2Lys(SEQ ID NO157)、(Lys Phe Phe)2(SEQ ID NO3)、Lys Phe Phe Lys Phe(SEQ ID NO4)、Lys PhePhe Lys(SEQ ID NO5)、和Lys Phe Phe。
其它優選肽是FFRFFRFFR(SEQ ID NO6)、LLKLLKLLK(SEQ IDNO7)、LLRLLRLLR(SEQ ID NO8)、LLKKLAKAL(SEQ ID NO9)、KRRWPWWPWKK(SEQ ID NO10)、KFKVKFVVKK(SEQ ID NO11)、LLKLLLKLLLK(SEQ ID NO12)、LLKKLAKALK(SEQID NO13)及其包含至少3個氨基酸且其中至少一個氨基酸是帶正電荷的氨基酸的任何亞基。
第三組優選肽是RRLFPWWWPFRRVC(SEQ ID NO14)、GRRWPWWPWKWPLIC(SEQ ID NO15)、LVKKVATTLKKIFSKWKC(SEQ IDNO16)、KKFKVKFVVKKC(SEQ ID NO17)及其包含至少3個氨基酸且其中至少一個氨基酸是帶正電荷的氨基酸的任何亞基。
第四組優選肽是爪蟾抗菌肽類(magainis)(M.Zasloff，Proc NatlAcad Sci USA，845449-5453，1987)，例如合成爪蟾抗菌肽衍生物GIGKFLHAAKKFAKAFVAEIMNS-NH2(SEQ ID NO158)以及E.A.Porter等人，Nature，404第565頁，2000中所述的β-氨基酸寡聚物(β-肽)。
肽中的氨基酸數目可以在3到20之間選擇。似乎至少3個氨基酸且其中至少一個是帶正電荷的氨基酸是獲得有利效果所必需的。另一方面，上限似乎只受到PNA分子在用于實際使用時對整體大小的上限的限制。優選的是，氨基酸總數是15或更少，更優選12或更少，最優選10或更少。
通過直接結合或通過接頭，使PNA分子連接肽部分。多種連接基團可用于連接PNA與肽。
連接基團描述于WO 96/11205和WO 98/52614，將它們的內容收入本文作為參考。
有些連接基團對于PNA與肽的特定組合可能是有利的。
優選連接基團是ADO(8-氨基-3，6-二氧雜辛酸)、SMCC(4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺基酯)、AHEX或AHA(6-氨基-己酸)、4-氨基丁酸、4-氨基環己基羧酸、LCSMCC(琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-羧基-(6-酰氨基-己酸酯))、MBS(間-馬來酰亞胺基-苯甲酸琥珀酰亞胺基酯)、EMCS(N-ε-馬來酰亞胺基-己酸琥珀酰亞胺基酯)、SMPH(6-(β-馬來酰亞胺基-丙酰胺基)己酸琥珀酰亞胺基酯)、AMAS(琥珀酰亞胺基N-(α-馬來酰亞胺基乙酸酯))、SMPB(4-(對-馬來酰亞胺基苯基)丁酸琥珀酰亞胺基酯)、β.ALA(β-丙氨酸)、PHG(苯甘氨酸)、ACHC(4-氨基環己酸)、β.CYPR(β-(環丙基)丙氨酸)、和ADC(氨基十二烷酸)。
任何這些基團都可作為單一連接基團或與多種基團一起用于生成合適接頭。此外，可以以任何次序和數目組合不同的連接基團，從而在接頭臂中獲得不同的功能性。
在優選的實施方案中，連接基團是β.ALA連接基團或ADO連接基團與上文提到的任何其它基團的組合。
因而，優選接頭是-achc-β.ala-、-achc-ado-、-lcsmcc-β.ala-、-mbs-β.ala-、-emcs-β.ala-、-lcsmcc-ado-、-mbs-ado-、-emcs-ado-、或-smph-ado-。
最優選的接頭是-achc-β.ala-、-lcsmcc-ado-、和-mbs-ado-。
在將SMCC(4-(N-馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺基酯)用于連接PNA與肽的情況中，必需在肽的末端加入半胱氨酸(C)或相似含硫部分(見圖2)。另外，氨基酸(諸如甘氨酸)可以是基團的一部分。
圖5顯示了用于綴合肽與PNA的基于琥珀酰亞胺基的不同連接基團的化學結構。
通常肽通過氨基或羧基末端連接PNA序列。然而，也可以將PNA序列連接到肽的內部，或者通過氨基和羧基兩個末端使PNA序列連接肽。
依照本發明的經修飾PNA分子包含序列與微生物(諸如細菌)中至少一種靶核苷酸序列互補的PNA寡聚物。靶可以是細菌生長和/或繁殖所必需的任何RNA的核苷酸序列。或者，靶可以是負責抗生素抗性的因子的編碼基因。在優選的實施方案中，靶核苷酸序列的功能是細菌存活所必需的，而且靶核酸的功能被PNA序列以反義方式阻斷。
PNA鏈與DNA或RNA鏈的結合可以以兩種取向，反向平行或平行，中的一種發生。在用于本發明時，術語“互補”在用于PNA時本身沒有指定取向是平行或反向平行。有意義的是，PNA/DNA和PNA/RNA的大多數穩定取向是反向平行。在優選的實施方案中，靶向單鏈RNA的PNA以反向平行的取向而互補。
在本發明的另一個優選實施方案中，將由兩個PNA寡聚物彼此共價相連而成的雙PNA靶向RNA(或DNA)中的同聚嘌呤序列(僅由腺嘌呤和/或鳥嘌呤核苷酸組成)，并與之形成PNA2-RNA(或PNA2-DNA)三股螺旋。
在本發明的另一個優選實施方案中，PNA含5-20個核堿基，特別是7-15個核堿基，最特別的是8-12個核堿基。
肽核酸描述于WO 92/20702和WO 92/20703，將它們的內容收入本文作為參考。
在PNA的優選實施方案中，主鏈是如圖1所示的氨基乙基甘氨酸。
可以根據細菌生理學的知識來選擇潛在的靶基因。可以在涉及主要過程復合物之一的那些基因中找到靶基因細胞分裂、細胞壁合成、蛋白質合成(翻譯)和核酸合成、脂肪酸代謝、和基因調控。靶基因還可能涉及抗生素抗性。
另一種考慮是，有些生理學過程主要在分裂細胞中是活躍的，而其它過程是在非分裂環境下進行的。
細胞壁生物合成中的已知靶蛋白是青霉素結合蛋白PBP，如β-內酰胺抗生素青霉素等的靶。它們涉及胞壁質囊交聯的最后階段。
大腸桿菌有12種PBP，包括高分子量PBPPBP1a、PBP1b、PBP1c、PBP2、和PBP3，和7種低分子量PBPPBP4-7、DacD、AmpC、和AmpH。只知道高分子量PBP是生長所必需的，因此選擇作為PNA反義的靶。
蛋白質生物合成是貫穿細菌細胞周期的重要過程。因此，蛋白質生物合成領域的靶區的效果不依賴細胞分裂。
DNA和RNA合成都是抗生素的靶領域。DNA合成中的一種已知靶蛋白是旋轉酶。旋轉酶在復制、轉錄、修復、和限制中發揮作用。該酶由兩個亞基構成，二者都是PNA的候選靶。
主要在分裂細胞中激活的潛在靶的范例是rpoD、gyrA、gyrB(轉錄)、mrcA(ponA)、mrcB(ponB、pbpF)、mrdA、ftsI(pbpB)(細胞壁生物合成)、ftsQ、ftsA、和ftsZ(細胞分裂)。
在非分裂細胞中也激活的潛在靶的范例是infA、infB、infC、tufA/tufB、tsf、fusA、prfA、prfB、和prfC(翻譯)。
其它潛在靶基因是抗生素抗性基因。熟練技術人員將容易地知道從哪些基因進行選擇。兩個范例是滅活β-內酰胺抗生素的β-內酰胺酶的編碼基因和氯霉素乙酰轉移酶的編碼基因。
針對這些抗性基因的PNA可用于抗擊抗性細菌。
另一種潛在靶基因是編碼大腸桿菌酰基載體蛋白的acpP基因。
ACP(酰基載體蛋白)是高度可溶的小型蛋白質，在I型脂肪酸合酶系統中擔負中心任務。長鏈脂肪酸的中間物通過脂肪酸的羧基與磷酸泛酰巰基乙胺輔基的巰基之間的硫酯鍵來共價結合ACP。
ACP是大腸桿菌中最豐富的蛋白質之一，占可溶性蛋白質總量的0.25％(大約6×104個分子/細胞)。ACP的細胞濃度受到調控，而且來自誘導型質粒的ACP過度生成對于大腸桿菌細胞是致死的。
傳染性疾病是由屬于細菌、病毒、原生動物、蠕蟲、和節肢動物的非常廣泛的微生物引起的，從理論上說，可以修飾PNA并用于針對這些微生物(對抗生素敏感或抗性)中的所有種類的RNA。
可依照本發明處理的微生物的范例是革蘭氏陽性生物體諸如鏈球菌屬(Streptococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、消化球菌屬(Peptococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、利斯特氏菌屬(Listeria)、梭菌屬(Clostridium)、Propionebacteria，革蘭氏陰性細菌諸如擬桿菌屬(Bacteroides)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、埃希氏菌屬(Escherichia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、變形菌屬(Proteus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、弧菌屬(Vibrio)、軍團菌屬(Legionella)、嗜血菌屬(Haemophilus)、博德特氏菌屬(Bordetella)、布魯氏菌屬(Brucella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、布蘭漢氏球菌屬(Branhamella)，和革蘭氏染色法染色很差或一點也不染色的生物諸如分枝桿菌屬(Mycobacteria)、密螺旋體屬(Treponema)、鉤端螺旋體屬(Leptospira)、包柔氏疏螺旋體屬(Borrelia)、支原體屬(Mycoplasma)、Clamydia、立克次氏體屬(Rickettsia)、和考克斯氏體屬(Coxiella)。
在醫院/特別護理單位中引起感染的細菌具有多種抗微生物劑抗性的發生率在上升。這些細菌包括甲氧西林抗性和甲氧西林-萬古霉素抗性金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、萬古霉素抗性腸球菌(諸如糞腸球菌(Enterococcus faecalis)和屎腸球菌(Enterococcus faecium))、青霉素抗性肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、和頭孢菌素及喹諾酮抗性革蘭氏陰性桿菌(大腸菌)諸如大腸埃希氏菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、假單胞菌屬的物種、和腸桿菌屬的物種。最近，出現了全面抗生素(包括碳青霉烯類)抗性革蘭氏陰性細菌。這些多種抗生素抗性的迅速出現沒有被新型抗生素開發的相同速率反映，因此，可以想象，嚴重感染的患者很快將不再能被目前可使用的抗微生物劑治療(1，2)。幾份國際報告已經強調了在許多醫學領域中與抗微生物劑抗性的出現有關的潛在問題，還略述了管理由這些微生物引起感染的患者的難點(3，20)。A.革蘭氏陽性細菌甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)(4，5)、甲氧西林-萬古霉素抗性金黃色葡萄球菌(VMRSA)、和萬古霉素抗性腸球菌(VRE)已經成為主要的醫院病原體(3，6，7，18)。萬古霉素目前是用于由MRSA引起的感染的最可靠治療，但是抗性基因由VRE向MRSA的潛在轉移在未來可能剩下很少的治療選擇。VRE不但提供萬古霉素抗性基因的儲庫，還能夠在免疫缺陷的患者中引起難以治療的感染，有些菌株顯示針對所有主要類型抗生素的抗性。在臨床腸球菌分離菌中VRE菌株發生率的上升使它們成為重要的醫院病原體，而且在有些美國醫院中，VRE對超過20％的腸球菌感染負有責任(17，18)。
全世界有幾個中心/醫院已經報告了顯示中度萬古霉素抗性(VISA)的金黃色葡萄球菌以及VMRSA(8，9)。在來自美國、歐洲、和日本的金黃色葡萄球菌分離菌中，60-72％是MRSA，而且多藥抗性MRSA的大多數菌株是手術部位感染的最常見原因，包括所有這些金黃色葡萄球菌感染的61％，而且是ICU患者發病率和死亡率上升的主要原因(21，22，23，19)。
凝固酶陰性葡萄球菌(CNC)諸如表皮葡萄球菌(S.epidermidis)是與假體裝置和導管有關的感染的重要原因(13)。雖然它們顯示的毒性低于金黃色葡萄球菌，但是具有針對許多抗生素(包括β-內酰胺和糖肽)的內在低水平抗性。另外，這些細菌中的許多產生粘液(生物膜)，使得與假體有關的感染難以治療，而且常常需要除去受感染假體或導管(24)。
雖然多年來認為肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)對青霉素完全敏感，但是現在它已經由口腔鏈球菌獲得了抗性基因。這些抗性菌株的流行在全世界迅速上升，并將限制在嚴重肺炎球菌感染(包括腦膜炎和肺炎)治療中的選擇(10)。肺炎鏈球菌是全世界傳染性發病率和死亡率的主要原因。在美國，肺炎球菌對估計5萬例菌血癥、3千例腦膜炎、7百萬例中耳炎、和幾十萬例肺炎負有責任。肺炎球菌菌血癥的全年總發病率估計是每十萬人中有15-35例。目前，對小孩和老人的免疫尚未解決肺炎球菌感染的高發病率(27，28)。多藥抗性菌株是在二十世紀七十年代后期分離得到的，而現在遍布全世界(10)。B.革蘭氏陰性細菌銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、假單胞菌類的物種包括洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cepacia)和嗜麥芽黃單胞菌(Xanthomonas maltophilia)、腸桿菌科包括大腸桿菌、腸桿菌屬物種、和克雷伯氏菌屬物種占了出現抗性的分離菌的大半(25，26，3)。
膀胱炎、肺炎、敗血病、和手術后敗血癥是感染的最常見類型。在特別護理單位(ICU)治療的患者中，大多數感染來自患者自身內源菌群，另外多達50％的ICU患者還將獲得與較高程度的發病率和死亡率有關的醫院感染(19，11，12)。與這些感染有關的微生物包括腸桿菌科34％、金黃色葡萄球菌30％、銅綠假單胞菌29％、CNS 19％、和真菌17％。
使用廣譜抗生素造成的選擇壓力已經在革蘭氏陰性細菌中導致多藥抗性。每次導入新的藥物后，出現抗性亞克隆；現今，多數分離菌對至少一種抗微生物劑有抗性(20，14，25，26)。
銅綠假單胞菌的低滲透性細胞包膜與大腸桿菌的不同。來自歐洲的46％的銅綠假單胞菌分離菌對一種或多種抗生素有抗性，而且這種細菌生成粘液(生物膜)的能力和治療過程中抗性的快速發展常常導致治療失敗。多藥抗性銅綠假單胞菌也已經在有些特定ICU(諸如治療燒傷患者和囊性纖維化患者的那些ICU)中成為地方病(15，16)。
幾份國際報告已經強調了與上述細菌中抗微生物劑抗性的出現有關的潛在問題，因此，可以想象，嚴重感染的患者很快將不再能被目前可使用的抗微生物劑治療。在金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌(CNS)、腸球菌、肺炎鏈球菌、革蘭氏陰性芽孢桿菌(大腸菌)諸如大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、假單胞菌屬物種、和腸桿菌物種中，抗性菌株發生率的上升使得這些細菌成為未來PNA設計的主要候選者。
方法熟練技術人員應當清楚，可以以多種方式測量本發明化合物抑制細菌生長的能力。為了示例本發明的目的，通過使用依照NCCLS指南的微量稀釋肉湯法來測量細菌生長。本發明不限于檢測細菌生長抑制的這種方法。
為了說明測量生長和生長抑制的一個范例，可以使用下列程序細菌菌株大腸桿菌K12 MG1655培養基 10％ Mueller-Hinton肉湯，用無菌水稀釋。
10％ LB肉湯，用無菌水稀釋。
100％ Mueller-hinton肉湯。盤96孔盤，Costar #3474，Biotech Line AS，哥本哈根。(使用超低吸附盤以預防PNA在盤表面的附著或將之降至最低。)用新鮮且預熱的培養基稀釋大腸桿菌的對數期培養物，并調至確定的OD(在這里光密度位于600nm)，使終濃度達到5×105和5×104個細菌/ml培養基，每個孔分裝200μl細菌培養物。向每個孔的細菌培養物中加入PNA，終濃度范圍300nm-1000nM。將盤在自動分析儀(PowerWavex，software KC4.Kebo.Lab，哥本哈根)中于37℃搖動保溫16小時，并在保溫過程中測量600nm的光密度以記錄生長曲線。含細菌培養物而不含PNA的孔作為對照，以確保正確接種量和保溫過程中的細菌生長。測試培養物以檢測污染。
根據組成，各肽-L-PNA構建物的MW(分子量)介于大約4200與5000之間。因此，所有測試以摩爾標準進行而非重量/體積標準。然而，假設構建物的平均MW為4500，則500nM的濃度等于2.25μg/ml。PNA構建物的生長抑制效果將孔中的細菌生長描述為停滯期，即生長啟動之前的時期；對數期，即生長速率最大的時期；穩定期；隨后是死亡期。在通過比較含與不含PNA的生長曲線來評價PNA對細菌生長的抑制(最小抑制濃度，縮寫MIC)和殺菌(最小殺菌濃度，縮寫MBC)效果時使用這些參數。
細菌生長的完全抑制定義為OD(16小時)＝OD(0小時)或依照NCCLS指南沒有可見生長。
在最初篩選中，在敏感10％培養基測定中測試經修飾PNA分子。然后在100％培養基測定中測試陽性結果，以便在更“真實的”環境中確認抑制效果(比較美國指南NCCLS)。
通過在N.Frimodt-Moller等人，1999，《動物感染模型手冊》(Handbook of Animal Models ofInfection)第14章中所述小鼠腹膜炎/敗血癥模型中測試本發明化合物而測定了體內抗菌效力。
對于體內效力實驗，對大量雌性NMRI小鼠腹膜內接種大約107cfu大腸桿菌ATCC 25922。在感染后1、2、4、和6小時，采集血液和腹膜液的樣品，并計數cfu/ml。感染后1小時，分組處理動物一次第一組，慶大霉素(38mg/kg，皮下)；第二組，氨芐青霉素(550mg/kg，皮下)；第三組，本發明化合物(50-60mg/kg，靜脈內)；第四組，不處理。
在本發明的另一個方面，經修飾PNA分子可用于鑒定PNA的優選靶。根據已知或部分已知的靶微生物基因組(如來自基因組序列或cDNA文庫)，可以構建不同的PNA序列并連接有效抗感染增強肽，然后測試它的抗感染活性。可能有利的是，選擇由盡可能多的微生物、微生物獨特子集(諸如革蘭氏陰性細菌或革蘭氏陽性細菌)、或選定的獨特微生物共享的PNA序列，或者單一微生物特異的PNA序列。
在本發明的另一個方面，本發明提供了用于抑制傳染性微生物生長或繁殖的組合物，該組合物包含本發明的經修飾PNA分子。在一個實施方案中，對微生物生長的抑制是通過單獨使用經修飾PNA分子或者與抗生素或其它抗感染劑聯合使用而獲得的。在另一個實施方案中，組合物包含兩種或多種不同的經修飾PNA分子。第二種經修飾PNA分子可用于靶向與第一種經修飾PNA分子相同的細菌，或用于靶向不同的細菌。在后一種形式中，可以選擇靶細菌的特定組合用于治療。或者，靶可以是賦予一種或多種細菌以一種或多種抗生素抗性的一個或多個基因。在這種治療中，組合物或治療還包括使用所述抗生素。
在另一個方面，本發明在其范圍內包括藥物組合物，所述藥物組合物包含通式(I)的至少一種化合物或其制藥學可接受鹽類作為活性成份，以及制藥學可接受載體或稀釋劑。
可以通過常規技術來制備包含本發明化合物的藥物組合物，如描述于《雷明頓制藥科學和實踐》(RemingtonThe Science andPractise of Pharmacy)，第19版，1995。組合物可以以傳統形式存在，例如膠囊、片劑、氣霧劑、溶液、懸浮液、或局部敷貼劑。
典型組合物包含通式(I)的化合物或其制藥學可接受的酸加成鹽，其或與制藥學可接受賦形劑(可以是載體或稀釋劑)聯合，或用載體稀釋，或包裝在載體中，載體形式可以是膠囊、小袋(sachet)、紙、或其它容器。在組合物的生產過程中，可以使用制備藥物組合物的傳統技術。例如，通常將活性化合物與載體混合，或用載體稀釋，或包裝在載體中，載體形式可以是安瓿、膠囊、小袋、紙、或其它容器。當載體作為稀釋劑時，它可以是固體、半固體、或液體材料，作為活性化合物的媒介物、賦形劑、或介質。活性化合物可以吸附在粒狀固體容器(例如小袋)上。合適載體的一些范例是水、鹽溶液、乙醇、聚乙二醇、多羥乙氧基化蓖麻油、花生油、橄欖油、明膠、乳糖、石膏粉、蔗糖、葡萄糖、環化糊精、直鏈淀粉、硬脂酸鎂、滑石、明膠、瓊脂、果膠、阿拉伯膠、硬脂酸或纖維素的低級烷基醚、硅酸、脂肪酸、脂肪酸胺、脂肪酸甘油單酯和甘油二酯、季戊四醇脂肪酸酯、聚氧乙烯、羥甲基纖維素、和聚乙烯吡咯烷酮。相似地，載體或稀釋劑可包括本領域知道的任何緩釋材料，諸如單獨或與石蠟混合的單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。配方還可包含潤濕劑、乳化和懸浮劑、防腐劑、甜味劑、增稠劑、或增香劑。可以配制本發明的配方，從而在通過本領域眾所周知的程序施用于患者后，提供迅速、持續、或滯后的活性成份釋放。
藥物組合物可以滅菌，并(根據需要)和不與活性成份發生有害反應的輔劑、乳化劑、用于影響滲透壓的鹽、緩沖液、和/或著色物質等混合。
施用途徑可以是將活性成份有效轉運至適當或期望的作用位點的任何途徑，諸如口服、鼻吸、直腸、肺、經皮、或胃腸外如儲埋、皮下、靜脈內、尿道內、肌肉內、鼻內、滴眼液、或油膏，優選胃腸外或口服途徑。
若將固體載體用于口服施用，則制劑可以制片，以粉或丸形式置于硬明膠膠囊內，或者可以是錠劑或菱形錠劑的形式。若使用液體載體，則制劑可以是在水或非水性介質中的懸浮液或溶液、糖漿、乳劑、或軟明膠膠囊的形式。可加入增稠劑、增香劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑、或粘合劑。
對于鼻內施用，制劑可包含通式(I)的化合物，其溶解或懸浮于液體載體中，對于氣霧劑應用，特別是水性載體。載體可包含添加劑，諸如增溶劑，如聚乙二醇、表面活性劑、吸收增強劑諸如卵磷脂(磷脂酰膽堿)或環化糊精、或防腐劑諸如對羥基苯甲酸酯類。
對于胃腸外應用，特別合適的是可注射溶液或懸浮液，優選活性成份溶于多羥基化蓖麻油的水性溶液。
具有滑石和/或碳水化合物載體或粘合劑等的片劑、糖衣丸、或膠囊特別適用于口服應用。用于片劑、糖衣丸、或膠囊的優選載體包括乳糖、玉米淀粉、和/或馬鈴薯淀粉。在可采用增甜賦形劑的情況中，可以使用糖漿或酏劑。
在用于治療或預防哺乳動物中的傳染性疾病的配方中，根據具體的活性藥物、待治療的生物體、和生物體的載體來確定活性經修飾PNA分子的使用量。
這些哺乳動物也包括動物，包括家養動物(如家庭寵物)和非家養動物(諸如野生動物)。
通常，適于口、鼻、肺或經皮給藥的劑型包含約0.01mg至約500mg、優選約0.01mg至約100mg式I化合物，并與可藥用載體或稀釋劑混合。
在還有一個方面，本發明涉及通式(I)的一種或多種化合物或其制藥學可接受鹽類在制備用于治療和/或預防傳染性疾病的藥物中的用途。
在本發明的還有一個方面，本發明涉及治療或預防傳染性疾病的方法，所述處理方法包括給需要治療的患者或者為了預防性目的施用有效量的本發明經修飾PNA。這種處理可以采用施用本發明組合物的形式。具體而言，處理可以是傳統抗生素處理與一種或多種靶向負責抗生素抗性的基因的經修飾PNA分子的聯合。
在本發明的還有一個方面，本發明涉及經修飾PNA分子在給生物體以外的物品消毒中的應用，所述物品諸如手術工具、醫院設備(inventory)、牙科工具、屠宰場設備和工具、牛奶場設備和工具、理發師和美容師的工具等。
實施例下列實施例僅僅是本發明的示例，不應當認為是以任何方式限制本發明的范圍。使用大腸桿菌作為測試生物體顯示了本發明的原理。然而，如實施例19中所示，有利的效果以相同方式應用于其它細菌。
實驗部分中使用了涉及試劑的下列縮寫(單體和PNA序列以粗體表示)
實驗部分中使用了涉及連接基團的下列縮寫(作為起始材料的連接基團以大寫字母表示，而最后肽-PNA綴合物中的連接基團以小寫字母表示)
圖5顯示了含琥珀酰亞胺基的連接基團。
所有連接基團可以通過商業途徑獲得。
溶劑混合物的組成以體積表示，如30/2/10(v/v/v)。
制備型HPLC是在DELTA PAK(Waters)(C18，15μm，300_，300×7.8mm，3ml/min)上進行的。使用由溶劑A0.1％ TFA(溶于水)至溶劑B0.1％ TFA(溶于乙腈)的線性梯度。0-2min 10％B，2-30min40％ B，30-35min 100％ B，35-37min 100％ B，37-38min 10％ B，37-50min 10％ B。
質譜分析是在MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption andIonisation Time of Flight Mass Spectrometry，矩陣輔助激光解吸和離子化飛行時間質譜)上進行的，用下列分子量的肽核酸校準HPMALDI-TOF #G 2025AMw1＝1584.5g/mol，Mw2＝3179.0g/mol，和Mw3＝4605.4g/mol。實施例1H-KFFKFFKFFK-ado-TTC AAA CAT ATG-NH2(SEQ ID NO18)的制備在裝有D-2玻璃濾器的5ml玻璃反應器中在50mg MBHA樹脂(裝載100μmol/g)(novabiochem)上合成肽-PNA嵌合物H-KFFKFFKFFK-ado-TTC AAA CAT ATG-NH2(SEQ ID NO18)。用2×600μl TFA/間甲酚95/5進行去保護，隨后用DCM、DMF、5％ DIEA(溶于DCM和DMF)清洗。偶聯混合物是與200μl 0.5M DIEA(溶于吡啶)混合并用200μl 0.202M HATU(PE Biosystems)(溶于NMP)激活1分鐘的200μl 0.26M單體溶液(Boc-PNA-T單體、Boc-PNA-A單體、Boc-PNA-G單體、Boc-PNA-C單體、Boc-AEEA-OH(ado)(PE Biosystems公司))(溶于NMP)。用于肽部分的偶聯混合物是與200μl 1M DIEA(溶于NMP)混合并用200μl 0.45M HBTU(溶于NMP)激活1分鐘的200μl 0.52M氨基酸溶液(溶于NMP)(Boc-Phe-OH和Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH(novabiochem))。偶聯后，用DMF和DCM清洗樹脂，并用2×500μl NMP/吡啶/乙酸酐60/35/5覆蓋。用DCM、DMF、和DCM清洗終止合成循環。將寡聚物去保護，并使用“低-高”T FMSA由樹脂上切下來。將樹脂與2ml TFA/二甲硫醚/間甲酚/TFMSA 10/6/2/0.5旋轉1小時。除去溶液，用1ml TFA清洗樹脂，并加入1.5ml TFMSA/TFA/間甲酚2/8/1。將混合物旋轉1.5小時，并將濾出液在8ml二乙醚中沉淀。
用8ml二乙醚清洗沉淀。將粗制寡聚物溶于水，并通過HPLC純化。制備性HPLC是在DELTA PAK(Waters)(C18，15μm，300_，300×7.8mm，3ml/min)上進行的。使用由溶劑A0.1％ TFA(溶于水)至溶劑B0.1％ TFA(溶于乙腈)的線性梯度。0-2min 10％ B，2-30min 40％ B，30-35min 100％ B，35-37min 100％ B，37-38min 10％ B，37-50min10％ B。
Mw計算值＝4791.9g/mol；MALDI測量值＝4791g/mol。實施例2PNA的馬來酰亞胺活化將PNA寡聚物ado-TTC AAA CAT AGT-NH2(SEQ ID NO19)(HPLC純化)(2mg，0.589μmol，Mw 3396.8)在NMP∶DMSO 8∶2(2ml)中溶解并攪動15分鐘。向溶液中加入溶于NMP(50μl)和DIEA(34.7μl，198.7μmol)的4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸琥珀酰亞胺基酯(SMCC)(PIERCE)(1.1mg，3.24μmol，5.5eq.)，將反應混合物繼續攪動2.5小時。在二乙醚(10ml)中沉淀產物。用乙醚∶NMP 10∶1(3×10ml)和乙醚(3×10ml)清洗沉淀。
Mw計算值＝3615.8g/mol；MALDI測量值＝3613.5g/mol。
未進一步純化即使用產物。實施例3肽與馬來酰亞胺活化的PNA的綴合向上文激活產物(0.2mg，溶于200μl DMF∶水 1∶1)中加入肽溶液CKFFKFFKFFK(SEQ ID NO20)(0.5mg，溶于200μl 10mM脫氣Tris緩沖液，pH7.6(329nM))。將反應混合物攪動過夜。通過HPLC直接由粗制反應混合物純化目標化合物。制備性HPLC是在DELTA PAK(Waters)(C18，15μm，300_，300×7.8mm，3ml/min)上進行的。使用由溶劑A0.1％ TFA(溶于水)至溶劑B0.1％ TFA(溶于乙腈)的線性梯度。0-2min 10％ B，2-30min 40％ B，30-35min 100％ B，35-37min 100％ B，37-38min 10％ B，37-50min 10％ B。
Mw計算值＝5133.0g/mol；MALDI測量值＝5133g/mol。實施例4H-LLKKLAKALKG-ahex-ado-CCATCTAATCCT-NH2(SEQ ID NO21)的制備依照實施例1進行，但是與8-氨基-3，6-二氧雜辛酸(ado)一起使用6-氨基己酸(ahex)作為接頭。實施例5H-KFFKFFKFF-ado-JTJTJJT-ado-ado-ado-TCCCTCTC-Lys-NH2(SEQ IDNO22)的制備依照實施例1進行，但是使用PNA寡聚物ado-JTJTJJT-ado-ado-ado-TCCCTCTC-Lys-NH2(SEQ ID NO23)代替ado-TTC AAA CAT ATG-NH2(SEQ ID NO19)。這種PNA是形成三鏈體的雙PNA，其中“Hoogsteen鏈”中的C(胞嘧啶)與J核堿基(質子化C的替代物)交換。這種替代確保了處于生理學pH時有效形成三鏈體(M.Egholm、K.L.Dueholm、O.Buchardt、J.Coull、和P.E.Nielsen，Nucleic Acids Research 1995，23217-222，(42))。實施例6肽-PNA嵌合物的制備如上所述，以相同的方式制備不同的肽-PNA嵌合物。

實施例7如實施例1中所述，使用上文定義的連接基團制備下表I中的肽-PNA嵌合物。表I
實施例8如實施例1中所述，使用上文定義的連接基團制備下表III中的肽-PNA嵌合物。表III
實施例9初級篩選的描述細菌生長測定法設計用于鑒定抑制或完全消除細菌生長的經修飾PNA分子。生長抑制是由PNA與靶基因mRNA的反義結合產生的。在整個測定過程中存在所測化合物。成份用于該方案的實驗細菌菌株是來自大腸桿菌遺傳原種中心(E.coli Genetic Stock Center，耶魯大學，New Haven)的大腸桿菌K12 MG1655。用于生長的培養基是10％無菌LB(Lurea Bertani)培養基。
將大腸桿菌測試細胞在LB培養基中于37℃預培養過夜(過夜培養物)。在96孔微量滴定板中于37℃、恒速搖動進行篩選。
將PNA溶于H2O作為40x濃縮儲液。測定條件由過夜培養物于37℃培養新鮮培養物(測試培養物)至中對數期(OD600＝0.1，對應于107個細胞/ml)。使用10％ LB培養基將測試培養物在105-101的范圍內逐步稀釋。向每個測試孔中加入195μl稀釋培養物和5μl 40x濃縮PNA儲液。
將96孔微量滴定板在微量培養板掃描分光光度計中于37℃、恒速搖動保溫。每3.19分鐘自動進行OD600測量，并同時記錄。靶基因青霉素結合蛋白(PBP)PBP在胞壁質(肽聚糖)的生物合成中發揮作用，而胞壁質是革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌包膜的一部分。通過結合作為底物類似物的青霉素，PBP受到抑制，隨后水解酶通過肽聚糖中間物的積累而得到激活，由此水解肽聚糖層并引起裂解。
大腸桿菌有7-9種PBP，包括高分子量PBP(PBP1A和PBP1B、PBP2、和PBP3)和低分子量PBP(PBP4-9)。高分子量PBP是生長所必需的，而低分子量PBP不是必需的。
PNA設計編號1依照大腸桿菌中編碼PBP1A的mrcA(ponA)基因的序列設計了PNA26。mrcA基因(編號X02164)的序列得自EMBL序列數據庫(海德爾堡，德國)(Broome-Smith等人，Eur J Biochem，147437-446，1985(41))。mrcA基因的序列顯示于圖3。
PNA26的靶區如下有義5′AATGGGAAATTTCCAGTGAAGTTCGTAAAG 3′(SEQ ID NO142)121 ---------+---------+---------+ 150反義3′TTACCCTTTAAAGGTCACTTCAAGCATTTC 5′(SEQ ID NO143)顯示了GTG起始密碼子區的編碼(有義)和非編碼(反義)兩條鏈。
以5’至3’方向顯示反義鏈GTG起始密碼子區和PNA26的序列。
反義5′CTTTACGAACTTCACTGGAAATTTCCCATT 3′(SEQ ID NO143)PNA26 H-KFFKFFKFFK-ado-CACTGGAAATTT-Lys-NH2(SEQ ID NO144)PNA26是偶聯10個氨基酸的肽的12聚體PNA分子(以粗體顯示)。
使用PNA26的生長測定按如下進行測定將對應于105、104、103、102、和101個細胞/ml且所含PNA26終濃度為1.5、2.0、2.5、3.0、和3.5μM的測試培養物稀釋物于37℃、恒速搖動保溫16小時。在含104-101個細胞/ml且PNA濃度為至少2.5μM的培養物中能夠看到完全抑制(表1)。
PNA設計編號2依照編碼PBP2的mrdA基因的序列設計了PNA14。序列(編號AE000168，第4051-5951位核苷酸)得自位于NCBI(Genbank，國家生物技術信息中心(National Centre for BiotechnologyInformation)，美國)的大腸桿菌基因組數據庫。
mrdA基因的序列顯示于圖4。
PNA14的靶區如下
有義 5′GAGTAGAAAACGCAGCGGATGAAACTACAGAAC 3′(SEQ ID NO145)99 ---------+---------+---------+--- 131反義 3′CTCATCTTTTGCGTCGCCTACTTTGATGTCTTG 5′(SEQ ID NO146)顯示了GTG起始密碼子區的編碼(有義)和非編碼(反義)兩條鏈。
下面以5’至3’方向顯示反義鏈ATG起始密碼子區和PNA14的序列。
反義 5′GTTCTGTAGTTTCATCCGCTGCGTTTTCTACTC 3′(SEQ ID NO146)PNA14 HKFFKFFKFFK-ado-TTTCATCCGCTG-Lys-NH2(SEQ ID NO147)PNA14是偶聯10個氨基酸的肽的12聚體PNA分子(以粗體顯示)。
使用PNA14的生長測定如下進行測定將對應于105、104、103、102、和101個細胞/ml且所含PNA14終濃度為1.3、1.4、和1.5μM的測試培養物稀釋物于37℃、恒速搖動保溫16小時。在含104-101個細胞/ml且PNA濃度為至少1.4μM的培養物中能夠看到完全抑制(表2)。實施例10使用針對LacZ基因的PNA的細菌生長抑制肽是KFF基元的截短形式。基礎肽序列是KFFKFFKFFK(SEQ ID NO148)(PNA1)。PNA2、3、4、5、6、7、8、9、10、和11都包含從C末端截短的肽。PNA 84、85、86、87、88、89、90、91、和92都包含從N末端截短的肽。合成了含和不含氨基末端賴氨酸的針對LacZ基因的PNA。
如下進行測定將對應于5×105和5×104個細胞/ml且所含針對LacZ基因的PNA的KFF基元截短形式終濃度為100、300、750、和1500nM的測試培養物大腸桿菌K12稀釋物在含乳糖作為唯一碳源的M9基本培養基(基本培養基9，Bie&Berntsen Cph)中于37℃、恒定搖動保溫16小時。
在含5×104-105個細胞/ml且PNA濃度為至少300nM的培養物中能夠看到完全抑制(表3)。結果顯示，基礎KFF基元10聚體及其截短肽(4、5、6、和9聚體)可用于增強PNA的抑制效果。
表1使用PNA26的細菌生長抑制；大腸桿菌K12在10％ Mueller-Hinton肉湯中。+完全抑制細菌生長(+)顯著延長停滯期(超過5倍)-停滯期延長不足5倍nd未進行
表2使用PNA14的細菌生長抑制；大腸桿菌K12在10％ Mueller-Hinton肉湯中。+完全抑制細菌生長(+)顯著延長停滯期(超過5倍)-停滯期延長不足5倍nd未進行
表3+完全抑制細菌生長(+)顯著延長停滯期(超過5倍)-停滯期延長不足5倍Nd未進行實施例11使用針對大腸桿菌infA基因的PNA的細菌生長抑制(序列如PNA 130)合成了含作為截短型KFF基元的肽的針對infA基因的PNA 130和218-226。使用PNA130的生長測定如下進行測定將對應于2×104和4×104個細胞/ml且所含針對infA基因的PNA的KFF基元截短形式終濃度為200、400、600、800、和1000nM的測試培養物大腸桿菌K12稀釋物在10％ Mueller-Hinton肉湯中于37℃、恒速搖動保溫16小時。
在含4×104-2×104個細胞/ml且PNA濃度為至少600nM的培養物中能夠看到完全抑制(表4)。結果顯示，基礎KFF基元10聚體及其截短肽(6和9聚體)可用于增強PNA的抑制效果。實施例12使用針對核糖體RNAα-次黃嘌呤環的PNA的細菌生長抑制合成了含作為截短型KFF基元的肽的針對核糖體RNAα-次黃嘌呤環的PNA 140-146。生長測定如下進行測定將對應于5×105和5×104個細胞/ml且所含針對核糖體RNAα-次黃嘌呤環的PNA的KFF基元截短形式終濃度為200、400、600、800、和1000nM的測試培養物大腸桿菌K12稀釋物在10％ Mueller-Hinton肉湯中于37℃、恒速搖動保溫16小時。
在含5×105-5×104個細胞/ml且PNA濃度為至少200nM的培養物中能夠看到完全抑制(表5)。結果顯示，基礎KFF基元10聚體及其包含至少3個氨基酸的截短肽可用于增強PNA的抑制效果。實施例13使用針對大腸桿菌K12的FtsZ基因的PNA的細菌生長抑制使用PNA 170-179和109的生長測定如下進行測定將對應于700和350個細胞/ml且所含針對FtsZ基因的PNA的帶smcc接頭的兩親性10、11、和12聚體結構變體終濃度為200、300、400、500、600、800、和1000nM的測試培養物大腸桿菌K12稀釋物在100％Mueller-Hinton肉湯中于37℃、恒速搖動保溫16小時。
在含350-700個細胞/ml且PNA濃度為至少300nM的培養物中能夠看到完全抑制(表6)。在比較109與179時，smcc接頭似乎為分子添加了一些優勢。另外，序列174顯示有希望的結果。
表4+完全抑制細菌生長(+)顯著延長停滯期(超過5倍)-停滯期延長不足5倍nd未進行
表5+完全抑制細菌生長(+)顯著延長停滯期(超過5倍)-停滯期延長不足5倍nd未進行
表6+完全抑制細菌生長(+)顯著延長停滯期(超過5倍)-停滯期延長不足5倍nd未進行實施例14使用含不同種類的接頭和肽的針對大腸桿菌IF-1編碼基因的PNA的細菌生長抑制大腸桿菌K12在100％ Mueller-Hinton肉湯中。
對于該設置中的7種PNA，核堿基序列與PNA130中的序列是相同的，但是連接基團和肽是不同的。
實驗設置對應于實施例13中描述的設置。
由表7a和7b能夠看出，PNA與肽的當前組合中，smcc-ado接頭似乎是在含1.6×103-8×102個細胞/ml且PNA濃度為至少600nM的培養物中顯示完全生長抑制的優越接頭。實施例15使用9聚體肽的細菌生長抑制為了測試不含PNA的肽的效果，向10％和100％ Mueller-Hinton肉湯培養基中的大腸桿菌K12中加入序列為H-KFFKFFKFF-OH(SEQ IDNO1)的肽編號2339。肽編號2339的生長測定如下進行測定將對應于105、104、和103個細胞/ml且所含肽編號2339終濃度為100-20,000nM的測試培養物稀釋物于37℃、恒速搖動保溫16小時。在含7.9×103個細胞/ml且肽濃度為至少20,000nM的培養物中能夠看到完全抑制，在由5000nM開始的濃度中能夠檢測到生長抑制的最小信號(10％培養基表8；100％培養基表9)。結論單獨的肽是有活性的，但是只在很高的濃度而且超過用于PNA生長測定的范圍。實施例16使用9聚體肽和無義PNA的細菌生長抑制一起使用肽編號2339與無義PNA136的生長測定如下進行測定將對應于105、104、和103個細胞/ml且只含PNA136或含等量PNA136與肽編號2339(終濃度400-1000nM)的測試培養物稀釋物于37℃、恒速搖動保溫16小時。在任何濃度都沒有檢測到生長抑制(表10)。結論無義PNA在選擇的范圍內沒有活性。
表7a來自100％MH的數據+完全抑制細菌生長(+)顯著延長停滯期(超過5倍)-停滯期延長不足5倍nd未進行
表7b來自10％ MH的數據+完全抑制細菌生長；(+)顯著延長停滯期(超過5倍)；-停滯期延長不足5倍；nd未進行
表8+完全抑制細菌生長(+)顯著延長停滯期(超過5倍)((+))停滯期延長不足5倍，但仍對生長曲線有影響-停滯期延長不足5倍nd未進行
表9+完全抑制細菌生長(+)顯著延長停滯期(超過5倍)((+))停滯期延長不足5倍，但仍對生長曲線有影響-停滯期延長不足5倍nd未進行
表10+完全抑制細菌生長(+)顯著延長停滯期(超過5倍)((+))停滯期延長不足5倍，但仍對生長曲線有影響-停滯期延長不足5倍nd未進行實施例17針對大腸桿菌FtsZ編碼基因的PNA(不含肽)與肽的細菌生長抑制大腸桿菌K12在100％ Mueller-Hinton肉湯中。
PNA249與PNA109相同，不含肽但含ado接頭。
PNA250的肽序列是H-CG-KLAKALKKLL-NH2(SEQ ID NO156)。該肽還用于PNA174。
在含PNA與肽二者的孔中，PNA與肽的量相同。
在表11中能夠看出，在低濃度端單獨使用249或250或者一起使用249與250都不顯示任何有用效果。只有在高于2500nM的濃度單獨使用肽可顯示生長抑制效果。實施例18針對大腸桿菌IF-1編碼基因的PNA的細菌生長抑制大腸桿菌K12在10％ Mueller-Hinton肉湯中。肽是KFF基元位于PNA的C端或N端的形式。
由表12能夠看出，肽的取向并非那么重要。然而，對于PNA與肽的特定組合，可能優選一種取向。

表11+完全抑制細菌生長(+)顯著延長停滯期(超過5倍)-停滯期延長不足5倍nd未進行
表12+完全抑制細菌生長(+)顯著延長停滯期(超過5倍)-停滯期延長不足5倍nd未進行實施例19對核糖體α-次黃嘌呤環具有特異性的PNA-肽的細菌生長抑制為了顯示本發明可用于處理許多微生物，在與實施例12相同的測定條件下處理挑選的革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌。所用經修飾PNA分子是PNA146。
結論所有細菌分離菌都受到了抑制。通過使用與測試大腸桿菌K12相同的測定條件，我們證明了對不同革蘭氏陰性生物體和革蘭氏陽性生物體的生長抑制。實施例20肽-PNA嵌合物的制備以與實施例1相同的方式，制備肽-PNA嵌合物H2N-SILAPLGTTLVKKVATTLKKIFSKWKC-smcc-Ado-TTCTAACATTTA-NH2(SEQID NO159)。實施例21基因靶選擇和PNA的細菌生長抑制a.在糞腸球菌/屎腸球菌中的基因靶選擇注解屎腸球菌基因組(與250種其它基因組一起)可以由Integrated Genomics(芝加哥)購買。
來自兩種生物體的單個注解基因也可以由Genbank獲得。
b.體外實驗通過依照NCCLS指南使用微量稀釋肉湯法(使用100％ Mueller-Hinton肉湯)的使用來測量PNA綴合物抑制細菌生長的能力。
用新鮮且預熱的培養基稀釋屎腸球菌的對數期培養物，并調至確定的OD(在此光密度位于600nm)，使終濃度達到1×104個細菌/ml培養基，每個孔分裝195μl細菌培養物。向每個孔的細菌培養物中加入PNA，終濃度范圍450nm-1500nM。將盤(如Costar # 3474)在自動分析儀(96孔微量滴定形式；PowerWavex，software KC4.Kebo.Lab，哥本哈根)中于35℃搖動保溫16小時，并在保溫過程中以較短時間間隔測量600nm的光密度以記錄生長曲線。測試所有培養物以檢測污染。
MIC和MBC另外，進行實驗以評價PNA的MIC(最小抑制濃度)與MBC(最小殺菌濃度)之間的關系。
研究是在來自美國典型培養物保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)的3種屎腸球菌菌株上進行的。這些菌株作為來自已知體內選擇萬古霉素抗性機制的可能干涉的最初指示劑。下表概述了菌株特征。
實驗設置如先前所述檢測MIC。將盤于35℃繼續保溫24小時以分析受抑制細菌的再生長(MBC)。
來自實施例20的PNA綴合物細菌菌株8803、51550、700221孔中的PNA濃度400、800、和1600nM結果PNA綴合物的最小抑制濃度(MIC)如下
實施例22肽-PNA嵌合物的制備以與實施例1相同的方式，制備肽-PNA嵌合物H2N-KKFKVKFVVKKC-smcc-Ado-ACTTTGTCGCCC-NH2(SEQ ID NO160)。實施例23基因靶選擇和PNA的細菌生長抑制已經在金黃色葡萄球菌NCTC 8325上進行了潛在基因靶的選擇和隨后PNA構建物的測試。該菌株是由俄克拉荷馬大學健康科學中心微生物學和免疫學部(University of Oklahoma Health Sciences Center，Department of Microbiology and Immunology)J.Landolo教授處獲得的。俄克拉荷馬大學的基因組技術高級中心(University ofOklahoma’s Advanced Center for Genome Technology，OU-ACGT)的金黃色葡萄球菌基因組測序計劃正在對金黃色葡萄球菌NCTC 8325進行測序。
基因組尚未完全測序。基因組大小是2.80Mb，其中合計2,581,379bp已經測序。可以由Genbank獲得許多注解基因序列作為推定靶。
a.靶選擇方法所用基本方法與先前的實施例相似。由OU-ACGT未完成的金黃色葡萄球菌基因組序列和Genbank找到潛在靶基因。使用位于NCBI(國家生物技術信息中心National Centre for Biotechnology Information)萬維網BLAST服務器上的BLAST2.0程序來測試細菌基因組中同源基因和靶基因的存在。
將在實施例22中制備的抗菌PNA綴合物用于下列實驗b.體外實驗通過依照NCCLS指南的微量稀釋肉湯法(使用100％ Mueller-Hinton肉湯)的使用來測量PNA抑制細菌生長的能力。
用新鮮且預熱的培養基稀釋金黃色葡萄球菌的對數期培養物，并調至確定的OD(在這里光密度位于600nm)，使終濃度達到1×104個細菌/ml培養基，每個孔分裝195μl細菌培養物。向每個孔的細菌培養物中加入PNA，終濃度范圍450nm-1500nM。將盤(如Costar # 3474)在自動分析儀(96孔微量滴定形式；PowerWavex，softwareKC4.Kebo.Lab，哥本哈根)中于35℃搖動保溫16小時，并在保溫過程中以較短時間間隔測量600nm的光密度以記錄生長曲線。測試所有培養物以檢測污染。
MIC和MBC另外，進行實驗以評價PNA的MIC(最小抑制濃度)與MBC(最小殺菌濃度)之間的關系。
研究是在由俄克拉荷馬大學健康科學中心微生物學和免疫學部(University of Oklahoma Health Sciences Center，Department ofMicrobiology and Immunology)J.Landolo教授處獲得的金黃色葡萄球菌NCTC 8325菌株上進行的。另外，我們包括了來自美國典型培養物保藏中心的2種萬古霉素抗性金黃色葡萄球菌分離菌。這些菌株作為來自已知體內選擇萬古霉素抗性機制的可能干涉的最初指示劑。下表概述了菌株特征。
實驗設置如上文所述檢測MIC。將盤于35℃繼續保溫24小時以分析受抑制細菌的再生長(MBC)。
來自實施例22的PNA綴合物細菌菌株8325、700698、700698R孔中的PNA濃度400、800、和1600nM結果最小抑制濃度(MIC)如下
實施例24依照N.Frimodt-Moller描述的測試方法，對本發明的化合物測試體內抗菌效果。
未處理動物形成感染的爆發性臨床體征。在所有時間點，本發明的化合物相對于未處理對照遏制大腸桿菌cfu/ml，而且像兩種陽性對照一樣有效。
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權利要求
1.式(III)的經修飾寡核苷酸，肽-L-Oligon (III)其中L是接頭或鍵，肽是任何氨基酸序列，且Oligon指寡核苷酸或其類似物。
2.權利要求1的化合物，其中Oligon是鎖定核苷類似物(LNA)或其核苷酸類似物與嗎啉代主鏈的寡聚物。
3.式(I)的經修飾PNA分子，及其制藥學可接受鹽類，肽-L-PNA (I)其中L是接頭或鍵，肽是任何氨基酸序列，且PNA是肽核酸。
4.具有下式(I)的經修飾肽核酸(PNA)分子，及其制藥學可接受鹽類肽-L-PNA (I)其中L是接頭或鍵，PNA是肽核酸序列，且肽是陽離子肽或肽類似物或功能相似部分，肽或肽類似物具有通式(II)C-(B-A)n-D (II)，其中A由1-8個不帶電荷的氨基酸和/或氨基酸類似物構成，B由1-3個帶正電荷的氨基酸和/或氨基酸類似物構成，C由0-4個不帶電荷的氨基酸和/或氨基酸類似物構成，D由0-3個帶正電荷的氨基酸和/或氨基酸類似物構成，n是1-10，且氨基酸和/或氨基酸類似物的總數是3-20個。
5.權利要求1-4之任一項的經修飾寡核苷酸或PNA分子，其中L是包含一個或多個-ado-(8-氨基-3，6-二氧雜辛酸)、-smcc-(4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺基酯)、-ahex-或-aha-(6-氨基-己酸)、4-氨基丁酸、4-氨基環己基羧酸、-lcsmcc-(琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-羧基-(6-酰氨基-己酸酯))、-mbs-(間-馬來酰亞胺基苯甲酸琥珀酰亞胺基酯)、-emcs-(N-ε-馬來酰亞胺基-己酸琥珀酰亞胺基酯)、-smph-(6-(β-馬來酰亞胺基-丙酰胺基)己酸琥珀酰亞胺酯)、-amas-(琥珀酰亞胺基N-(α-馬來酰亞胺基乙酸酯))、-smpb-(4-(對-馬來酰亞胺基苯基)丁酸琥珀酰亞胺基酯)、-β.ala-(β-丙氨酸)、-phg-(苯甘氨酸)、-achc-(4-氨基環己酸)、-β.cypr-(β-(環丙基)丙氨酸)、和-adc-(氨基十二烷酸)或其任意組合的接頭。
6.權利要求5的經修飾寡核苷酸或PNA分子，其中連接基團是-β.ala-連接基團或-ado-連接基團與權利要求5定義的任何其它連接基團的組合。
7.權利要求6的經修飾寡核苷酸或PNA分子，其中連接基團是選自下組的組合-achc-β.ala-、-achc-ado-、-lcsmcc-β.ala-、-mbs-β.ala-、-emcs-β.ala-、-lcsmcc-ado-、-mbs-ado-、-emcs-ado-、或-smph-ado-。
8.權利要求4-7的經修飾PNA分子，其中A由1-6個不帶電荷的氨基酸和/或氨基酸類似物構成，且B由1或2個帶正電荷的氨基酸和/或氨基酸類似物構成。
9.權利要求8的經修飾PNA分子，其中A由1-4個不帶電荷的氨基酸和/或氨基酸類似物構成，且B由1或2個帶正電荷的氨基酸和/或氨基酸類似物構成。
10.權利要求4-9之任一項的經修飾PNA分子，其中帶正電荷的氨基酸和氨基酸類似物選自賴氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg，R)、二氨基丁酸(DAB)、和鳥氨酸(Orn)。
11.權利要求4-10之任一項的經修飾PNA分子，其中不帶電荷的氨基酸和氨基酸類似物選自Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Met、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln、和非天然發生的氨基酸2-氨基丁酸、β-環己基丙氨酸、4-氯苯基丙氨酸、正亮氨酸、和苯甘氨酸。
12 權利要求4-11的經修飾PNA分子，其中不帶電荷的氨基酸選自Ala，Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Met、和非天然發生的非極性氨基酸β-環己基丙氨酸、4-氯苯基丙氨酸、和正亮氨酸。
13.任一上述權利要求的經修飾寡核苷酸或PNA分子，其中肽中氨基酸的總數是15個或更少，優選12個或更少，更優選10個或更少。
14.任一上述權利要求的經修飾寡核苷酸或PNA分子，其中肽選自(KFF)3K(SEQ ID NO161)及其包含至少3個氨基酸的亞基，優選(KFF)3(SEQ ID NO1)。
15.任一上述權利要求的經修飾寡核苷酸或PNA分子，其中肽選自FFRFFRFFR(SEQ ID NO6)、LLKLLKLLK(SEQ ID NO7)、LLRLLRLLR(SEQ ID NO8)、LLKKLAKAL(SEQ ID NO9)、KFKVKFVVKK(SEQID NO11)、LLKLLLKLLLK(SEQ ID NO12)、LLKKLAKALK(SEQ IDNO13)、RRLFPWWWPFRRVC(SEQ ID NO14)、GRRWPWWPWKWPLIC(SEQID NO15)、LVKKVATTLKKIFSKWKC(SEQ ID NO16)、KKFKVKFVVKKC(SEQ ID NO17)及其包含至少3個氨基酸且其中至少一個氨基酸是帶正電荷的氨基酸的任何亞基。
16.選自下組的經修飾PNA分子H-KFFKFFKFFK-ado-CAT AGC TGT TTC-NH2(SEQ ID NO24)，H-FFKFFKFFK-ado-CAT AGC TGT TTC-NH2(SEQ ID NO25)，H-FKFFKFFK-ado-CAT AGC TGT TTC-NH2(SEQ ID NO26)，H-KFFKFFK-ado-CAT AGC TGT TTC-NH2(SEQ ID NO27)，H-FFKFFK-ado-CAT AGC TGT TTC-NH2(SEQ ID NO28)，H-FKFFK-ado-CAT AGC TGT TTC-NH2(SEQ ID NO29)，H-KFFK-ado-CAT AGC TGT TTC-NH2(SEQ ID NO30)，H-FFK-ado-CAT AGC TGT TTC-NH2(SEQ ID NO31)，H-FK-ado-CAT AGC TGT TTC-NH2(SEQ ID NO32)，H-K-ado-CAT AGC TGT TTC-NH2(SEQ ID NO33)，H-ado-CAT AGC TGT TTC-NH2(SEQ ID NO34)，H-KFFKFFKFF-ado-CAT AGC TGT TTC-NH2(SEQ ID NO35)，H-FFKFFKFF-ado-CAT AGC TGT TTC-NH2(SEQ ID NO36)，H-FKFFKFF-ado-CAT AGC TGT TTC-NH2(SEQ ID NO37)，H-KFFKFF-ado-CAT AGC TGT TTC-NH2(SEQ ID NO38)，H-FFKFF-ado-CAT AGC TGT TTC-NH2(SEQ ID NO39)，H-FKFF-ado-CAT AGC TGT TTC-NH2(SEQ ID NO40)，H-KFF-ado-CAT AGC TGT TTC-NH2(SEQ ID NO41)，H-FF-ado-CAT AGC TGT TTC-NH2(SEQ ID NO42)，H-F-ado-CAT AGC TGT TTC-NH2(SEQ ID NO43)，H-KFFKFFKFFK-ado-TTC AAA CAT AGT-NH2(SEQ ID NO18)，H-KFFKFFKFFK-ado-TGA CTA GAT GAG-NH2(SEQ ID NO44)，H-KFFKFFKFFK-ado-CCA TCT AAT CCT-NH2(SEQ ID NO45)，H-FFKFFKFFK-GGC-smcc-ado-TTC AAA CAT AGT-NH2(SEQ ID NO53)，H-FFRFFRFFR-GGC-smcc-ado-TTC AAA CAT AGT-NH2(SEQ ID NO54)，H-LLKLLKLLK-GGC-smcc-ado-TTC AAA CAT AGT-NH2(SEQ ID NO55)，H-LLRLLRLLR-GGC-smcc-ado-TTC AAA CAT AGT-NH2(SEQ ID NO56)，H-LLKKLAKALK-GC-smcc-ado-TTC AAA CAT AGT-NH2(SEQ ID NO57)，H-KRRWPWWPWKK-C-smcc-ado-TTC AAA CAT AGT-NH2(SEQ ID NO58)，H-KFKVKFVVKK-GC-smcc-ado-TTC AAA CAT AGT-NH2(SEQ ID NO59)，H-LLKLLLKLLLK-C-smcc-ado-TTC AAA CAT AGT-NH2(SEQ ID NO60)，H-FFKFFKFFK-GGC-smcc-ado-TTC AAA CAT AGT-NH2(SEQ ID NO61)，H-KFFKFFKFFK-C-smcc-ado-TTC AAA CAT AGT-NH2(SEQ ID NO62)，H-F-ado-CCA TCT AAT CCT-NH2(SEQ ID NO63)，H-FF-ado-CCA TCT AAT CCT-NH2(SEQ ID NO64)，H-KFF-ado-CCA TCT AAT CCT-NH2(SEQ ID NO65)，H-FKFF-ado-CCA TCT AAT CCT-NH2(SEQ ID NO66)，H-FFKFF-ado-CCA TCT AAT CCT-NH2(SEQ ID NO67)，H-KFFKFF-ado-CCA TCT AAT CCT-NH2(SEQ ID NO68)，H-FKFFKFF-ado-CCA TCT AAT CCT-NH2(SEQ ID NO69)，H-FFKFFKFF-ado-CCA TCT AAT CCT-NH2(SEQ ID NO70)，H-KFFKFFKFF-ado-CCA TCT AAT CCT-NH2(SEQ ID NO71)，H-LLKKLAKALKG-ahex-ado-CCA TCT AAT CCT-NH2(SEQ ID NO21)，H-LLKKLAKALKG-ado-ado-CCA TCT AAT CCT-NH2(SEQ ID NO72)，H-KFFKFFKFFK-ado-ado-CCA TCT AAT CCT-NH2(SEQ ID NO73)，H-KFFKFFKFFK-ahex-ado-CCA TCT AAT CCT-NH2(SEQ ID NO74)，H2N-KFFKFFKFFK-C-smcc-ado-CCA TCT AAT CCT-NH2(SEQ ID NO75)，H2N-LLKKLAKALK-GC-smcc-ado-CCA TCT AAT CCT-NH2(SEQ ID NO76)，H2N-KFFKFF-C-smcc-ado-CCA TCT AAT CCT-NH2(SEQ ID NO77)，H-ado-TTC AAA CAT AGT-NH2(SEQ ID NO78)，H2N-KFFKVKFVVKK-C-smcc-ado-TTC AAA CAT AGT-NH2(SEQ ID NO79)，H2N-KFFKVKFVVKK-C-smcc-ado-TTG TGC CCC GTC-NH2(SEQ ID NO80)，H2N-KKFKVKFVVKKC-achc-β.ala-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO81)，H-KFFKFFKFFK-achc-β.ala-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO82)，H2N-KKFKVKFVVKKC-lcsmcc-ado-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO83)，H2N-KKFKVKFVVKKC-mbs-ado-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO84)，H2N-KKFKVKFVVKKC-e mcs-ado-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO85)，H2N-KKFKVKFVVKKC-smph-ado-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO86)，H2N-KKFKVKFVVKKC-amas-ado-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO87)，H2N-KKFKVKFVVKKC-smpb-ado-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO88)，H2N-KKFKVKFVVKKC-lcsmcc-gly-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO89)，H2N-KKFKVKFVVKKC-lcsmcc-β.ala-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO90)，H2N-KKFKVKFVVKKC-lcsmcc-β.cypr-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO91)，H2N-KKFKVKFVVKKC-lcsmcc-aha-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO92)，H2N-KKFKVKFVVKKC-lcsmcc-adc-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO93)，H-KFFKFFKFFK-ado-ado-TTCAAACATAGT-NH2(SEQID NO94)，H-KFFKFFKFFK-ado-Gly-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO95)，H-KFFKFFKFFK-ado-P-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO96)，H-KFFKFFKFFK-ado-aha-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO97)，H-KFFKFFKFFK-ado-β.ala-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO98)，H-KFFKFFKFFK-ado-achc-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO99)，H-KFFKFFKFFK-Gly-ado-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO100)，H-KFFKFFKFFK-Gly-Gly-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO101)，H-KFFKFFKFFK-Gly-P-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO102)，H-KFFKFFKFFK-Gly-aha-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO103)，H-KFFKFFKFFK-Gly-β.ala-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO104)，H-KFFKFFKFFK-Gly-achc-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO105)，H-KFFKFFKFFK-P-ado-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NQ106)，H-KFFKFFKFFK-P-Gly-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO107)，H-KFFKFFKFFK-P-P-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO108)，H-KFFKFFKFFK-P-aha-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO109)，H-KFFKFFKFFK-P-β.ala-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO110)，H-KFFKFFKFFK-P-achc-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO111)，H-KFFKFFKFFK-aha-ado-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO112)，H-KFFKFFKFFK-aha-Gly-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO113)，H-KFFKFFKFFK-aha-P-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO114)，H-KFFKFFKFFK-aha-aha-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO115)，H-KFFKFFKFFK-aha-β.ala-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO116)，H-KFFKFFKFFK-aha-achc-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO117)，H-KFFKFFKFFK-β.ala-ado-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO118)，H-KFFKFFKFFK-β.ala-Gly-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO119)，H-KFFKFFKFFK-β.ala-P-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO120)，H-KFFKFFKFFK-β.ala-aha-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO121)，H-KFFKFFKFFK-β.ala-β.ala-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO122)H-KFFKFFKFFK-β.ala-achc-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO123)，H-KFFKFFKFFK-P-P-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO124)，H-KFFKFFKFFK-P-P-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO125)，H-KFFKFFKFFK-K-K-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO126)，H-KFFKFFKFFK-F-F-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO127)，H-KFFKFFKFFK-F-K-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO128)，H-KFFKFFKFFK-K-F-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO129)，H-KFFKFFKFFK-phg-ado-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO130)，H-KFFKFFKFFK-phg-Gly-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO131)，H-KFFKFFKFFK-phg-P-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO132)，H-KFFKFFKFFK-phg-aha-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO133)，H-KFFKFFKFFK-phg-β.ala-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO134)，H-KFFKFFKFFK-phg-achc-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO135)，H-KFFKFFKFFK-achc-ado-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO136)，H-KFFKFFKFFK-achc-Gly-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO137)，H-KFFKFFKFFK-achc-P-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO138)，H-KFFKFFKFFK-achc-aha-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO139)，H-KFFKFFKFFK-achc-β.ala-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO140)或H-KFFKFFKFFK-achc-achc-TTCAAACATAGT-NH2(SEQ ID NO141)其中連接基團如權利要求5中所定義。
17.權利要求3-16之任一項的經修飾PNA分子，其中PNA序列與細菌中的至少一個核苷酸序列互補。
18.權利要求17的經修飾PNA分子，其中所述核苷酸序列是核糖體RNA、信使RNA或DNA序列。
19.權利要求3-18之任一項的經修飾PNA分子，其中PNA序列的取向是平行或反向平行。
20.權利要求17-19之任一項的經修飾PNA分子，其中所述核苷酸序列的功能是細菌生長或存活所必需的，而且所述功能被PNA序列所阻斷。
21.權利要求1-20之任一項的經修飾PNA分子或經修飾寡核苷酸用于治療傳染性疾病或給無生命物品消毒。
22.權利要求1-20之任一項的經修飾PNA分子或經修飾寡核苷酸在制造用于治療傳染性疾病的藥物中的用途。
23.權利要求1-20之任一項的經修飾PNA分子或經修飾寡核苷酸在制造用于治療或預防細菌感染的組合物中的用途。
24.用于治療或預防細菌生長或存活的組合物，包含權利要求1-20之任一項的經修飾PNA分子或經修飾寡核苷酸。
25.權利要求24的組合物，還包含抗生素。
26.權利要求24或25的組合物，包含兩種或多種權利要求3-20的經修飾PNA分子。
27.用于治療傳染性疾病的方法，包括對需要的患者施用有效量的權利要求1-20的經修飾PNA分子或經修飾寡核苷酸或者權利要求24-26之任一項的組合物。
28.用于給無生命物品消毒的方法，包括對所述無生命物品施用有效量的一或多種權利要求1-20的經修飾PNA分子或經修飾寡核苷酸或者權利要求24-26之任一項的組合物。
29.權利要求28的方法，其中所述物品選自手術工具、醫院設備、牙科工具、屠宰場設備和工具、牛奶場設備和工具等。
30.權利要求3-20之任一項的經修飾PNA分子在鑒定可有效阻斷細菌必需功能的PNA序列中的用途，其中將不同的PNA序列摻入經修飾PNA分子并測試它們抑制或降低細菌生長的能力。
31.可用于抑制或降低一種或多種細菌生長的PNA序列的鑒定方法，包括將包含不同PNA序列的權利要求3-20之任一項的經修飾PNA分子與一種或多種選定細菌混合，選擇的PNA序列使其與每種選定細菌的至少一個核苷酸序列互補，并鑒定有效抑制或降低所述一種或多種細菌生長的PNA序列。
32.權利要求4-20的分子，其中PNA序列包含5-20個核堿基，特別是7-15個核堿基，最特別的是8-12個核堿基。
33.選自下組的經修飾PNA分子H-KFFKFFKFF-ado-JTJTJJT-ado-ado-ado-TCCCTCTC-Lys-NH2(SEQ ID NO22)，H-KFF-ado-JTJTJJT-ado-ado-ado-TCC TCT C-Lys-NH2(SEQ ID NO46)，H-FKFF-ado-JTJTJJT-ado-ado-ado-TCC TCT C-Lys-NH2(SEQ ID NO47)，H-FFKFF-ado-JTJTJJT-ado-ado-ado-TCC TCT C-Lys-NH2(SEQ ID NO48)，H-KFFKFF-ado-JTJTJJT-ado-ado-ado-TCC TCT C-Lys-NH2(SEQ ID NO49)，H-FKFFKFF-ado-JTJTJJT-ado-ado-ado-TCC TCT C-Lys-NH2(SEQ ID NO50)，H-FFKFFKFF-ado-JTJTJJT-ado-ado-ado-TCC TCT C-Lys-NH2(SEQ ID NO51)orH-KFFKFFKFF-ado-JTJTJJT-ado-ado-ado-TCC TCT C-Lys-NH2(SEQ IDNO52)其中連接基團如權利要求5中所定義。
全文摘要
本發明涉及用于抗擊傳染性微生物(特別是細菌)的新型藥物。更具體的說,本發明涉及肽核酸(PNA)序列,它們通過使陽離子肽綴合PNA而進行了修飾,從而獲得抗感染特性增強的新型PNA分子。
文檔編號A61K31/7125GK1387567SQ00815281
公開日2002年12月25日 申請日期2000年10月13日 優先權日1999年10月13日
發明者P·E·尼爾森, L·古德, H·F·漢森, F·貝克, L·馬利克, C·施奧, M·威森巴克, B·K·格維克曼 申請人:潘特科有限公司