專利名稱：Baff,其封閉劑以及它們在b細胞應答的調節中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及配體BAFF及其封閉劑刺激或抑制B-細胞和免疫球蛋白表達的用途，所述BAFF是屬于腫瘤壞死因子家族的B-細胞活化因子。該蛋白質及其受體具有抗癌和/或免疫調節作用，并且可用于治療免疫抑制疾病，如HIV。特別是，該配體及其封閉劑可對高血壓及其相關疾病的發展起作用。另外，可在基因治療中使用被該配體的基因轉染的細胞來治療涉及B-細胞的腫瘤，自身免疫病或先天性遺傳病。封閉劑，例如特異于該配體或其受體的重組變體或抗體也具有免疫調節作用。希望將BAFF用作免疫抑制疾病的B-細胞刺激劑，包括例如用于經受器官移植(即骨髓移植)以及從癌癥治療中恢復的患者以刺激B-細胞的產生。也希望將BAFF用作佐劑和/或共刺激劑以將B細胞水平升高或恢復至大致正常的水平。
背景技術：
與腫瘤壞死因子(TNF)-相關的細胞因子是宿主防御和免疫調節的媒介。該家族的成員以膜-錨著的形式存在，局部通過細胞與細胞的接觸發揮作用，或者作為能擴散至遠處靶的分泌型蛋白起作用。平行的受體家族發出存在這些分子的信號，導致啟動靶組織中的細胞死亡或細胞增殖和分化。目前，TNF家族的配體和受體有至少11對公認的受體-配體對，包括TNFTNF-R；LT-αTNF-R；LT-α/βLT-β-R；FasLFas；CD40LCD40；CD30LCD30；CD27LCD27；OX40LOX40和4-1BBL4-1BB。甚至在最相關的情況下，編碼這些配體的DNA序列僅有約25％至約30％同一性，但氨基酸的相關性約為50％。
該細胞因子受體家族的確定特征體現在富含半胱氨酸的胞外結構域，其最初由兩種不同的TNF受體的分子克隆揭示出。該基因家族編碼I型跨膜蛋白質所特有的糖蛋白，其具有胞外配體結合結構域，單個膜跨越區域和參與活化細胞功能的胞質區域。富含半胱氨酸的配體結合區域呈現出緊密交織的二硫鍵連接的核心結構域，該結構域根據特定的家族成員而重復多次。大多數受體具有4個結構域，但也有的受體具有少至3個，或多至6個結構域。
TNF家族配體蛋白質的特征在于一段短的N-末端序列，它一般是短的親水性氨基酸，經常含有幾個據認為可用作終止轉移序列的賴氨酸或精氨酸殘基。緊接著的是跨膜區域和各種長度的胞外區域，其可將C-末端受體結合結構域與膜分開。該區域有時也被稱為“莖”。C-末端結合區域含有該蛋白質的主要部分，并經常，但不總是含有糖基化位點。這些基因缺乏I型膜蛋白，具有位于細胞外部的C末端的II型膜蛋白，和位于胞質中的短的N-末端結構域所特有的典型的信號序列。在某些情況下，例如對TNF和LT-α而言，在蛋白質加工早期可發生莖區域中的裂解，然后發現配體主要為分泌形式。然而，大多數配體以膜形式存在，可介導局部的信號傳導。
對TNF，LT-α和CD40L的晶體學分析已較好地確定了這些配體的結構。TNF和淋巴毒素-α(LT-α)均為夾心結構，有兩個具有“果凍卷筒蛋糕(jellyroll)”或希臘鑰匙(Greek key)拓撲結構的反-平行β-折疊。Cα和β殘基之間的rms偏差是0.61C，暗示它們的分子拓撲圖具有高水平的相似性。CD40L，TNF和LT-α的分子研究所闡明的結構特征是傾向于裝配成寡聚體復合物。寡聚體結構的內在特征是在產生多價配體的相鄰亞單位之間的連接處形成受體結合位點。通過分析其晶體結構，證實TNF，CD40L和LT-α的四級結構以三聚體的形式存在。在不同配體之間保守的氨基酸大多為支架型β-片層鏈。很可能在所有這些分子中保留了所述基本夾心結構，因為多個家族成員之間的這些支架序列部分是保守的。由于亞單位構象傾向于保持相似，因此，也可以維持四級結構。
對TNF家族成員的最好描述是，其為控制細胞存活和分化的免疫系統的主開關。與其它占優勢的TNF家族膜錨著成員相反，目前只知TNF和LT-α是分泌型細胞因子。盡管已明確鑒定了TNF的膜形式，而且所述膜形式很可能具有獨特的生物學作用，但分泌形式的TNF可為距離觸發事件位點更遠的細胞提供一般性的警示信號。因此，TNF分泌可以放大導致血管系統內層明確改變和細胞炎性狀態的事件。與之相反，該家族的膜結合成員通過TNF型受體僅給直接接觸的細胞發送信號。例如，T細胞僅給那些經由同族TCR相互作用直接接觸的B細胞提供CD40介導的“幫助”。在研究得較為充分的Fas系統中也存在類似的細胞-細胞接觸對誘導細胞死亡之能力的限制。
根據TNF配體導致細胞死亡的能力，似乎可以將它們分成三組。首先，TNF，Fas配體和TRAIL可在很多細胞系中有效誘導細胞死亡，它們的受體很可能具有典型的致死結構域。據推測，DR-3的配體(TRAMP/WSL-1)可能都屬于這一類。其次，另一類配體僅觸發局限于少數細胞類型的較弱死亡信號，此類配體的例子有TWEAK，CD30配體和LTalb2。該組配體如何在缺乏典型致死結構域的情況下觸發細胞死亡是一個有趣的問題，這暗示著存在另一個較弱的死亡信號傳導機制。最后，有一些成員不能有效傳遞死亡信號。可能所有組別的TNF配體對一些細胞類型都有抗增殖效應，繼而導致細胞分化，如CD40。Funakoshi等(1994)。
近年來，TNF家族顯著壯大，包括至少11種參與免疫系統調節的不同信號傳導途徑。TWEAK和TRAIL的廣泛表達模式表明該家族中仍有更具功能性的品種未被發現。最近，這一方面尤其引人注意，因為發現了有能影響rous肉瘤和單純皰疹病毒復制能力的兩種受體，還通過組織學觀察TNF具有抗病毒活性，痘病毒編碼誘騙型TNF受體。Brojatsch等(1996)；Montgomery等(1996)；Smith等(1994)，76細胞959-962；Vassalli等(1992)，10，免疫，411-452。
TNF是敗血性休克和惡病質的媒介，并且參與調節造血細胞發育。它可以用作炎癥以及抗細菌，病毒和寄生蟲感染之防御的媒介，并且具有抗腫瘤活性。TNF還介入不同的自身免疫病。TNF可由幾種類型的細胞產生，包括巨噬細胞，成纖維細胞，T細胞和自然殺傷細胞。TNF與兩種不同的受體結合，它們各通過特定的細胞內信號傳導分子起作用，從而導致不同的TNF效應。TNF可作為膜結合形式或可溶性的分泌型細胞因子存在。
LT-α與TNF共享很多活性，即與TNF受體結合，但與TNF不同的是，它主要是由活化的T細胞和一些β-淋巴母細胞樣(lymphoblastoid)腫瘤分泌。LT-α和LT-β的異聚體復合物是能與LT-β受體結合的膜結合復合物。LT系統(LT和LT-R)似乎參與外周淋巴器官的發育，因為破壞LT-β基因會導致T和B細胞在脾臟中的解構和淋巴結中的缺乏。LT-β系統也參與一些腺癌細胞系的細胞死亡。
TNF家族的另一個成員Fas-L在活化的T細胞上顯著表達。它能通過已知為程序性細胞死亡或凋亡的機制導致攜有其受體的細胞，包括腫瘤細胞和被HIV-感染的細胞死亡。此外，Fas或Fas-L中的缺陷可導致淋巴增殖性疾病，由此證實Fas系統調節免疫應答的作用。Fas系統也介入由肝炎慢性感染引起的肝損害和HIV-感染患者的自身免疫。Fas系統還與HIV患者的T細胞破壞有關。該家族的另一個成員TRAIL似乎也參與多種不同來源的轉化細胞系的死亡。
TNF家族的另一個成員CD40-L在T細胞上表達，并能誘導對攜有CD40的B細胞的調節。另外，CD40-L基因的變化導致已知為X-連鎖高-IgM綜合征的疾病。CD40系統還涉及不同的自身免疫病，已知CD40-L具有抗病毒特性。盡管CD40系統參與拯救凋亡性B細胞，但在非-免疫細胞中，它誘導凋亡。TNF家族的很多其它淋巴細胞成員也參與共刺激。
一般說來，TNF家族的成員在控制免疫系統和活化急性宿主防御系統方面具有十分重要的調節作用。考慮到目前以治療為目的而操作TNF家族成員的進展，該家族的成員可能會提供獨特的疾病控制方式。該家族的一些配體可直接誘導很多轉化細胞的凋亡，例如LT，TNF，Fas配體和TRAIL。Nagata(1997)88細胞，355-365。Fas，可能還有TNF和CD30受體的活化可誘導未轉化的淋巴細胞死亡，這些細胞可能有免疫調節作用。Amakawa等(1996)84細胞551-562；Nagata(1997)88細胞355-365；Sytwu等(1996)；Zheng等(1995)377自然348-351。通常，位于TNF受體胞質側的死亡結構域聚集之后會引發死亡。死亡結構域協調安排多種信號轉導組分的裝配，所述裝配導致活化天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶級聯系統。Nagata(1997)88細胞355-365。一些受體缺乏典型的死亡結構域，例如LTb受體和CD30(Browning等(1996)；Lee等(1996))，但仍能誘導細胞死亡，盡管是較弱的誘導。這些受體的作用可能主要是誘導細胞分化，死亡是一些轉化型細胞系中的異常結果，但該情況仍不清楚，因為對CD30裸鼠的研究暗示了胸腺陰性選擇中的死亡作用。Amakawa等(1996)84細胞551-562。相反，通過其它途徑，如CD40進行信號傳導是維持細胞存活所必需的。因此，需要鑒定和定性身為TNF家族成員的其它分子，從而提供其它控制疾病和操作免疫系統的工具。
在本文中，我們鑒定了TNF細胞因子家族一種新配體的功能特性。該新配體被稱為BAFF(屬于TNF家族的B細胞活化因子)，它似乎由T細胞和樹突細胞表達以進行B-細胞共-刺激，因此，可能在控制B細胞功能方面起著重要作用。另外，我們還生產出在肝臟-特異性啟動子的控制之下過量表達BAFF的轉基因小鼠。這些小鼠具有過量的成熟B細胞數目，自發的生發中心反應，分泌自身抗體，并在次級淋巴器官中具有高漿細胞數目，在腎臟中具有Ig沉積。
發明簡述因此，本發明涉及BAFF-配體，該配體的封閉劑和抗體刺激或抑制B-細胞生長和免疫球蛋白分泌的用途。所要求的發明可用于多種疾病和紊亂的治療性應用(這一點將在下文中更詳細地討論)，并可用于得到免疫系統的相關信息，以及用于操作免疫系統及其過程。另外，本發明可用作刺激或抑制B-細胞生長和免疫球蛋白分泌的方法。本發明所述的BAFF相關分子也可用于治療自身免疫病，與B-細胞增殖和成熟化，BAFF配體調節相關的疾病和炎癥。本發明包括調節或防止高血壓和高血壓-相關的腎和心血管組織疾病。
下文的描述中列出了本發明的其它特征和優點，從描述中可以清楚了解，或者通過實施本發明可以了解部分特征和優點。通過說明書和書以及附圖中特別指出的方法，可以理解并獲得本發明的目的和其它優點。
因此，為了獲得這些和其它優點，根據本文所體現并廣泛描述的本發明目的，本發明包括通過施用多種BAFF配體和相關分子影響B-細胞生長和免疫球蛋白分泌的方法。
本發明還希望通過使用BAFF配體或該多肽的活性片斷來刺激B-細胞生長。該多肽可以單獨使用，或者與CD40配體或抗-鼠抗體一起使用。
在其它實施方案中，本發明涉及通過使用BAFF配體或BAFF的活性片斷刺激樹突細胞-誘導的B-細胞生長和成熟化的方法。同樣，該多肽可以單獨使用，或者與CD40配體或抗-μ抗體一起使用。
在其它實施方案中，使用BAFF和BAFF受體的封閉劑抑制B-細胞生長和免疫球蛋白分泌。這些封閉劑可以是不可操作的重組BAFF，BAFF特異性抗體，BAFF-受體特異性抗體或抗-BAFF配體分子。
在其它實施方案中，本發明涉及BAFF，BAFF相關分子和BAFF封閉劑治療高血壓，高血壓-相關疾病，免疫疾病，自身免疫病，炎癥和B-細胞淋巴-增生性疾病的用途。
本發明包括BAFF和BAFF-相關分子作為激動劑或拮抗劑以通過影響B-細胞的生長和/或成熟化和免疫球蛋白的分泌來影響免疫應答的用途。
在其它實施方案中，本發明涉及含有BAFF的可溶性構建體，該構建體可用于直接引發BAFF介導的病理學事件。所述事件在治療癌癥，腫瘤或操作免疫系統以治療免疫疾病方面具有有益的治療效果。
另外，在其它實施方案中，所要求的發明涉及抗BAFF配體的抗體，所述抗體可用于例如治療癌癥，和操作免疫系統以治療免疫疾病。
在其它實施方案中，本發明涉及使用BAFF基因進行基因治療的方法。
本發明的藥物制品可任選包括藥物可接受的載體，佐劑，填充劑，或其它藥物組合物，可以本領域已知的多種形式或途徑中的任何一種施用所述藥物制品。
應理解以上的一般性描述和以下的詳細描述是舉例和解釋性的，欲為所要求的發明提供進一步的解釋。
提供附圖是為了進一步理解本發明，附圖摻入并構成了本說明書的一部分，并且闡明了本發明的幾個實施方案，附圖與描述部分一起用于解釋本發明的原理。
附圖描述

圖1(A)顯示了人和小鼠BAFF的推測氨基酸序列。圖中顯示出推測的跨膜結構域(TMD，破折號線)，潛在的N-聯糖基化位點(星號)和人BAFF的天然加工位點(箭頭)。hBAFF上的雙線表示通過Edman降解BAFF的經加工形式而得到的序列。(B)顯示了BAFF和一些TNF配體家族成員的胞外蛋白質序列比較。相同的和同源的殘基分別以黑色和帶陰影的方框表示。(C)顯示了TNF家族配體的樹狀圖。
圖2圖解表征了重組BAFF。(A)圖示重組BAFF構建體。以Leu83和Gln136開始的可溶性重組BAFF被表達成與N-末端Flag標記和6-氨基酸接頭的融合蛋白。在293T細胞中，長型在Arg133和Ala134(箭頭)之間被裂解，產生經加工的BAFF形式。Asn124和Asn242屬于N-糖基化的共有位點。存在于Asn124上的N-聯聚糖被表示為Y.TMD跨膜結構域。(B)用肽N-聚糖酶F(PNG酶F)處理重組BAFF。使含有Flag標記的BAFF和APRIL的濃縮上清液去糖基化，并如圖所示用多克隆抗-BAFF抗體或抗-Flag M2進行Westem印跡分析。除經加工的BAFF外的所有帶也與抗-Flag M2反應(未顯示數據)。(C)全長BAFF被加工成可溶性的形式。用全長BAFF瞬時轉染293T細胞。用多克隆抗BAFF抗體經Western印跡分析經轉染的細胞及其濃縮上清液。將對應于10倍細胞量的上清液上樣于凝膠。(D)在Superdex-200上對可溶性BAFF進行大小排阻層析。在Superdex-200柱上分級分離含有可溶性BAFF(短型)的濃縮上清液，并用抗-Flag M2抗體經Western印跡分析洗脫的級分。SDS-PAGE的左手側和大小排阻層析圖的上方示出了分子量標記(以kDa計)的遷移位置。
圖3顯示了BAFF的表達。(A)用BAFF反義mRNA探測多種人組織的Northern印跡(每個泳道上樣2μg poly A+RNA)。(B)由以下細胞的RNA逆轉錄酶擴增BAFF，IL-2受體α鏈和肌動蛋白，所述細胞是處于PHA活化的不同時間點的純化血T細胞，E-花結陰性血細胞(B細胞和單核細胞)，體外獲得的不成熟樹突細胞，293細胞和被全長BAFF無菌轉染的293細胞(293-BAFF)。在不添加cDNA時進行對照擴增，擴增IL-2受體α鏈以作為T細胞活化的標記。
圖4顯示了BAFF與成熟B細胞的結合。(A)可溶性BAFF與BJAB和Jurkat細胞系，以及臍帶(cord)血中的純化CD19+細胞的結合。用所示量(ng/50μl)的Flag-BAFF染色細胞，并通過流式細胞儀進行分析。(B)可溶性BAFF與PBL的結合。用抗-CD8-FITC或抗-CD19-FITC(水平軸)和Flag-BAFF加M2-生物素和親和素-PE(垂直軸)染色PBL。對照中無Flag-BAFF。
圖5顯示了BAFF共刺激B細胞增殖。(A)穩定轉染的293細胞中BAFF的表面表達。用抗-BAFF mAb 43.9染色293-BAFF和293野生型細胞，并通過流式細胞儀進行分析。(B)通過293-BAFF細胞共刺激PBL。在存在或缺乏抗-B細胞受體抗體(抗-μ)時，將PBL(105/孔)與15,000個用戊二醛-固定的293細胞(293wt或293-BAFF)一起保溫。只有固定的293細胞摻入了100cpm。(C)在抗-μ存在下，可溶性BAFF對PBL增殖進行依賴于劑量的共刺激。保溫72小時之后，通過[3H]-胸苷摻入測定增殖。對照包括僅用BAFF處理的細胞，經熱變性的BAFF處理的細胞，或用無關同種型匹配抗體替代抗-μ而處理的細胞。(D)比較sCD40L和sBAFF對PBL增殖的共刺激效應。如實驗組(panel)C中所述進行實驗。(E)BAFF共刺激預活化的人B細胞的Ig分泌。通過與EL-4T細胞和活化的T細胞上清液共培養5-6天來活化純化的CD19+B細胞，然后重新分離，并在僅有培養基(-)或含有5％活化的T細胞上清液的培養基(T-SUP)或含細胞因子混合物(IL-2，IL-4，IL-10)的培養基存在下再培養7天。條形柱表示含或不含1μg/ml BAFF的培養物中的Ig平均濃度。平均值±SD為下列值時意味著“成倍增加”即培養基中為1.23±0.11，T細胞上清液中為2.06±0.18(4次實驗)，IL-2，IL-4和IL-10中為1.45±0.06(2次實驗)。用外周血(3次實驗)或脊髓血B細胞進行這些實驗(1次實驗；如T細胞上清液增加2.3倍，加IL-2，IL-4和IL-10增加1.5倍)。(F)如實驗組D所示，含T細胞上清液的培養物中BAFF效應的劑量-反應曲線。數值為3次實驗的平均值±SD。
圖6顯示了BAFF可用作B細胞增殖的輔因子。測定僅有人PBL(500cpm)時，僅存在BAFF配體時，僅存在山羊抗-鼠(mu)時，以及同時存在BAFF配體和抗-mu時的增殖。當BAFF的濃度增加時，抗-mu和BAFF的組合使PBL增殖顯著增加，這暗示了BAFF的輔因子特性。
圖7顯示了BAFF Tg小鼠中增加的B細胞數目。(A)BAFF Tg小鼠中增加的淋巴細胞計數。圖中將12只同窩對照小鼠(左邊的實驗組)與12只BAFFTg小鼠(右邊的實驗組)相比較。用圓圈表示淋巴細胞計數，用菱形表示粒細胞(包括嗜中性，嗜酸性，嗜堿性粒細胞)計數。(B)BAFF Tg小鼠的PBL中B細胞的比例增加。PBL用抗-B220-FITC和抗-CD4-PE染色以進行FACS分析，并用前向散射選通(gate)在活細胞上。示出了CD4和B220陽性細胞的百分比。顯示出一只對照小鼠(左邊)和兩只BAFF Tg小鼠(右邊)，將每組分析的7只動物中的代表作為結果。(C)PBL中B/T細胞比率的FACS分析。在(A)和(C)中，對照動物和BAFF Tg小鼠之間的差異存在統計學顯著性(P＜0.001)。(D)BAFF Tg小鼠PBL的B細胞上增加的MHC II類表達。通過FACS分析MHC II類表達。(E)BAFF Tg小鼠PBL的B細胞中增加的Bcl-2表達。通過胞質內染色測定Bcl-2表達，并通過FACS分析細胞。在(D)和(E)中，使活細胞選通前向散射。顯示出4只同窩對照小鼠(白色條形)和4只BAFFTg小鼠，它們代表每組所分析的至少12只動物。MFI熒光強度的平均值。對照動物和BAFF Tg小鼠之間的差異有統計學顯著性(P＜0.005)。(F)BAFF Tg小鼠中增加的效應T細胞表達。用抗-CD4-Cychrome，抗-CD44-FITC和抗-L選擇蛋白-PE染色PBL。顯示出CD4+-選通的細胞。示出了CD44hi/L-選擇蛋白lo細胞的百分比。顯示出一只對照小鼠(左邊)和兩只BAFF Tg小鼠(右邊)，將每組分析的8只動物中的代表作為結果。
圖8顯示了BAFF Tg小鼠的脾臟而不是骨髓中增加的B細胞區室。(A)使用抗-IgM-FITC和抗-B220-PE對脾臟(上方的實驗組)，骨髓(中間的實驗組)和MLN(下方的實驗組)中的成熟B細胞進行FACS染色。示出了B220+/IgM+成熟B細胞的百分比。(B)同時使用抗-CD43-FITC，抗-B220-Cy-chrome和抗-IgM-PE對骨髓中的preB細胞(B220+/CD43-)和proB細胞(B220+/CD43+)進行FACS染色。顯示出選通于IgM陰性群體的細胞。示出了preB細胞(B220+/CD43-)和proB細胞(B220+/CD43+)的百分比。所有圖(A和B)均顯示出一只對照小鼠(左邊)和兩只BAFF Tg小鼠(右邊)，將每組分析的7只動物中的代表作為結果。
圖9顯示了BAFF Tg小鼠中增加的Ig，RF和CIC水平。(A)以所示量的純化的小鼠IgG為參照，一個挨著一個地對2份對照血清(-)和BAFF Tg小鼠的4份血清(+)進行SDS-PAGE。所有泳道中，白蛋白帶的強度類似，這表明對每份樣品而言，上樣于凝膠的樣品量相等。對19只同窩對照小鼠(白色條形)和21只BAFF Tg小鼠(黑色條形)的血清中的總小鼠Ig(B)，RF(C)和CIC(D)進行基于ELISA的分析。當缺乏適當的RF對照時，RF的滴度(以2為底的對數)被定義為給出的O.D.值比背景的O.D.值高3倍的血清稀釋度。CIC的量被定義為產生與用受試血清所得的O.D.值相等的O.D.值所需的PAP量。對照動物和BAFF Tg小鼠之間的差異具有統計學顯著性(在(B)和(C)中，P＜0.001，在(D)中，P＜0.003)。
圖10顯示了一些BAFF Tg小鼠中抗-ssDNA和抗-dsDNA自身抗體的存在。(A)通過ELISA分析19只同窩對照小鼠(灰色條形)和21只BAFF Tg小鼠(黑色條形)中的抗-ssDNA自身抗體。(B)通過ELISA分析來自于(A)的5只同窩對照小鼠和5只顯示出抗-ssDNA自身抗體水平的動物中的抗-ssDNA自身抗體。(C)對照小鼠(左邊)和BAFF Tg小鼠(右邊)腎臟的石蠟切片，所述切片已用山羊抗-小鼠Ig-HRP染色。通過棕色染色顯示出Ig沉積。這些圖是所分析的6只BAFF Tg小鼠中的代表。
圖11顯示了BAFF Tg小鼠中腫大的集合淋巴結(Peyer’s patch)。對照小鼠(左邊)和BAFF Tg小鼠(右邊)小腸上的集合淋巴結(以箭頭表示)照片。該圖是每組處死的至少12只小鼠中的代表。放大倍數5X。
圖12表示BAFF Tg小鼠脾臟中被破壞的T和B細胞結構，強烈的生發中心反應，降低的樹突細胞數目和增加的漿細胞數目。對照小鼠以A，C，E和G表示，BAFF Tg小鼠以B，D，F和H表示。B細胞是藍色的，T細胞是棕色的(A和B)。生發中心以箭頭表示(C和D)。在對照小鼠中僅發現很少的殘留生發中心(C)。CD11c陽性樹突細胞是棕色的，出現在T細胞區，橋連通道和邊緣區(E)。很少存在于BAFF Tg小鼠中(F)。僅在BAFF Tg小鼠(H)而不是對照小鼠(G)的紅髓中可以檢測到多配體聚糖-1-陽性漿細胞。這些圖是所分析的至少12只BAFF Tg小鼠和12只對照小鼠的代表。除了C和D圖的放大倍數為50外，其它所有圖的放大倍數皆為100。BB細胞濾泡，TPALS，WP白髓，RP紅髓。
圖13顯示了BAFF Tg小鼠MLN中被破壞的T和B細胞結構，強烈的生發中心反應和大量的漿細胞。對照小鼠以A，C，E和G表示，BAFF Tg小鼠以B，D，F和H表示。按圖6所述進行免疫組化反應。T和B細胞染色示于A和B，生發中心示于C和D，樹突細胞示于E和F，漿細胞示于G和H。GC生發中心，放大倍數100。
發明詳述以下將詳細參照本發明優選的實施方案。本發明涉及BAFF和BAFF相關分子影響B-細胞生長和成熟化和免疫球蛋白分泌的用途。本發明涉及BAFF和BAFF相關分子影響免疫-相關疾病所必需的免疫系統反應的用途。另外，本發明包括使用BAFF，或BAFF相關基因通過基因治療方法治療癌癥和免疫疾病。
由被本發明的序列轉化的宿主產生的BAFF配體及其類似物，以及通過本領域已知的方法純化的，或由已知氨基酸序列產生的天然BAFF可用于抗癌，抗腫瘤和免疫調節應用的多種方法。它們也可用于針對其它疾病的治療和方法。
本發明的另一方面涉及由分離的編碼BAFF-配體的核酸編碼的多肽在“反義”療法中的用途。本文所用的“反義”療法指的是施用或原位產生寡核苷酸或其衍生物，它們在細胞條件下能與編碼所需配體的細胞性mRNA和/或DNA特異性雜交，從而通過抑制轉錄和/或翻譯來抑制所編碼蛋白質的表達。這種結合可以是常規的堿基對互補，或者，例如，當與DNA雙螺旋結合時，可通過與雙螺旋主溝的特異性相互作用進行結合。一般說來，“反義”療法指的是通常應用于本領域的一系列技術，包括依靠與寡核苷酸序列特異性結合的任何療法。
本發明的反義構建體可作為例如表達質粒被傳遞，當其在細胞中被轉錄時，可產生與編碼Kay-配體的細胞mRNA的至少一部分互補的RNA。或者，反義構建體可以是離體(ex vivo)產生的寡核苷酸探針。優選這種寡核苷酸探針是對內源性核酸酶具有抗性，因而能在體內穩定存在的，經修飾的寡核苷酸。例如，可用作反義寡核苷酸的核酸分子是DNA的氨基磷酸酯，硫代磷酸酯和甲基磷酸酯類似物(例見美國專利5,176,996；美國專利5,264,564和美國專利5,256,775)。另外，有關構建反義療法中所用寡聚體的一般方法的評論可參見例如Van Der Krol等(1988)生物技術6958-976和Stein等(1988)癌癥研究482659-2668(列入本文作為參考)。
C.BAFF-配體如上所述，本發明的BAFF-配體是TNF家族的成員，它被描述于PCT申請號PCT/US98/19037(WO99/12964)中(其全文列入本文作為參考)。該蛋白質，其片斷或同系物可能具有廣泛的治療和診斷用途。
BAFF-配體主要存在于脾臟和外周血淋巴細胞中，這有力地說明它在免疫系統中的調節作用。將本發明所要求的BAFF-配體序列與人TNF家族其它成員相比較，揭示出相當大的結構相似性。所有蛋白質共享在胞外結構域中保守的幾個序列區域。
盡管仍不知道所要求的配體的精確三維結構，但據推測，作為TNF家族的成員，它可與該家族的其它成員共享某些結構特征。
本發明的新多肽與目前尚未被鑒定的受體特異性地相互作用。然而，本文所述的肽和方法使得能夠鑒定與BAFF-配體或其片斷特異性相互作用的受體。
在某些實施方案中，所要求的發明包括衍生自BAFF-配體并能與其受體結合的肽的使用方法。可以用幾種方法產生BAFF-配體的片斷，例如重組方法，PCR，蛋白酶消化或化學合成。通過從編碼該多肽的核酸的一端或兩端除去一個或多個核苷酸，可以產生多肽的內部或末端片斷。表達經誘變的DNA可產生多肽片斷。
也可以使用本領域已知的技術，例如常規的Merrifield固相f-moc或t-boc化學法化學合成多肽片斷。例如，可將本發明的肽和DNA序列任意分成互不重疊的所需長度的片斷，或者分成所需長度的重疊片斷。下文中將更詳細地描述諸如此類的方法。
產生可溶形式的BAFF-配體可溶形式的BAFF-配體經常可以有效地發出信號，因此可將它作為目前能模擬天然膜形式的一種藥物來使用。本文所要求的BAFF-配體可以作為可溶性細胞因子被天然分泌，然而，如果不能分泌，可以對其基因進行再改造以迫使它分泌。為了產生可溶性分泌型BAFF-配體，應在DNA水平上除去N-末端跨膜區以及莖區的某些部分，并用I型前導序列或者II型前導序列取而代之，所述前導序列允許在選定的表達系統中進行有效的蛋白酶裂解。本領域技術人員可以改變分泌表達構建體中保留的莖區的量，從而使受體結合特性和分泌效力均最優化。例如，可以制備含有所有可能的莖長度的構建體，即N-末端截短形式，以產生從氨基酸81至139的蛋白質。這種類型的分析可產生最佳長度的莖序列。
E.產生與BAFF-配體反應的抗體本發明也包括與所要求的BAFF-配體或其受體特異性反應的抗體。可通過標準方法制備抗-蛋白質/抗-肽抗血清或單克隆抗體(例見抗體實驗室手冊，由Harlow和Lane編(冷泉港出版社1988))。可用免疫原形式的肽免疫哺乳動物，如小鼠，倉鼠或兔。賦予蛋白質或肽免疫原性的技術包括與載體偶聯，或本領域眾所周知的其它技術。
可在佐劑的存在下施用BAFF-配體或其受體的免疫原性部分。可通過檢測血漿或血清中的抗體滴度來監測免疫的進程。將免疫原用作抗原時，可使用標準的ELISA或其它免疫分析來評估抗體的水平。
在優選的實施方案中，本發明的抗體對BAFF-配體或其受體，或與其密切相關的人或非人哺乳動物同系物(例如70，80或90％同源，更優選至少95％同源)的抗原決定簇(例如SEQ ID NO2的多肽的抗原決定簇，所述序列如PCT申請號PCT/US98/19037(WO99/12964)所述，該文獻列入本文作為參考)具有免疫特異性。在本發明另一個優選的實施方案中，抗-BAFF-配體或抗-BAFF-配體-受體的抗體基本上不與同SEQ ID NO2或6(所述序列如PCT申請號PCT/US98/19037(WO99/12964)所述，該文獻全文列入本文作為參考)的同源性低于80％，優選同SEQ ID NO2(所述序列如PCT申請號PCT/US98/19037(WO99/12964)所述，該文獻全文列入本文作為參考)的同源性低于90％，最優選同SEQ ID NO2(所述序列如PCT申請號PCT/US98/19037(WO99/12964)所述，該文獻全文列入本文作為參考)的同源性低于95％的蛋白質交叉反應(即特異性反應)。“基本上不交叉反應”指的是抗體對非-同源蛋白質的結合親和力低于對SEQ ID NO2(所述序列如PCT申請號PCT/US98/19037(WO99/12964)所述，該文獻全文列入本文作為參考)的結合親和力的10％，更優選低于5％，甚至更優選低于1％。
本文所用術語抗體欲包括也能與BAFF-配體或其受體特異性反應的抗體片斷。可使用常規技術使抗體片斷化，并使用與上文所述的篩選完整抗體相同的方法來篩選抗體片斷以供使用。例如，通過用胃蛋白酶處理抗體可產生F(ab’)2片段。可處理所得F(ab’)2片段以還原二硫鍵，產生Fab’片段。本發明的抗體進一步包括生物特異性的和嵌合的分子，所述分子具有抗-BAFF-配體或抗-BAFF-配體-受體活性。因此，可使用抗BAFF-配體，腫瘤-配體及其受體的單克隆和多克隆抗體(Ab)，以及諸如Fab’和F(ab’)2等抗體片段來阻斷所述配體與其各自受體的作用。
也可使用標準的重組DNA技術制備多種形式的抗體。Winter和Milstein(1991)自然349293-299(列入本文作為參考)。例如，可構建嵌合抗體，其中將來自動物抗體的抗原結合結構域與人的恒定區相連(例如，Cabilly等，美國專利4,816,567，列入本文作為參考)。嵌合抗體可減輕所觀察到的由動物抗體用于人臨床治療時引發的免疫應答。
另外，可合成識別BAFF-配體或其受體的重組“人源化抗體”。人源化抗體是主要含有人IgG序列的嵌合體，其中插入了負責特異性抗原-結合的區域。用所需抗原免疫動物，分離相應的抗體，除去負責特異性抗原結合的可變區序列部分。然后將來自動物的抗原結合區域克隆至人抗體基因中已缺失了抗原結合區域的相應位置。人源化抗體在人抗體中最低限度地使用了異源(即種間)序列，因此，最不可能在治療的受試者中引發免疫應答。
通過制備含有可變結構域和分離自不同類免疫球蛋白的人恒定區結構域(CH1，CH2，CH3)的嵌合或人源化抗體，即可構建不同類的重組抗體。例如，通過將抗原結合位點克隆至攜有人鏈恒定區的載體，即可重組產生抗原結合位點效價增加了的抗體。Arulanandam等(1993)，實驗醫學雜志，1771439-1450(列入本文作為參考)。
另外，可使用標準的重組DNA技術，通過改變抗原結合位點附近的氨基酸殘基來改變重組抗體與其抗原結合的親和力。通過基于分子模型制作的誘變可增加人源化抗體與抗原結合的親和力。Queen等，(1989)Proc.NatlAcad.Sci，8610029-33(列入本文作為參考)。
F.產生類似物產生已改變的DNA和肽序列BAFF-配體的類似物與天然BAFF-配體在氨基酸序列上，或者在不涉及序列的方面，或者在這兩個方面可以有所不同。非-序列修飾包括BAFF-配體的體內或體外化學衍生化。非-序列修飾包括但不限于乙酰基化，甲基化，磷酸化，羧基化或糖基化中的變化。
優選的類似物包括BAFF-配體的生物活性片段，其序列與SEQ ID NO2所述的序列(該序列如PCT申請號PCT/US98/19037(WO99/12964)所述，該文獻全文列入本文作為參考)因一個或多個保守氨基酸取代，或一個或多個非-保守氨基酸取代，缺失或插入而有所不同，但不會取消BAFF-配體的活性。保守的取代一般包括用一個氨基酸取代另一個具有相似特性的氨基酸，例如，在以下組別的氨基酸中進行取代纈氨酸，甘氨酸；甘氨酸，丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；絲氨酸，蘇氨酸；賴氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。
G.本發明的材料和方法抗-Flag M2單克隆抗體，生物素化的抗-Flag M2抗體和與瓊脂糖偶聯的抗-Flag M2抗體可購自Sigma。細胞培養物試劑得自Life Science(Basel，瑞士)和Biowhittaker(Walkersville，MD)。按文獻(10，11)所述在293細胞中產生Flag標記的可溶性人APRIL(殘基K110-L250)。經FITC-標記的抗-CD4，抗-CD8和抗-CD19抗體購自Pharmingen(San Diego，CA)。特異于人IgM的Fc5μ片段的山羊F(ab’)2購自Jackson ImmunoResearch(West Grove，PA)。第二抗體得自Pharmingen或Jackson ImmunoResearch，并使用推薦的稀釋度。
在含有10％經熱滅活的胎牛血清(FCS)的DMEM中維持人胚腎293T(12)細胞和成纖維細胞系(表1)。在添加有2％FCS的DMEM-營養成分混合物F12(1∶1)中維持人胚腎293細胞。在添加有10％FCS的RPMI中培養T細胞系，B細胞系和巨噬細胞系(表1)。在添加有10％FCS的Iscove培養基中培養Molt-4細胞。在含有10％FCS，0.5mM非必需氨基酸，10mM Na-Hepes和1mM丙酮酸鈉的MEM-α培養基中培養上皮細胞系。在添加有20％FCS，100μg/ml上皮細胞生長因子(Collaborative Research，Inotech，Dottikon，瑞士)和100μg/ml肝素鈉鹽(Sigma)的M199培養基中維持HUVEC。所有培養基中都含有青霉素和鏈霉素。通過Ficoll-Paque(Pharmacia，Uppsala，瑞典)梯度離心，從健康成年自愿者的肝素化血液中分離外周血白細胞，并在RPMI，10％FCS中培養。
T細胞通過與經神經氨酸酶-處理的綿羊紅細胞形成花結而由非-粘附的PBL中得到，并通過Ficoll-Paque梯度離心將T細胞與未形成花結的細胞(主要是B細胞和單核細胞)分開。用植物凝集素(Sigma)(1μg/ml)將純化的T細胞活化24小時，洗滌并在RPMI，10％FCS，20U/ml IL-2中培養。使用抗-CD14抗體，山羊抗-小鼠-包被的微珠和MinimacsTM裝置(Miltenyi Biotech)，經磁性細胞分選而純化CD14+單核細胞，并在GM-CSF(800U/ml，Leucomax，Essex Chemie，Luzern，瑞士)和IL-4(20ng/ml，Lucerna Chem，Luzern，瑞士)的存在下培養5天，然后在GM-CSF，IL-4和TNF□□(200U/ml，Bender，Vienna，奧地利)的存在下再培養3天以得到CD83+，樹突細胞-樣群體。按文獻(13)所述，使用抗-CD19磁珠(M450，Dynal，Oslo，挪威)，從外周血或臍血中分離純度＞97％的人B細胞。
-Northern印跡分析使用人多組織Northern印跡I和II(Clontech #7760-1和#7759-1)進行Northern印跡分析。于60℃，在雜交溶液(50％甲酰胺，2.5×Denhardt’s，0.2％SDS，10mM EDTA，2×SSC，50mM NaH2PO4，pH6.5，200μg/ml經超聲處理的鮭精DNA)中將膜保溫2小時。熱變性反義RNA探針，并在新鮮雜交溶液中加入2×106cpm/ml該探針，其中所述探針含有對應于hBAFF的氨基酸136-285的核苷酸。于62℃將膜雜交16小時，用2×SSC，0.05％SDS洗滌一次(25℃，30分鐘)，再用0.1×SSC，0.1％SDS洗滌一次(65℃，20分鐘)，于-70℃暴露于X-射線膠片。
-鑒定BAFF cDNA人BAFF cDNA的部分序列包含在幾個EST克隆(例如GenBank登記號T87299和AA166695)中，所述克隆得自胎肝和脾臟和卵巢癌文庫。通過按廠商推薦的方法，使用廠商提供的來自人白細胞庫的cDNA文庫為模板，用寡核苷酸AP1和JT1013(5’-ACTGTTTCTTCTGGACCCTGAACGGC-3’)進行5’-RACE-PCR(Marathon-Ready cDNA，Clonetech，Palo Alto，CA)擴增，得到所述cDNA的5’部分。將所得的PCR產物克隆至PCR-0平端(Invitrogen，NV Leek，荷蘭)，并作為EcoRI/PstI片斷亞克隆至含有EST克隆T87299的pT7T3 Pac載體(Pharmacia)。因此，通過使用BAFF內部的PstI位點組合5’和3’片斷即可得到全長hBAFF cDNA。該序列的GenBank登記號為AF116456。
鼠BAFF的617bp部分序列包含在兩個重疊的EST克隆(AA422749和AA254047)中。將跨越該序列中核苷酸158至391的PCR片斷用作探針來篩選小鼠脾臟cDNA文庫(Stratagene，La Jolla，CA)。
-表達重組的BAFF使用寡核苷酸JT1069(5’-GACAAGCTTGCCACCATGGATGACTCCACA-3’)和JT637(5’-ACTAGTCACAGCAGTTTCAATGC-3’)擴增全長hBAFF。將PCR產物克隆至PCR-0平端，并作為HindIII/EcoRI片斷重新亞克隆至PCR-3哺乳動物表達載體。使用寡核苷酸JI636(5’-CTGCAGGGTCCAGAAGAAACAG-3’)和JT637擴增短的可溶性BAFF形式(氨基酸Q136-L285)。使用內部PstI位點由全長BAFF獲得長的可溶性BAFF形式(氨基酸L83-L285)。將可溶性BAFF作為PstI/EcoRI片斷重新亞克隆至經改良的PCR-3載體的血凝素信號肽和Flag序列之后，并作為與N-末端Flag序列在同一讀碼框內的PstI/SpeI片斷重新亞克隆至經改良的pQE16細菌表達載體(14)。測序構建體的兩條鏈。建立表達短的可溶性形式或全長BAFF的穩定的293細胞系，按文獻(14，15)所述，由細菌和哺乳動物293細胞表達和純化重組的可溶性BAFF。
-逆轉錄酶PCR根據廠商說明，使用Ready to Go系統(Pharmacia)逆轉錄提取自T細胞，B細胞，體外獲得的不成熟樹突細胞，293wt和293-BAFF(全長)細胞的總RNA。使用特異性的寡核苷酸，用Taq DNA聚合酶進行PCR擴增以檢測BAFF和β-肌動蛋白cDNA(94℃，55℃和72℃各1分鐘，共30輪循環)，對BAFF而言，寡核苷酸為JT13225’-GGAGAAGGCAACTCCAGTCAGAAC-3’和JT13235’-CAATTCATCCCCAAAGACATGGAC-3’；對IL-2受體α鏈而言，寡核苷酸為JT1368 5’-TCGGAACACAACGAAACAAGTC-3’和JT1369 5’-CTTCTCCTTCACCTGGAAACTGACTG-3’；對β-肌動蛋白而言，寡核苷酸為5’-GGCATCGTGATGGACTCCG-3’和5’-GCTGGAAGGTGGACAGCGA-3’。
-凝膠滲透層析用短的可溶性BAFF形式瞬時轉染293T細胞，并在無血清的Optimem培養基中培養7天。將經調節的上清液濃縮20倍，與內部標準過氧化氫酶和卵白蛋白混合，上樣于Superdex-200 HR10/30柱。以0.5ml/分鐘的流速，用PBS洗脫蛋白質，用三氯醋酸沉淀級分(0.25ml)，并使用抗-Flag M2抗體進行Western印跡以分析級分。用標準的蛋白質鐵蛋白(440kDa)，過氧化氫酶(232kDa)，醛縮酶(158kDa)，牛血清白蛋白(67kDa)，卵白蛋白(43kDa)，胰凝乳蛋白酶原A(25kDa)和核糖核酸酶A(13.7kDa)校準柱。
-PNG酶F處理于95℃，在含0.5％SDS，1％2-巰基乙醇的20μl溶液中將樣品加熱3分鐘，然后冷卻，添加10％Nonidet P-40(2μl)，0.5M磷酸鈉，pH7.5(2μl)和PeptideN-聚糖酶(glycanase)F(125個單位/μl，1μl或在對照中不含酶)。在進行Western印跡分析之前，于37℃將樣品保溫3小時。
-EDMAN測序用可溶性BAFF長形式瞬時轉染293T細胞，并在無血清的Optimem培養基中培養7天。將經調節的上清液濃縮20倍，按文獻(16)所述通過SDS-PAGE分級分離，并印跡至聚偏氟乙烯膜(BioRad Labs，Hercules，CA)上，然后使用氣相測序儀(ABI 120A，Perkin Elmer，Foster City，CA)進行測序，所述測序儀與配備有乙內酰苯硫脲C182.1×250mm柱的分析儀(ABI 120A，PerkinElmer)相連接。使用軟件ABI610(Perkin Elmer)分析數據。
-抗體通過用重組的可溶性BAFF免疫兔(Eurogentec，Seraing，比利時)以產生多克隆抗體。將用相同抗原免疫的大鼠脾臟與x63Ag8.653小鼠骨髓瘤細胞融合，篩選雜交瘤中的BAFF-特異性IgG。這些單克隆抗體中的一個，即43.9是特異性識別hBAFF的IgG2a。
細胞于4℃，在50μl FACS緩沖液(PBS，10％FCS，0.02％NaN3)中，用50ng(或所示量)的Flag標記的可溶性hBAFF短形式染色20分鐘，接著用抗-Flag M2(1μg)和第二抗體染色。抗-BAFF mAb 43.9的使用濃度為40μg/ml。為了進行雙色FACS分析，外周血淋巴細胞用Flag標記的可溶性BAFF/長型(2μg/ml)染色，接著用生物素化的抗-Flag M2(1/400)和PE-標記的鏈霉抗生物素蛋白(1/100)染色，接著用經FITC-標記的抗-CD4，抗-CD8或抗-CD19染色。
-PBL增殖試驗在存在或缺乏2μg/ml山羊抗-人μ鏈抗體(Sigma)或對照F(ab’)2時，在96-孔培養板中將外周血白細胞與所示濃度的天然或經煮沸的可溶性BAFF/長型一起保溫72小時(以105個細胞/孔在100μl添加有10％FCS的RPMI中保溫)。再用[3H]胸苷(1μCi/孔)脈沖細胞6小時，并收獲細胞。通過液體閃爍計數監測[3H]胸苷摻入。在一些實驗中，用被全長BAFF穩定轉染的293細胞(或用作對照的293wt)替代重組可溶性BAFF，所述293細胞已于25℃在1％低聚甲醛中固定了5分鐘。按文獻(17)所述進行試驗。在另一些實驗中，用磁珠從PBL中分離CD19+細胞，照射(3000拉德)剩下的CD19-細胞，然后與CD19+細胞重建。按上文所述以sBAFF進行增殖試驗。
-B細胞活化試驗按文獻(13)所述，在EL-4培養系統中活化純化的B細胞。簡單地說，在200μl培養基中將與5×104個經照射的鼠EL-4胸腺瘤細胞(克隆B5)混合的104個B細胞培養5-6天，所述培養基含有5％v/v人T細胞(106/ml)培養物上清液，所述T細胞已用PHA(1μg/ml)和PMA(1ng/ml)活化48小時。然后再次用抗-CD19珠分離B細胞，并在存在或缺乏sBAFF時，在單純的培養基或添加有5％T細胞上清液，或50ng/ml IL-2(former Glaxo Institute for MolecularBiology，Geneva饋贈)和各10ng/ml的IL-4和IL-10(Peprotech，倫敦，英國)的培養基中將該B細胞再培養7天(5×104個細胞/200μl，在平底96孔培養板中進行雙份或三份試驗)。加入濃度為2μg/ml的抗-Flag M2抗體，獨自使用該抗體是無效的。按文獻(13)所述，通過ELISA試驗定量培養物上清液中的IgM，IgG和IgA。
我們使用改良的分布圖檢索(18)篩選了公共數據庫，通過序列同源性可將人BAFF鑒定為TNF配體家族可能的新成員。通過組合EST-克隆(覆蓋3’區域)和經PCR擴增的片段(5’區域)，獲得編碼285-氨基酸(aa)長的完整蛋白質的cDNA。缺乏信號肽表明BAFF是II型膜蛋白，是典型的TNF-配體家族成員。該蛋白質具有推定的46aa胞質結構域，疏水跨膜區域和含有兩個潛在的N-糖基化位點的218aa胞外結構域(圖1A)。BAFF胞外結構域的序列與APRIL顯示出最高的同源性(33％氨基酸同一性，48％同源性)，而與該家族其它成員，如TNF，FasL，LTα，TRAIL或RANKL的同一性低于20％(圖1B，C)。分離自脾臟文庫的小鼠BAFF cDNA克隆編碼稍長一些的蛋白質(309aa)，因為在跨膜區域和幾個β鏈的第一鏈之間具有插入片段，所述β鏈構成所有TNF配體成員的受體結合結構域(19)。在小鼠和人BAFF中，這一富含β鏈的外結構域幾乎是相同的(同一性86％，同源性93％)，這表明BAFF基因在進化過程中是高度保守的(圖1A)。
盡管TNF家族成員是作為插入膜的配體被合成的，但經常可以觀察到跨膜結構域和受體結合結構域之間的莖區域中的裂解。例如，用金屬蛋白酶可以容易地將TNF或FasL從細胞表面裂解下來(20，21)。當在293T細胞中產生幾種重組BAFF形式時，我們注意到32kDa的重組可溶性BAFF形式(aa83-285，sBAFF/長型)除含有受體結合結構域以外，含有完整的莖區域和N-末端Flag-標記，該形式被充分加工成較短的18kDa片段(圖2A，B)。裂解發生在莖區域，因為只有用抗BAFF完整受體相互作用結構域的抗體，而不是抗-Flag抗體才能檢測到該片段(數據未顯示)。也揭示出只有N124(位于莖區域)，而不是N242(位于F-β片層的入口處)是糖基化的，因為通過用PNG酶F除去N聯糖類，未經加工的sBAFF/長型的分子量由32kDa降低為30kDa，而18kDa的裂解形式對此處理不敏感。對18kDa片段的肽序列分析實際上顯示出裂解發生在R133和A134之間(圖1A)。R133位于多堿(polybasic)區域的末端，所述區域在人(R-N-K-R)和小鼠(R-N-R-R)之間是保守的。為了檢測裂解是否不僅僅是表達可溶性的，非天然BAFF形式的假象，在293T細胞中表達與膜結合的全長BAFF(圖2C)。在細胞提取物中可以容易地檢測到32kDa的完整BAFF和一些較高分子量的類別(可能相當于未-解離的二聚體和三聚體)，但從上清液中回收的95％以上的BAFF相當于經加工的18kDa形式，這表明當作為與膜結合的配體合成時，BAFF也被加工過。
對可溶性BAFF進行基因工程改造(Q136-L285，sBAFF/短型)，其序列自加工位點下游2aa開始(圖1B)。正如所預測的那樣，與該重組分子的N末端結合的Flag-標記未被去除(數據未顯示)，這樣的話，就可以通過抗-Flag親和柱純化該重組分子。為了檢測其正確的折疊，通過凝膠過濾分析純化的sBAFF/短型，其中洗脫表觀分子量為55kDa的蛋白質(圖2D)。sBAFF/短型被正確裝配成同三聚體(3×20kDa)，這與其它TNF家族成員的四級結構一致(19)。最后，在細菌中可容易地表達未經加工的sBAFF/長型，這表明裂解事件是真核細胞所特有的。
對BAFF進行Northern印跡分析，結果表明脾臟和PBL中富含2.5kbBAFF mRNA(圖3A)。胸腺，心臟，胎盤，小腸和肺顯示出微弱的表達。這種局限分布暗示淋巴組織中存在的細胞是BAFF的主要來源。通過PCR分析，我們發現BAFF mRNA存在于T細胞和外周血單核細胞-衍生的樹突細胞中，而不存在于B細胞中(圖3B)。甚至首次用于實驗的，未經刺激的T細胞似乎也能表達一些BAFF mRNA。
在包括人BAFF序列的數據庫中發現序列標記位點(STS，SHGC-36171)。該位點被作圖于人染色體13，D13S286與D13S1315標記之間的9cM間隔中。在細胞遺傳圖譜上，該間隔相當于13q32-34。在已知的TNF配體家族成員中，只有RANKL(Trance)被定位于該染色體(22)，但與BAFF(13q14)距離很遠。
為了使配體發揮最大的生物效應，可以在淋巴組織中存在的相同細胞或相鄰細胞上表達BAFF受體(BAFF-R)。使用重組sBAFF作為工具以通過FACS特異性測定BAFF-R表達，我們實際上在多個B細胞系，如Burkitt淋巴瘤Raji和BJAB中發現了高水平的受體表達(圖4A，表1)。與之相反，T細胞，成纖維細胞，上皮細胞和內皮細胞來源的細胞系全為陰性。單核細胞系THP-1觀察到很弱的染色，然而，這可能是由Fc受體結合引起的。因此，BAFF-R表達似乎局限于B細胞系。使用人BAFF為探針，受試的兩個小鼠B細胞系為陰性，但在小鼠脾細胞上觀察到微弱的結合(數據未顯示)。通過分析臍帶和外周血淋巴細胞證實B細胞上存在BAFF-R。盡管CD8+和CD4+T細胞上缺乏BAFF-R(圖4B，數據未顯示)，但在CD19+B細胞上觀察到強染色(圖4A和4B)，這表明所有血液B細胞(包括首次用于實驗的B細胞和記憶B細胞)上都表達BAFF-R。
由于BAFF與來自血液的B細胞結合，進行實驗以測定配體是否傳遞生長-刺激或生長-抑制信號。用抗-IgM(μ)抗體以及穩定表達表面BAFF的經固定的293細胞刺激外周血淋巴細胞(PBL)(圖5A)。對照細胞的存在未改變僅由抗-μ誘導的[3H]胸苷摻入水平，但如果存在經BAFF轉染的細胞，所述水平會增加2倍(圖5B)。當用純化的sBAFF替代經BAFF轉染的細胞時，也可以獲得依賴于劑量的PBL增殖(圖5C)，這表明BAFF不需要與膜結合即可發揮其活性。在此實驗方案中，由sCD40L導致的增殖需要超過1μg/ml的濃度，但相對于由BAFF介導的增殖而言，前者對抗-μ存在的依賴性較小(圖5D)。當將純化的CD19+B細胞與經照射的自身CD19-PBL共培養時，BAFF對增殖的共刺激未受影響，說明[3H]胸苷攝取主要是由B細胞增殖而不是間接刺激另一細胞類型引起的(數據未顯示)。所觀察到的對BAFF反應所致的B細胞增殖完全依賴于抗-u抗體的存在，這表明BAFF作為B細胞增殖的共刺激物起作用。
為了研究BAFF對免疫球蛋白分泌可能造成的影響，通過在存在細胞因子混合物時與EL-4T細胞共培養來預活化純化的外周血或臍血B細胞，所述細胞因子混合物來自經PHA/PMA刺激的T細胞的上清液(23)。重新分離這些B細胞，使其純度達到98％，在存在BAFF和活化的T細胞細胞因子時的次級培養過程中，這些B細胞的分泌Ig相對于僅存在細胞因子時的培養過程中的分泌Ig而言增加2倍。缺乏外源細胞因子時，僅產生很有限的影響，存在重組細胞因子IL-2，IL-4和IL-10時，觀察到中等程度(1.5倍)的影響(圖5E，F)。
對BAFF進行的生物化學分析也與TNF家族成員的典型同三聚體結構一致。在該配體家族中，BAFF與APRIL的序列相似性水平最高，而APRIL最近被我們鑒定為能刺激多種腫瘤細胞生長的配體(11)。與具有相同高同源性(同一性33％)，其基因在染色體6上連鎖的兩個家族成員TNF和LT□不同的是，APRIL和BAFF不在相同染色體上簇集。APRIL位于染色體17(J.L.B.數據未顯示)，而BAFF被作圖于人染色體13的遠側臂上(13q34)。在Burkitt淋巴瘤中，該基因座的異常被鑒定為第二常見的缺陷(24)，而最常見的缺陷是myc基因被轉運至Ig基因座(25)。考慮到所分析的所有Burkitt淋巴瘤細胞系上BAFF-R的高表達水平(見表1)，這增加了令人感興趣的可能性，即一些Burkitt淋巴瘤具有下調的BAFF表達，因此，以自泌的方式刺激生長。
抗原-特異性B淋巴細胞在免疫應答不同階段的作用高度依賴于輔助T細胞和抗原-呈遞細胞，如樹突細胞發出的信號和與這些細胞的接觸(20)。當B淋巴細胞早在免疫應答期間當與淋巴組織中B細胞濾泡邊緣的T細胞相互作用時，就首次接收到這些信號，導致它們增殖和分化成低親和力抗體形成細胞(18)。同時，一些抗原-特異性B細胞也遷移至B細胞濾泡中，為生發中心的形成作出貢獻，生發中心是B細胞增殖，以及親和力成熟和產生記憶B細胞和高親和力漿細胞的另一個位點(19)。
已證實對于B淋巴細胞在T細胞依賴性免疫應答的多個步驟所起的作用而言，由TNF超家族的另一個成員CD40L觸發的信號至關重要。然而，幾項研究清楚地表明CD40L/CD40的相互作用不能解釋B細胞的所有接觸依賴性T細胞輔助。實際上，已證實分離自敲除小鼠或X-連鎖高IgM綜合征患者的CD40L-缺陷型T細胞能成功誘導B細胞增殖并分化成漿細胞。使用抗CD40L的封閉抗體的研究表明分離自人扁桃體的表面IgD陽性B細胞子集以不依賴于CD40的方式對活化的T細胞作出反應而增殖和分化。還證實TNF家族的其它成員，如膜結合TNF和CD30L參與對B細胞的不依賴于CD40和表面Ig的刺激。與我們就BAFF的研究結果類似，已證實只要同時觸發表面Ig受體，就可以用輔助T細胞刺激CD40-缺陷型B細胞增殖，并分化成漿細胞。BAFF以及CD30L和CD40L由T細胞表達，但其新穎性(originality)表現在其也可以由樹突細胞表達，以及其受體在B細胞上的高度特異性定位，這與在很多種不同細胞上表達的CD40，CD30和TNF受體形成對照。這一觀察結果表明B細胞上存在獨立的和特異性的由BAFF-誘導的功能。
BAFF在T細胞-和樹突細胞-誘導的B細胞生長和潛在成熟中的作用，我們發現BAFF共刺激來自于血液的B細胞的增殖，伴隨有B細胞受體的交聯，因此不依賴CD40產生的信號。另外，使用在體外分化成前-漿細胞/GC-樣B細胞的CD19陽性B細胞(14)，我們觀察到在存在活化T細胞的上清液或IL-2，IL-4和IL-10的混合物時，BAFF對這些B細胞的Ig分泌的共刺激作用。有趣的是，存在活化T細胞的上清液時，與細胞因子混合物相比，共刺激作用更強，這表明由活化T細胞分泌的其它可溶性因子參與抗體的產生，它們可以與BAFF或另外的BAFF自身協同作用。因此，BAFF可能對這些GC-樣B細胞分化成漿細胞作出了有效的貢獻。
顯然，在體外，BAFF可以在首次用于試驗的B細胞以及GC樣(committed)B細胞中發信號。是否這一觀察結果能應驗于正常的免疫應答過程，還有待于適當體內實驗的證實。
BAFF在B細胞中誘導的生物應答與CD40L誘導的應答不同，因為由CD40L引發的增殖對抗-μ共刺激物的依賴性較小(17)(圖5D)。另外，CD40L在與B細胞受體相遇之后，可以抵消B細胞中的細胞凋亡信號(29)，而BAFF不能使B細胞系Ramos(盡管其能表達BAFF-R)免遭抗-μ介導的細胞凋亡(表1；F.M.和J.L.B.，未公開觀察結果)。因此很可能CD40L和BAFF完成不同的功能。在此方面，值得注意的是BAFF不能與受試的16種TNF家族重組受體中的任一種，包括CD40相互作用(P.S和J.T.未公開觀察結果)。
用缺乏跨膜結構域的重組可溶性BAFF可有效地共刺激B細胞生長。該活性與幾個TNF家族成員的活性形成對照，這些成員僅能作為膜結合配體發揮活性，例如TRAIL，FasL和CD40L。這些配體的可溶性形式具有微弱的生物活性，所述活性通過交聯可以增加，從而模擬膜結合配體(15)。與之相反，使Flag-標記的sBAFF與抗-Flag抗體交聯，或者使用上皮細胞表面表達的膜結合BAFF不會進一步增加BAFF的促分裂活性，這表明它可以象TNF那樣，作為分泌型細胞因子在全身發揮作用。這與以下的觀察結果一致BAFF莖中存在的多堿序列作為蛋白酶底物起作用。類似的多堿序列也存在于APRIL和TWEAK的相應位置，對它們兩個而言，存在蛋白酶裂解加工的證據(30)(N.H.和J.T.未公開觀察結果)。盡管負責裂解的蛋白酶正有待測定，但它不可能是負責釋放膜結合TNF的金屬蛋白酶，因為它們的序列偏好完全不同(21)。BAFF(R-N-K-R)，APRIL(R-K-R-R)和TWEAK(R-P-R-R)中的多堿基元使人聯想起前蛋白質轉變酶家族原型弗林蛋白酶的基本裂解信號(R-X-K/R-R)(31)。
除非另有說明，本發明的實施將利用細胞生物學，細胞培養，分子生物學，微生物學，重組DNA，蛋白質化學和免疫學的常規技術，這些技術是本領域技術人員所熟知的。所述技術描述于文獻中，例見分子克隆實驗室手冊，第2版(Sambrook，Fritsch和Maniatis編)，冷泉港實驗室出版社，1989；DNA克隆，第I和II卷(D.N.Glover編)，1985；寡核苷酸合成(M.J.Gait編)，1984；美國專利4,683,195(Mullis等)；核酸雜交(B.D.Hames和S.J.Higgins編)，1984；轉錄和翻譯(B.D.Hames和S.J.Higgins編)，1984；動物細胞培養(R.I.Freshney編)，Alan R.Liss公司，1987；固定化細胞和酶，IRL出版社，1986；分子克隆實驗指南(B.Perbal)，1984；酶學方法，第154和155卷(Wu等編)，Academic出版社，紐約；哺乳動物細胞的基因轉移載體(J.H.Miller和M.P.Callos編)，1987，冷泉港實驗室；細胞和分子生物學的免疫化學方法(Mayer和Walker編)，Academic出版社，倫敦，1987；實驗免疫學手冊，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell編)，1986；小鼠胚胎操作方法，冷泉港實驗室出版社，1986。
提供下列實施例是為了闡明本發明，而不應被當成是對本發明的限制。
實施例實施例1-6利用了下列實驗方法。
產生鼠BAFF Tg小鼠的DNA構建體以前已描述過人和鼠BAFF的cDNA序列(Schneider等，1999)。通過RT-PCR產生編碼全長鼠BAFF的PCR片段。根據廠商(GibcoBRL，GrandIsland，紐約)的方法，使用寡dT由小鼠肺polyA+(Clontech，Palo Alto，CA)合成第一條cDNA鏈。PCR反應含有1×Pfu緩沖液(Stratagene，La Jola，CA)，0.2mM dNTP，10％DMSO，12.5pM引物，5個單位的Pfu酶(Stratagene)和具有NotI限制性位點的下列引物5’-TAAGAATGCGGCCGCGGAATGGATGAGTCTGCAAA-3’和5’-TAAGAATGCGGCCGCGGGATCACGCACTCCAGCAA-3’。以94℃ 1分鐘，54℃ 2分鐘和72℃ 3分鐘將模板擴增30個循環，接著于72℃延伸10分鐘。該序列對應于GenBank序列AF119383的核苷酸214至1171。用NotI消化PCR片段，然后克隆至經修飾的pCEP4載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。用XbaI除去含有鼠BAFF的片段以包括SV40polyA添加位點序列。將該片段克隆至基于pUC的載體，所述載體中添加了啟動子序列。啟動子，即含有人ApoE增強子和AAT(α抗-胰蛋白酶)啟動子的1Kb平端BglII-NotI片段純化自質粒克隆540B(華盛頓大學(St.Louis，MO)的Katherine Parker Ponder博士饋贈)。EcoRV/BglII片段純化自最終的載體，并用于產生轉基因小鼠。使C57BL/6J雌性×DBA/2J雄性F1(BDF1)小鼠的經注射后代與C57BL/6小鼠回交。顯微注射和產生轉基因小鼠的技術已有人描述(Mcknights等，1983)。
分析方法使用線性12.5％凝膠對血清樣品進行還原型SDS-PAGE分析。根據廠商說明，使用Promega(Madison，WI)的分離試劑盒制備小鼠肝臟的總RNA，并進行加工以進行Northern印跡分析。使用跨越轉基因構建體的SV40 poly A尾的探針檢測BAFF轉基因-特異性的mRNA，通過用XbaI和BamHI消化經修飾的pCEP4載體得到所述mRNA。該探針識別對應于BAFF轉基因的mRNA的1.8-2Kd帶。在含有1×Taq聚合酶緩沖液(Stratagene)，0.2nMdNTP，10％DMSO和5個單位的Taq聚合酶(Stratagene)的反應中，使用12.5pM的下列引物5’-GCAGTTTCACAGCGATGTCCT-3’和5’-GTCTCCGTTGCGTGAAATCTG-3’對BAFF Tg小鼠的尾DNA進行PCR分析。以94℃ 30秒，54℃ 1分鐘和72℃ 1.5分鐘將719bp的轉基因擴增35個循環，接著于72℃延伸10分鐘。
使用用于分析尿的Multistix 10 SG試劑條(拜耳公司，診斷試劑部，Elkhart，IN)測定小鼠尿液中蛋白質的存在。
細胞-dyn和細胞熒光測定分析(FACS)用Abbott Cell Dyne 3500儀器(芝加哥，IL)對新鮮的EDTA抗凝全血進行示差WBC計數。為了進行FACS分析，從Pharmingen(San Diego，CA)購得熒光素(FITC)-，Cy-chrome-和藻紅蛋白-(PE)-標記的大鼠抗-小鼠抗體抗-B220，抗-CD4，抗-CD8，抗-CD43，抗-IgM，抗-CD5，抗-CD25，抗-CD24，抗-CD38，抗-CD21，抗-CD44，抗-L-選擇蛋白和倉鼠抗-Bcl-2/對照倉鼠Ig試劑盒。得自重組大腸桿菌以及哺乳動物細胞的人和小鼠經Flag-標記的BAFF的產生曾被描述過(Schneider等，1999)。所有抗體根據廠商說明使用。按下述從小鼠血液中純化PBL在含有EDTA的小管中收集小鼠血液，用PBS稀釋一倍。將500□l經稀釋的血液上樣于4ml玻璃管中的1ml菲可(Celardane，Hornby，Ontario，加拿大)的上方，將該梯度室溫2000rpm離心30分鐘，收集含有淋巴細胞的界面，用PBS洗滌2次，然后進行FACS染色。在RPMI培養基(Life Technologies公司，Grand Island，紐約)中將脾臟，骨髓和腸系膜淋巴結磨成單細胞懸浮液，用FACS緩沖液(添加有2％胎牛血清(JRH Biosciences，Lenexa，KS)的PBS)洗滌。首先將細胞懸浮于添加有下列封閉試劑的FACS緩沖液10□g/ml人Ig(Sandoz，Basel，瑞士)和10□g/ml抗-小鼠Fc封閉抗體(Pharmingen)，在冰上保溫30分鐘，然后用經熒光染料標記的抗體進行染色。所有抗體用含有上述封閉試劑的FACS緩沖液稀釋。樣品使用FACScan細胞熒光計(Becton Dickinson)分析。
通過ELISA試驗檢測小鼠血清中的小鼠總Ig和類風濕因子于4℃，用含有10□g/ml山羊抗-小鼠總Ig溶液(Southern BiotechnologyAssociates公司，Birmingham，AL)的50mM碳酸氫鈉緩沖液，pH9.6將ELISA板(Corning glass works，Corning，紐約)包被過夜。用PBS/0.1％吐溫將板洗滌3次，并用含有1％明膠的PBS封閉過夜。在板中加入100□l/孔血清連續稀釋液或標準稀釋液，于37℃放置30分鐘。于37℃，使用100□l/孔1□g/ml經堿性磷酸酶(AP)-標記的山羊抗-小鼠總Ig溶液(Southern BiotechnologyAssociates)檢測小鼠Ig 30分鐘。用PBS/0.1％吐溫將板洗滌3次，最后一次洗滌之后，使用含有10□g/ml對硝基苯磷酸(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)的10％二乙醇胺溶液顯色酶反應。通過加入100□l3NNaOH/孔終止反應。使用得自Molecular Devices(Sunnyvale，CA)的分光光度計測定405nm下的光密度(O.D.)。使用購自Southern Biotechnology Associates的純化的小鼠Ig得到標準曲線。當檢測類風濕因子(RF)時，用正常的山羊Ig(Jackson ImmunoResearch laboratories公司，West Grove，PA)替代山羊抗-小鼠Ig來包被ELISA板，按上述檢測小鼠Ig。使用經AP-標記的山羊抗-小鼠IgA，IgM，IgG2a，IgG2b和IgG3在RF試驗中檢測小鼠同種型，并使用純化的小鼠IgA，IgM，IgG2a，IgG2b和IgG3(Southern Biotechnology Associates)繪制標準曲線。通過分析方差進行所有統計學比較。
檢測循環免疫復合物(CIC)并沉淀小鼠血清中的冷球蛋白試驗按前人所述(June等，1979；Singh和Tingle，1982)，作下列改動來進行于4℃，用含有5□g/ml人Clq(Quidel，San Diego，CA)的50mM碳酸氫鈉緩沖液，pH9.6將ELISA板(Corning glass works)包被過夜。用PBS/0.1％吐溫將板洗滌3次。在板中加入50□l/孔0.3M EDTA，加上50□l/孔血清連續稀釋液或已知濃度的標準免疫復合物(得自DAKO(Carpinteria，CA)的過氧化物酶-小鼠抗-過氧化物酶(PAP))溶液。將板置于37℃保溫30分鐘，用PBS/0.1％吐溫將板洗滌3次。按上文ELISA試驗中所述，使用100□l/孔1□g/ml經AP標記的山羊抗-小鼠Ig溶液(Southern Biotechnology Associates公司)檢測免疫復合物中的小鼠Ig。通過于4℃將用水稀釋15倍的小鼠血清保溫過夜來檢測冷球蛋白，用肉眼對沉淀物進行評分。
抗-雙鏈(ds)和單鏈(ss)DNA試驗使用NUNC-immuno Plate MaxiSorp板(NUNC A/S，丹麥)進行抗-ssDNA試驗。于4℃，首先用100□g/ml甲基化的BSA(Calbochem公司，La Jolla，CA)，接著用50□g/ml I級小牛胸腺DNA(Sigma，St.Louis，MO)將板包被過夜。通過超聲處理剪切小牛胸腺DNA，然后用S1核酸酶消化待用。為了進行抗-ssDNA試驗，將DNA煮沸10分鐘，在冰上冷卻待用。封閉之后，加入經連續稀釋的血清樣品，室溫下保溫2小時。用山羊抗-小鼠IgG-AP(Sigma)檢測自身抗體，按上文ELISA試驗中所述進行顯色。使用同時特異于ss-和ds DNA的已知量的抗-DNA mAb 205得到標準曲線(Datta等，1987)。
免疫組織化學在O.C.T.包埋介質(Miles，Elkhart，IN)中冷凍脾臟和淋巴結并封固以備恒冷切片。在丙酮中干燥和固定7-10□m厚的切片。用Tris-緩沖鹽水A(TBS-A，0.05M Tris，0.15M NaCl，0.05％吐溫-20(v/v)，0.25％BSA)稀釋之后，在室溫下，在濕盒中將所有Ab(10□g/ml)保溫1小時，用TBS-B(0.05M Tris，0.15MNaCl，0.05％吐溫-20)浸洗，并在甲醇中固定1分鐘，然后開始進行酶反應。分別使用二氨基聯苯胺(DAB)片劑底物試劑盒(Sigma)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮藍四唑(BCIP/NBT，Pierce，Rockford，IL)顯色辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)的活性。最后用甲醇將經染色的組織切片固定5分鐘，用吉姆薩(Fluka，Buchs，瑞士)進行復染。經生物素標記的抗體，大鼠抗-B220，抗-CD11c，抗-多配體蛋白聚糖-1以及未經標記的大鼠抗-CD4，抗-CD8□和抗-CD8□購自Pharmingen。經生物素標記的花生凝集素(PNA)得自Vector實驗室(Burlingame，CA)。(HRP)-標記的小鼠抗-大鼠Ig和(HRP)-鏈霉抗生物素蛋白購自Jackson ImmunoResearch laboratories公司，經AP-標記的鏈霉抗生物素蛋白購自Southern Biotechnology Associates公司。當對腎臟組織進行免疫組化分析以檢測Ig沉積時，使用石蠟切片，脫蠟，用經稀釋的得自Vector(Burlingame，CA)的馬血清進行封閉，然后用得自JacksonImmunoResearch的HRP-山羊抗-小鼠Ig染色。按上述進行檢測。
實施例1BAFF轉基因(BAFF Tg)起始(founder)小鼠具有異常表型使用具有APOE增強子的肝臟特異性α-1抗胰蛋白酶啟動子，在轉基因小鼠中表達全長鼠BAFF。選擇全長形式，希望BAFF能被裂解并在全身起作用，或者如果以膜結合形式保留的話，能觀察到可能提供功能線索的局部肝臟特異性異常。我們得到了13只BAFF轉基因陽性的起始小鼠(表2)。其中的4只小鼠在幼年時死亡。對小鼠811和816進行常規的病理學研究(表2)。這些小鼠中沒有明顯的感染；然而，心血管和腎臟異常很明顯，其與嚴重高血壓的異常(Fu，1995)類似(表2)。起始小鼠816的用蘇木精和伊紅(H&E)-染色的腎臟組織切片表明該小鼠腎小球形態學的異常，而其余腎臟組織看上去是正常的(信息未顯示)。很多BAFF轉基因起始小鼠具有蛋白尿癥(表2)。對小鼠816的脾臟冷凍組織切片進行免疫組化分析，結果顯示出異常和密集的B細胞染色和減少的T細胞染色，在后代中證實了這一觀察結果(見下文，圖12)。
使用雙色FACS分析，計算出B220陽性B細胞的百分比與CD4陽性T細胞的百分比相比的比例。當與陰性BDF1小鼠對照相比時，BAFF Tg起始小鼠中的該比例要高2至7倍(表2)，這表明BAFF Tg小鼠中B細胞群體的增加。我們選擇9只這樣的起始小鼠來產生表2中下劃線的不同轉基因小鼠品系。其余的BAFF Tg起始小鼠或其繁衍的后代在起始小鼠696，700，811和816早期死亡之后，無一顯示出任何患病的跡象，這表明這4只小鼠可能表達了導致它們死亡的較高水平的BAFF。通過Northern印跡分析證實了轉基因小鼠肝臟中BAFF的過量表達(數據未顯示)。在經過組織學檢查的所有BAFF-Tg小鼠中，肝臟未顯示出異常，這說明局部過量表達BAFF不會導致任何免疫學或病理學事件。未對鼠BAFF進行ELSA試驗然而，我們證實得自BAFF Tg小鼠，而不是對照小鼠的2％血清封閉了由哺乳動物細胞-得到的小鼠可溶性Flag-標記型BAFF與BJAB細胞的結合。另外，得自BAFF Tg小鼠，而不是對照小鼠的5％血清在抗-□存在下增加了得自PBL的人B細胞的增殖(數據未顯示)。這些數據表明BAFF Tg的血液中存在大量可溶性的BAFF。
實施例2BAFF Tg小鼠外周血淋巴細胞增多歸因于B細胞數目的提高當與陰性同窩對照小鼠相比時，轉基因小鼠群體的血液中具有更多的淋巴細胞，其數目高達每□升血液中有13000個淋巴細胞(圖7A)。相反，BAFFTg小鼠和對照小鼠每□升血液中的粒細胞數目保持在正常的限度內(圖7A)。由6只不同起始小鼠繁殖出的18只BAFF Tg小鼠的外周血細胞(PBL)，因用抗-CD4和抗-B220抗體對它們進行的ACS分析顯示出B/T比增加(圖7B和7C)，故淋巴細胞水平的提高是由B細胞子集的擴展引起的。類似地，使用該方法計算出CD4循環T細胞的絕對數目，揭示出當與對照小鼠相比時，BAFF Tg小鼠中的該T細胞子集減少50％，CD8 T細胞子集也有相同的觀察結果(數據未顯示)。當與對照小鼠的B細胞相比時，來自BAFF Tg小鼠PBL的所有B細胞具有增加的MHC II類和Bcl-2表達(分別為圖7D和7E)，這表明BAFF Tg小鼠PBL中存在一定水平的B細胞活化。BAFF Tg小鼠血液中的T細胞不表達早期活化標記CD69或CD25；然而，40至56％的CD4或CD8 T細胞是具有CD44hi，L-選擇蛋白lo表型的活化的效應T細胞，而同窩對照小鼠中的該比例僅為8％至12％(圖7F)。因此，BAFF Tg小鼠明顯顯示出B細胞淋巴細胞增多和總體B細胞活化以及T細胞改變的跡象。
實施例3擴展的B細胞區室由成熟細胞組成為了研究轉基因小鼠中BAFF的過量表達是否會影響骨髓中央和次級淋巴器官外周的B細胞區室，我們通過FACS檢查了衍生自4只不同起始小鼠的總共7只BAFF Tg小鼠和7只同窩對照小鼠的脾臟，骨髓和腸系膜淋巴結。成熟B細胞區室通過用抗-B220和抗-IgM抗體染色分析。圖8中顯示了兩只代表性的BAFF Tg小鼠和一只代表性的同窩對照小鼠。在脾臟和腸系膜淋巴結中，成熟B細胞區室(IgM+，B220+)都有所增加(圖8A，分別為上方和下方的實驗組)。分析B220+/IgM+B細胞(圖7A，中間的實驗組)或骨髓中的原(pro)B細胞(CD43+/B220+)和前(pre)B細胞(CD43-/B220+)區室(圖8B)，顯示出BAFF Tg小鼠和同窩對照小鼠是類似的。這些數據表明BAFF的過量表達影響到外周成熟B細胞而不是骨髓祖代B細胞的增殖。通過FACS分析脾臟中的B細胞亞群，結果表明與對照小鼠相比，BAFF Tg小鼠中邊緣區(MZ)B細胞的比例增加(表3)。在BAFF Tg和對照小鼠中，濾泡B細胞群體保持一定的比例，而BAFF Tg小鼠中新形成的B細胞組分略有減少(表3)。分別使用抗-CD38對抗-CD24抗體和抗-IgM對抗-IgD抗體，按文獻(Oliver等，1997)所述，分析MZ B細胞群體的CD38hi/CD24+和IgMhi/IgDlo表型，也在B220+脾臟B細胞中證實了上述結果(數據未顯示)。使用抗-小鼠IgM抗體進行免疫組化分析，顯示出當與對照小鼠相比時，BAFF Tg小鼠脾臟中IgM-明亮的(bright)MZ B細胞區域的擴大(數據未顯示)。與對照小鼠相比，所有BAFF Tg B220+脾臟B細胞也表達較高水平的MHC II類(表3)和Bcl-2(數據未顯示)，這表明脾臟B細胞以及PBL中的B細胞處于活化狀態。
實施例4BAFF Tg小鼠在其血清中具有高水平的總免疫球蛋白，類風濕因子和循環免疫復合物
BAFF Tg小鼠中增加的B細胞區室表明這些動物的血液中總Ig水平也有所增加。通過SDS-PAGE分析BAFF Tg小鼠和同窩對照小鼠的血清，證實與對照血清相比，4只BAFF Tg小鼠中的3只中的重鏈和輕鏈IgG帶濃度至少高出10倍(圖9A)。類似地，對BAFF Tg小鼠的血清進行ELISA檢測，與對照小鼠相比，顯示出顯著較高的總Ig水平(圖9B)。
盡管通過SDS-PAGE觀察到高水平，但通過ELISA測定在一些小鼠，如697-5，816-8-3和823-20中觀察到過高的水平，導致我們懷疑血清中是否存在類風濕因子(RF)或針對IgG Fc片段上的抗原決定簇的自身抗體(Jefferis，1995)。這些抗體可與用于包被ELISA板的山羊抗-小鼠Ig結合，給出錯誤的高值。用正常的不相關的山羊Ig包被ELISA板，測定BAFF Tg Ig與正常山羊Ig的結合。圖9C證實大多數BAFF Tg小鼠的血清中都含有能與正常山羊Ig反應的Ig，而19只對照小鼠中只有兩只在相同的試驗中表現出活性。這些RF主要是IgM，IgA和IgG2a同種型(數據未顯示)。
RF的存在與血液中高水平的循環免疫復合物(CIC)和冷球蛋白的存在相關(Jefferis，1995)。為了證實BAFF Tg小鼠是否具有異常的血清CIC水平，使用基于Clq的結合試驗檢測上文分析的21只BAFF Tg小鼠中的CIC。當與對照小鼠相比時，只有5只BAFF Tg顯示出顯著高的CIC水平，然而，這些小鼠對應于具有最高總Ig和類風濕因子水平的動物(圖9D)。當用水將BAFF Tg小鼠血清而不是對照血清稀釋15倍時，我們也觀察到沉淀的形成，這表明這些小鼠中存在冷球蛋白(數據未顯示)。因此，除了B細胞增生外，BAFF Tg小鼠還顯示出嚴重的與RF和CIC相關的血球蛋白過多癥。
實施例5一些BAFF Tg小鼠具有高水平的抗-單鏈(ss)和雙鏈(ds)DNA自身抗體起初，我們在兩個起始小鼠中觀察到讓人聯想到狼瘡-樣疾病的腎臟異常(表II)。抗-DNA自身抗體的存在也已在SLE患者或SLE-樣(SWR×NZB)F1(SNF1)小鼠中得以描述(Datta等，1987)。在曾被證實具有最高水平的總血清Ig的BAFF Tg小鼠中檢測到抗-ssDNA自身抗體水平(圖10A)。我們分析了兩只抗ssDNA抗體為陰性的BAFF Tg小鼠(697-5和816-1-1)和3只能分泌抗-ssDNA抗體的轉基因小鼠(820-14，816-8-3和820-7)，以及5只同窩對照小鼠的血清中抗dsDNA抗體的存在。BAFF Tg小鼠也分泌抗-dsDNA，然而，分泌水平不總是與抗-ssDNA抗體的分泌水平相關，因為不含有可測水平的抗-ssDNA抗體的BAFF Tg小鼠697-5的血清顯然存在抗-dsDNA(圖10B)。因此，顯示出最嚴重的血球蛋白過多癥的BAFF Tg小鼠分泌病理學水平的抗-DNA自身抗體。另外，也讓人聯想到這些小鼠中的狼瘡-樣問題，我們檢測了所分析的6只BAFF Tg小鼠腎臟中的免疫球蛋白沉積(圖10C)，其中的3只小鼠不能分泌可測水平的抗-DNA抗體(數據未顯示)。
實施例6BAFF Tg小鼠的脾臟和腸系膜淋巴結(MLN)中具有膨大的B細胞濾泡，多個生發中心，減少的樹突細胞數目和增加的漿細胞數目BAFF Tg具有大脾臟，MLN(數據未顯示)和Peyer’s淋巴集結(圖11)。免疫組化分析顯示出BAFF Tg小鼠中膨大的B細胞濾泡和減少的外周小動脈淋巴sheet(PALS或T細胞區域)的存在(圖12B)。有趣的是，在未經免疫的同窩對照小鼠中觀察到很少幾個生發中心(一般在該集落中具有典型性)，那些存在的生發中心較小(圖12C)，而BAFF Tg小鼠在缺乏免疫時具有多個生發中心(圖12D)。抗-CD11c對對照小鼠的T細胞區和邊緣區中的樹突細胞染色(圖12E)在BAFF Tg小鼠中大大降低(圖12F)。在同窩對照小鼠的脾臟中幾乎檢測不到多配體聚糖-1-陽性漿細胞(圖12G)，而BAFF Tg小鼠的紅髓為多配體聚糖-1-強陽性(圖12H)。在MLN中獲得很類似的觀察結果(圖13)。BAFFTg小鼠的MLN與正常淋巴結相比，其中的B細胞區域顯著擴大(圖13B)，而在正常淋巴結中，可在淋巴結外周的囊下方輕易識別出B細胞濾泡以及典型的副皮質T細胞區(圖13A)。BAFF Tg小鼠的MLN髓質充滿多配體聚糖-1陽性細胞，它們有可能是漿細胞(圖13H)。結論是，對BAFF Tg小鼠中二級淋巴器官的分析與顯示多細胞異常以及強免疫應答的擴大的B細胞表型一致。
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表IBAFF-R在不同細胞系中的表達細胞類型 細胞系MARCH結合 特別的細節上皮樣細胞HT-29- 結腸腺癌A375 -/+ 黑色素瘤MCF-7- 乳腺癌ME260- 黑色素瘤Cos + 猴腎細胞成纖維細胞WI-38- 肺Hs-68- 包皮Hs-27- 包皮內皮細胞 HUVEC- 臍靜脈巨噬細胞/單核細胞 THP-1-/+ 單核細胞細胞系Molt-4 - 成淋巴細胞白血病Hut-78 - 皮膚淋巴瘤Jurkat - 成淋巴細胞白血病細胞系BJAB +++ Burkitt淋巴瘤Namalawa ++ Burkitt淋巴瘤Dandi+/- Burkitt淋巴瘤EBNA+VCA+Ramos++ Burkitt淋巴瘤EBV-Raji +++ Burkitt淋巴瘤JIYOYE + Burkitt淋巴瘤SKW.64 ++ LgM分泌型EBV+RPMI1788 +++ 外周血，IgM分泌型IM-9 +++ 成淋巴細胞，Ig分泌型NC-37+++ 成淋巴細胞，EBV+小鼠細胞系WEHI-231 - B細胞淋巴瘤A20 - B細胞淋巴瘤按“材料和方法”中所述，使用FLAG-標記的MARCH，經FACS測定MARCH的表面表達。
表IIBAFF轉基因起始小鼠列表小鼠數目 蛋白尿癥aR/Tb690雌性dND2696雄性cNDND697雌性+++ ND700雄性cNDND802雄性++4.6804雌性+++ 5.4807雌性ND4810雄性+++ 7.8811雄性c/eNDND813雄性+ 5.4816雌性e/f++ND820雄性4+3823雄性++2.9BDF1雌性對照 +/- 1.5BDF1雄性對照 +/- 2.5a蛋白尿癥用浸沒于小鼠尿中的醫學顯色條測定-無蛋白尿癥，+/-痕量，+(30mg/dl)，++(100mg/dl)，+++(300mg/dl)，++++(＞2000mg/dl)。bB/T經FACS分析，用PE-標記的抗B220和FTTC-標記的抗CD4進行復染所測定的PBL中B細胞百分比對T細胞百分比的比例。c早期急性死亡d后代中無轉基因傳遞。e尸檢期間觀察到的心血管和腎臟異常。f小鼠因尿中見血而處死。對所有組織的H&E-切片的分析顯示，心臟、腎臟和動脈異常很明顯。用生物素標記的抗小鼠B220和抗小鼠CD4，接著用堿性磷酸酶標記的鏈霉抗生物素蛋白和辣根過氧化物酶標記的抗大鼠Ig對冰凍切片進行免疫組化分析，測得脾臟B細胞群增加。下劃線小鼠用于育種ND未做表3B細胞上增加的MHC II類表達和BAFF Tg小鼠脾臟中增大的MZB細胞比例B220+B細胞上MHC ％濾泡B細胞 ％MZB細胞 ％新形成的B細胞II類的表達水平(MFI) (B220+/IgMlo/CD21int) (B220+/IgMhi/CD21hi) (B220+/IgMhi/CD21lo)對照小鼠816-1-10 1170 45 6 12802-21 1029 48 10.59823-11240 39 9 6.5Baff Tg小鼠802-61707 49 18 5.9820-71900 39 23 6.3816-1-1 2088 40 23 5.8脾細胞用FACS分析并選通于B220+群體。所示為代表性實驗。MFI熒光強度的平均值
權利要求
1.刺激動物B細胞生長的方法，所述方法包括施用治療有效量的選自下列的組合物的步驟(a)BAFF配體或其活性片斷；(b)BAFF配體或其活性片斷和抗-μ抗體；(c)BAFF配體或其活性片斷和CD40配體；和(d)BAFF配體或其活性片斷和抗-CD40配體分子。
2.刺激動物產生免疫球蛋白的方法，所述方法包括施用治療有效量的選自下列的組合物的步驟(a)BAFF配體或其活性片斷；(b)BAFF配體或其活性片斷和抗-μ抗體；(c)BAFF配體或其活性片斷和CD40配體；和(d)BAFF配體或其活性片斷和抗-CD40配體分子。
3.共刺激動物中B細胞生長和免疫球蛋白產生的方法，所述方法包括施用治療有效量的選自下列的組合物的步驟(a)BAFF配體或其活性片斷；(b)BAFF配體或其活性片斷和抗-μ抗體；(c)BAFF配體或其活性片斷和CD40配體；和(d)BAFF配體或其活性片斷和抗-CD40配體分子。
4.刺激樹突細胞-誘導的B細胞生長和成熟化的方法，所述方法包括施用治療有效量的選自下列的組合物的步驟(a)BAFF配體或其活性片斷；(b)BAFF配體或其活性片斷和抗-μ抗體；(c)BAFF配體或其活性片斷和CD40配體；和(d)BAFF配體或其活性片斷和抗-CD40配體分子。
5.根據權利要求1-4的方法，其中BAFF配體是可溶性BAFF配體。
6.根據權利要求5的方法，其中可溶性BAFF配體是重組BAFF配體。
7.根據權利要求1-4的方法，其中抗-CD40分子是單克隆抗體。
8.根據權利要求1-4的方法，其中動物源自哺乳動物。
9.根據權利要求8的方法，其中哺乳動物是人。
10.抑制動物中B細胞生長的方法，所述方法包括施用治療有效量的選自下列的組合物的步驟(a)抗-BAFF配體分子或其活性片斷；(b)重組的，無正常功能的BAFF配體分子或其活性片斷；(c)特異于BAFF配體或其活性片斷的抗體；和(d)特異于BAFF配體受體或其表位的抗體。
11.抑制動物產生免疫球蛋白的方法，所述方法包括施用治療有效量的選自下列的組合物的步驟(a)抗-BAFF配體分子或其活性片斷；(b)重組的，無正常功能的BAFF配體分子或其活性片斷；(c)特異于BAFF配體或其活性片斷的抗體；和(d)特異于BAFF配體受體或其表位的抗體。
12.共抑制動物中B細胞生長和免疫球蛋白產生的方法，所述方法包括施用治療有效量的選自下列的組合物的步驟(a)抗-BAFF配體分子或其活性片斷；(b)重組的，無正常功能的BAFF配體分子或其活性片斷；(c)特異于BAFF配體或其活性片斷的抗體；和(d)特異于BAFF配體受體或其表位的抗體。
13.抑制動物中樹突細胞-誘導的B細胞生長和成熟化的方法，所述方法包括施用治療有效量的選自下列的組合物的步驟(a)抗-BAFF配體分子或其活性片斷；(b)重組的，無正常功能的BAFF配體分子或其活性片斷；(c)特異于BAFF配體或其活性片斷的抗體；和(d)特異于BAFF配體受體或其表位的抗體。
14.根據權利要求10-13的方法，其中抗-BAFF配體是可溶性的。
15.根據權利要求14的方法，其中可溶性的抗-BAFF配體是重組抗-BAFF配體。
16.根據權利要求10-13的方法，其中抗-BAFF抗體是單克隆抗體。根據權利要求10-13的方法，其中抗-BAFF受體抗體是單克隆抗體。
17.治療自身免疫病的方法，所述方法包括施用治療有效量的選自下列的組合物的步驟(a)BAFF配體或其活性片斷；(b)BAFF配體或其活性片斷和抗-μ抗體；(c)BAFF配體或其活性片斷和CD40配體；和(d)BAFF配體或其活性片斷和抗-CD40配體分子；(e)抗-BAFF配體分子或其活性片斷；(f)重組的，無正常功能的BAFF配體分子或其活性片斷；(g)特異于BAFF配體或其活性片斷的抗體；和(h)特異于BAFF配體受體或其表位的抗體。
18.治療與BAFF-配體相關的疾病的方法，所述方法包括下列步驟(a)在所需細胞中導入治療有效量的載體，所述載體含有編碼BAFF-相關分子的基因；和(b)在所述細胞中表達所述基因。
19.根據權利要求18的方法，其中BAFF-相關分子選自(a)BAFF配體或其活性片斷；(b)BAFF配體或其活性片斷和抗-μ抗體；(c)BAFF配體或其活性片斷和CD40配體；和(d)BAFF配體或其活性片斷和抗-CD40配體分子；(e)抗-BAFF配體分子或其活性片斷；(f)重組的，無正常功能的BAFF配體分子或其活性片斷；(g)特異于BAFF配體或其活性片斷的抗體；和(h)特異于BAFF配體受體或其表位的抗體。
20.根據權利要求17-19的方法，其中BAFF配體是可溶性BAFF配體。
21.根據權利要求20的方法，其中可溶性BAFF配體是重組BAFF配體。
22.根據權利要求17-19的方法，其中抗-CD40分子是單克隆抗體。
23.根據權利要求17-19的方法，其中抗-BAFF配體是可溶性的。
24.根據權利要求23的方法，其中可溶性的抗-BAFF配體是重組抗-BAFF配體。
25.根據權利要求17-19的方法，其中抗-BAFF抗體是單克隆抗體。
26.根據權利要求17-19的方法，其中抗-BAFF受體抗體是單克隆抗體。
27.誘導細胞死亡的方法，所述方法包括施用能干擾BAFF-配體與受體結合的藥劑。
28.治療，抑制或改變涉及BAFF-配體及其受體之間信號傳導途徑的免疫應答的方法，所述方法包括施用有效量的藥劑的步驟，所述藥劑能干擾BAFF-配體與其受體之間的結合。
29.抑制炎癥的方法，所述方法包括施用治療有效量的特異于BAFF-配體或其活性片斷的抗體的步驟。
30.抑制炎癥的方法，所述方法包括施用治療有效量的特異于BAFF-配體受體或其表位的抗體的步驟。
31.調節造血細胞發育的方法，所述方法包括施用治療有效量的BAFF-配體或其活性片斷的步驟。
32.治療，抑制或改變涉及BAFF-配體及其受體之間信號傳導途徑的免疫應答的方法，所述方法包括施用有效量的藥劑的步驟，所述藥劑能干擾BAFF-配體與其受體之間的結合。
33.治療動物高血壓的方法，所述方法包括施用治療有效量的B-細胞生長抑制劑的步驟。
34.根據權利要求33的方法，其中B-細胞生長抑制劑選自(e)(a)抗-BAFF配體分子或其活性片斷；(f)重組的，無正常功能的BAFF配體分子或其活性片斷；(g)特異于BAFF配體或其活性片斷的抗體；和(h)特異于BAFF配體受體或其表位的抗體。
35.根據權利要求34的方法，其中抗-BAFF配體是可溶性的。
36.根據權利要求35的方法，其中可溶性的抗-BAFF配體是重組抗-BAFF配體。
37.根據權利要求34的方法，其中抗-BAFF抗體是單克隆抗體。
38.根據權利要求34的方法，其中抗-BAFF受體抗體是單克隆抗體。
39.根據權利要求34的方法，其中動物源自哺乳動物。
40.根據權利要求39的方法，其中哺乳動物是人。
41.治療動物高血壓的方法，所述方法包括施用治療有效量的B-細胞生長和免疫球蛋白分泌的共抑制劑的步驟。
42.治療動物心血管病的方法，所述方法包括施用治療有效量的B-細胞生長抑制劑的步驟。
43.治療動物心血管病的方法，所述方法包括施用治療有效量的B-細胞生長和免疫球蛋白產生的共抑制劑的步驟。
44.治療動物腎病的方法，所述方法包括施用治療有效量的B-細胞生長抑制劑的步驟。
45.治療動物腎病的方法，所述方法包括施用治療有效量的B-細胞生長和免疫球蛋白產生的共抑制劑的步驟。
46.臺療B-細胞淋巴-增生性疾病的方法，所述方法包括施用治療有效量的B-細胞生長抑制劑的步驟。
47.刺激B-細胞產生以治療免疫抑制疾病的方法，所述方法包括施用治療有效量的選自下列的組合物的步驟(e)BAFF配體或其活性片斷；(f)BAFF配體或其活性片斷和抗-μ抗體；(g)BAFF配體或其活性片斷和CD40配體；和(h)BAFF配體或其活性片斷和抗-CD40配體分子；(i)抗-BAFF配體分子或其活性片斷；(j)重組的，無正常功能的BAFF配體分子或其活性片斷；(k)特異于BAFF配體或其活性片斷的抗體；和(l)特異于BAFF配體受體或其表位的抗體。
48.刺激B-細胞產生以治療免疫抑制疾病的方法，所述方法包括施用治療有效量的選自下列的組合物的步驟(i)BAFF配體或其活性片斷；(j)BAFF配體或其活性片斷和抗-μ抗體；(k)BAFF配體或其活性片斷和CD40配體；和(l)BAFF配體或其活性片斷和抗-CD40配體分子；(m)抗-BAFF配體分子或其活性片斷；(n)重組的，無正常功能的BAFF配體分子或其活性片斷；(o)特異于BAFF配體或其活性片斷的抗體；和
49.根據權利要求48的方法，其中免疫抑制疾病是HIV。
50.根據權利要求49的方法，其中免疫抑制疾病與器官移植相關。
全文摘要
本發明提供了治療或預防與BAFF的表達相關的疾病的方法,所述BAFF包括BAFF及其片斷,抗體,激動劑和拮抗劑。
文檔編號A61P31/18GK1347326SQ00805487
公開日2002年5月1日 申請日期2000年1月25日 優先權日1999年1月25日
發明者杰弗里·布朗寧, 克里斯廷·安布羅斯, 費比尼·麥凱, 朱格·肖普, 帕斯卡爾·施耐德 申請人:比奧根公司, 阿波泰克股份有限公司