發酵棉籽蛋白及固態好氧發酵制備發酵棉籽蛋白的方法
【專利摘要】本發明屬于微生物發酵技術領域，具體涉及一種發酵棉籽蛋白及固態好氧發酵制備發酵棉籽蛋白的方法。本發明要解決的技術問題是是提供一種發酵棉籽蛋白。該發酵棉籽蛋白由以下重量配比的原料發酵而成：棉粕粉97～99份、玉米粉0～1.5份、混合酵母菌固體菌種0.7～1.5份、混合營養鹽0.1～0.4份、混合酶制劑0.03～0.1份、水；水的總重量占其它五種原料總重量的0.6～0.9倍。而發酵棉籽蛋白的固態好氧發酵制備方法，則主要包括以下步驟：取各原料混合均勻，在好氧狀態下于30～35℃下發酵45～48h，干燥即可。本發明方法可以有效地除去棉粕中的棉酚和抗營養因子，為棉粕的有效利用提供了一條更好的方式。CGMCC No.17
【專利說明】
發酵棉籽蛋白及固態好氧發酵制備發酵棉籽蛋白的方法
技術領域
[0001 ]本發明屬于制備微生物發酵技術領域，具體涉及一種發酵棉籽蛋白及固態好氧發 酵制備發酵棉籽蛋白其制備方法。
【背景技術】
[0002] 目前我國養殖業嚴重依賴玉米-豆柏型日糧，特別是主要蛋白質原料豆柏，絕大部 分為進口，受制于國際市場，常造成養殖成本大幅波動，風險增大。另外，進口豆柏中含有轉 基因成分，不符合有機農產品的要求。
[0003] 棉柏為棉籽榨油后的副產物，營養成分豐富，蛋白在40%以上，氨基酸組成較平 衡，精氨酸含量高于豆柏。我國每年棉柏產量約600萬噸，資源量全球第一，但棉柏含有較多 有毒的棉酚及抗營養因子，限制了其在動物日糧中的應用。
[0004] 棉酚主要存在于棉仁色素腺體內，是一種不溶于水而溶于有機溶劑的黃褐色聚酚 色素。在制油過程中，由于蒸炒，壓榨等熱作用，大部分棉酚與蛋白質、氨基酸結合而變成結 合棉酚，結合棉酚在動物消化道內不被動物吸收，故毒性很小。另一部分棉酚則以游離形式 存在，對動物毒性較大，尤其單胃動物過量攝取或攝取時間較長，可導致生長遲緩、繁殖性 能及生產性能下降，甚至導致死亡。幼小動物對棉酚的耐受能力更低。未經處理的棉柏中游 離棉酚含量在800~1100mg/kg。由于毒性棉酚的存在，棉柏在畜禽飼料中的使用量為3~ 6%，幼畜禽一般不使用棉柏。
[0005] 目前商業化棉籽蛋白產品僅有采用有機溶劑浸提的脫酚棉柏，游離棉酚含量可在 400mg/kg以下，但浸提法會造成部分營養物質的流失。
[0006] 而現有技術采用的生物處理方法主要是厭氧微生物發酵法，但是如果要要同時兼 顧脫毒和消除抗營養因子、提高消化吸收率、提高營養價值和飼喂效果等方面的效果，則是 非常困難，很難達到想要的效果。為解決上述難題，現有實驗技術主要采用復雜的菌株組 合，分別加入不同菌株分解相應的物質，但是這些方法往往違背微生物學原理，菌株太多往 往互為污染菌，相互影響、長勢差；或者這些菌株本身的最適生長條件相差較大，在相同基 質中生長相互干擾。此外，現有技術的發酵方法中，往往加入較多麩皮及玉米輔料（占10~ 20%)，以及采用混合柏類發酵，棉柏含量在總原料中通常低于80%，棉酚等不良因子含量 被沖稀，難度遠低于單一棉柏發酵，也不能達到單一飼料原料的要求(單一成分占95%以 上)。
[0007] 從微生物學角度，對一種原料基質，需選擇獨特的菌株，和相應的培養條件。現有 技術中，還有采用通用發酵劑，工藝簡單，用于各種原料發酵(如豆柏、棉柏和糟渣等），實際 上對每一種原料都不能達到最佳;若工業放大后，發酵效率較低，只適合于副業性農業生 產。
[0008] 本領域目前還沒有開發出較好的，能在單一基質條件下，對棉柏中的棉酚及抗營 養因子等都能很好地進行分解處理，并提高蛋白溶解度的生物學方法。

【發明內容】

[0009] 針對已有的化學脫酚法和微生物發酵法存在的缺陷，本發明提供一種發酵棉籽蛋 白及其制備方法。該方法棉柏占總原料97%以上，為單一原料的發酵。采用高好氧發酵和酶 解同步進行處理棉柏，不僅能夠降低有毒游離棉酚，同時還能明顯降解原料中如植酸等抗 營養因子和增加酸溶性蛋白含量，從而提高產品的營養價值。
[0010] 本發明所要解決的第一個技術問題是提供一種發酵棉籽蛋白。該發酵棉籽蛋白由 以下重量配比的原料發酵而成：棉柏粉97~99份、玉米粉0~1.5份、混合酵母菌固體菌種 0.7~1.5份、混合營養鹽0.1~0.4份、混合酶制劑0.03~0.1份、水;水的總重量占其它五種 原料總重量的0.6~0.9倍。
[0011]優選的，上述發酵棉籽蛋白由以下重量配比的原料發酵而成：棉柏粉98份、玉米粉 0.5份、混合酵母菌固體菌種1.2份、混合營養鹽0.25份、混合酶制劑0.05份和水，水的總重 量占其它五種原料總重量的0.8倍。
[0012] 其中，上述發酵棉籽蛋白中所述的棉柏粉為棉柏經過2.0mm孔徑的粉碎機粉碎后， 再用20目篩子分篩得到。
[0013] 進一步的，上述發酵棉籽蛋白中的，混合酵母菌固體菌種包括以下菌種:扣囊復膜 抱酵母（Saccharomycopsis fibuligera)、產H元假絲酵母菌(Candida utilis)和馬克斯克 魯維酉孝母菌（Kluyveromyces marxianus) 〇
[0014] 先分別制備扣囊復膜孢酵母固體菌種和產朊假絲酵母菌及馬克斯克魯維酵母菌 的混合酵母培養液。再將扣囊復膜孢酵母固體菌種和產朊假絲酵母菌及馬克斯克魯維酵母 菌的混合液體菌種混合接種到麩皮玉米培養基中，經培養得到混合酵母菌固體菌種。
[0015] 具體的，上述發酵棉籽蛋白中所述的扣囊復膜孢酵母固體菌種的制備方法為：
[0016] 從扣囊復膜孢酵母(5&(^1^1'〇1115^(^818；1^13111186抑）的斜面保藏菌種中挑取1環 (接種環），接入lOOmL土豆蔗糖培養液中，于28~32°C溫度搖瓶培養（150~200rpm)培養2~ 3d，得到扣囊復膜孢酵母培養液。再按重量比計，扣囊復膜孢酵母液:麩皮玉米培養基=0.5 ~1.5:100,將培養液轉入麩皮玉米培養基中，于28~32°C溫度培養2~3d，即得扣囊復膜孢 酵母固體菌種。
[0017] 具體的，上述發酵棉籽蛋白中所述的混合酵母培養液的制備方法為：
[00?8] 分別從產骯假絲酵母菌（C a n d i d a u t i 1 i s )和馬克斯克魯維酵母菌 (Kluyveromyces marxianus)的斜面保藏菌種中各挑取1環(接種環），分別接入100mL土豆 蔗糖培養液中，于28~32°C溫度搖瓶培養（150~200rpm)培養2~3d，分別得到產朊假絲酵 母菌培養液和馬克斯克魯維酵母菌培養液;再按重量比，產朊假絲酵母菌培養液:馬克斯克 魯維酵母菌培養液=0.75~0.9:0.1~0.25混合接入土豆蔗糖培養液中，于28~32 °C溫度 搖瓶培養（150~200rpm)培養2~3d，即得到混合酵母液;其中，產朊假絲酵母菌培養液和馬 克斯克魯維酵母菌培養液總重量與土豆蔗糖培養液重量比為1:100;
[0019] 具體的，上述發酵棉籽蛋白中所述的混合酵母菌固體菌種的制備方法為：
[0020] 按重量比計，扣囊復膜孢酵母固體菌種：混合酵母液：麩皮玉米培養基=0.5~ 1.0:0.2~0.5:100，混合均勻，于28~32°C溫度培養2~3d，即得混合酵母菌固體菌種。
[0021] 優選的，上述發酵棉籽蛋白中所述產朊假絲酵母菌培養液：馬克斯克魯維酵母菌 培養液= 0.85:0.15。
[0022] 具體的，上述發酵棉籽蛋白中所述的麩皮玉米培養基的制備方法為:按重量配比 計，麩皮:玉米:水=7~8:2~3:8將三者混勻后于118~126°C下滅菌25~40min，冷卻即可。
[0023] 具體的，上述發酵棉籽蛋白中所述的混合營養鹽的制備方法為:按重量配比計，取 1份KC1、0 · 5 份MgS〇4、0 · 05 份 FeS〇4和 0 · 025份ZnS〇4 混勻即可。
[0024] 具體的，上述發酵棉籽蛋白中所述的混合酶制劑的制備方法為:按重量配比計，植 酸酶:纖維素酶:木聚糖酶:果膠酶:木瓜蛋白酶=10~20:2~3:0.8~1.5:0.8~1.5:0.8~ 1.5將五者混勻即可。
[0025] 優選的，上述發酵棉籽蛋白中所述的混合酶制劑為按重量配比計植酸酶:纖維素 酶:木聚糖酶:果膠酶:木瓜蛋白酶= 10:2:1:1:1。
[0026]具體的，上述發酵棉籽蛋白中所述植酸酶的酶活力為5000單位，所述纖維素酶的 酶活力為5000單位，所述木聚糖酶的酶活力為10萬單位，所述果膠酶的酶活力為3萬單位， 所述木瓜蛋白酶的酶活力為80萬單位。
[0027]本發明所要解決的第二個技術問題是提供一種制備上述發酵棉籽蛋白的固態好 氧發酵方法。該方法包括以下步驟：
[0028] A、粉碎和篩分:取棉柏用2.0篩子的粉碎機粉碎。再用20~30目孔徑的篩子粉篩后 的棉柏粉；
[0029] B、混合:取棉柏粉、玉米粉、混合酵母菌固體菌種、混合營養鹽、混合酶制劑和水混 勻得發酵料；
[0030] C、發酵:將發酵料在好氧狀態下于30~35 °C下發酵45~50h，干燥后即得到發酵棉 軒蛋白。
[0031] 常用的干燥方式溫度為在不高于60度的環境下自然干燥。
[0032]優選的，上述制備方法，步驟B中發酵時發酵料的厚度為不大于60_。
[0033]優選的，上述制備方法，步驟B中發酵采用的容器為不銹鋼材質或竹材質的任意一 種。比如，可采用不銹鋼發酵盤或竹制的發酵盤。
[0034]本發明的有益效果在于:本發明發酵棉柏與未處理棉柏（粗蛋白44%左右）相比， 在相同含水量條件下，粗蛋白多50%，總氨基酸多44%，游離棉酚去除率多60%，植酸降解 率約30%，果膠降解率42%，酸溶性蛋白含量增加100%以上，大幅提高飼喂價值總。本發明 發酵原料中棉柏占97%以上，比現有技術能更充分有效地處理棉柏。應用本發明產品可以 降低養殖成本、增加收益;使用本發明產品可以提高動物機體和腸道健康水平，增強抗病 力，可以常規不用抗生素，有利于推行無抗健康養殖;經過酶處理和發酵，富含生長因子和 肽類等，可以改善肉蛋等品質，提高農產品質量;改善養殖環境，有利于對糞便無害化和資 源化，發展清潔養殖和生態循環。
【具體實施方式】
[0035]現有技術采用化學溶劑法以及厭氧微生物發酵法，要同時兼顧脫毒和消除抗營養 因子、提高消化吸收率、提高營養價值和飼喂效果很難達到想要的效果。為解決上述困難， 現有技術主要采用復雜的菌株組合，加入菌株分解相應的物質，但是這些方法往往違背微 生物學原理，菌株太多往往互為污染菌，相互影響、長勢差；或者這些菌株本身的最適生長 條件相差較大，在相同基質中生長相互干擾。所以，必須要合理地選擇菌株和酶制劑，才能 在單一基質條件下，對棉柏中的棉酚及抗營養因子進行很好的加工處理。
[0036]為了能夠很好地脫除有毒有害物質、選擇合適的菌種，本發明用細菌、酵母菌和絲 狀真菌三大類微生物的數百株菌，在棉柏培養基中分別進行厭氧和好氧培養，測定了菌株 的生長量、棉酚分解率、粗蛋白含量和外觀氣味，排除了絲狀真菌;進一步的，又根據菌株混 合培養測定菌株的生長量、棉酚分解率、粗蛋白含量和外觀氣味等指標，再綜合考慮菌株本 身的安全性、工業化生產的難易程度，發酵的綜合效果等最終確定選擇扣囊復膜孢酵母、產 朊假絲酵母菌和馬克斯克魯維酵母菌三種菌株來處理加工棉柏。
[0037]通過實驗發現，上述三種菌株中，主菌株是扣囊復膜孢酵母，生物量高有降棉酚能 力，次菌株產朊假絲酵母菌有微弱降棉酚能力，馬克斯克魯維酵母菌屬生香酵母，能產少量 酯香，改善發酵棉籽蛋白適口性;這三株菌均能對腸道革蘭氏陰性菌有抑制作用，能提高腸 道非特異性免疫力，部分細胞能通過腸道，進入糞便，有利于清潔養殖。
[0038] 本發明還發現，次菌株接種量過大會降低主菌株的降棉酚能力，因此，優選的方案 是在工業生產條件下比較準確確定主和次菌株的接種比例。經過大量的實驗研究發現，先 將產朊假絲酵母菌和馬克斯克魯維酵母菌混合擴大培養后得到混合酵母菌培養液，控制添 加到混合酵母菌固體菌種中的比例，然后與扣囊復膜孢酵母固體菌種的比例為0.2~0.5: 0.5~1.0時能夠很好地分解棉酚。在制備混合酵母菌固體菌種時，優選為混合酵母菌培養 液〇. 4份，扣囊復膜孢酵母固體菌種0.8份。
[0039] 進一步發現，雖然上述三種菌株組合發酵可以分解棉酚，但對降解抗營養因子和 提高消化吸收作用有限。為了解決上述問題，本發明最初通過大量篩選，選出植酸酶產生菌 和果膠酶產生菌等，加入菌株組合中，期望能夠起到降低抗營養因子的作用，后來實驗發 現，在以單一棉柏原料和多種菌的條件下，不是植酸酶和果膠酶的最佳產酶條件，較復雜的 菌株組合難以兼顧既分解棉酚，又降低抗營養因子。
[0040] 面對上述難題，又進一步研究，發現可以添加復合酶制劑來解決上述問題，通過實 驗發現采用纖維素酶、植酸酶、果膠酶和木聚糖酶的共同作用不僅能分解菜籽柏中主要抗 營養因子，還能提高微生物的脫酚能力;進一步發現，酶復合使用有一定協同作用，例如棉 柏中植酸含量較高，植酸酶對植酸的分解，既能減少植酸對營養元素的結合，從植酸分解釋 放的磷又為微生物生長提供養分，有利于微生物生長，此外果膠和木聚糖等的降解產物也 能提供微生物生長的養分。
[0041] 實驗還發現，在同樣的使用條件下，木瓜蛋白酶對其它幾種酶蛋白有降解作用，隨 著時間延長，酶活性下降。因此，又對木瓜蛋白酶的用量及比例做了實驗研究，控制木瓜蛋 白酶的加入量，可以使其它幾種酶的活性在處理過程的前l〇h內保留50%以上。通過工業生 產實驗發現，當植酸酶：纖維素酶:木聚糖酶：果膠酶:木瓜蛋白酶=10~20:2~3:0.8~ 1.5:0.8~1.5:0.8~1.5比例來制備混合酶制劑，可以很好地處理棉籽柏中的抗營養因子。 優選植酸酶:纖維素酶:木聚糖酶:果膠酶:木瓜蛋白酶=10: 2:1:1:1，結果發現，發酵棉籽 蛋白的酸溶蛋白比原來棉籽柏提高約100%，對棉酚分解率提高到60%左右。
[0042] 本發明發現:在加入酶制劑的同時，應當控制菌種接種量，酶解過程也是菌種擴增 過程。如果接種量過大，細胞增殖過快，發酵時間過短，不利于酶解作用；反之接種量過小， 發酵時間延長，容易造成雜菌增生。
[0043] 本發明還發現，加入的水量為其他固態原料0.6~0.9倍時，既可很好地滿足酶解 對水的需要，又能達到較好的增菌和脫酚效果。
[0044] 發明人研究發現，發酵料太薄容易失水，并且需要的容器也多，造價高，如果發酵 料太厚會成為厭氧發酵，效果變差，所以發酵料的厚度為不大于60mm，優選的，發酵時發酵 料的厚度為不大于50mm。即采用薄層固態好氧發酵，有利于提高生物量。
[0045] 優選的，好氧發酵采用的容器為不銹鋼材質或竹材質的任意一種。
[0046] 進一步優選的，上述發酵棉籽蛋白的制備方法，步驟B中發酵采用的容器為的容器 為可采用不銹鋼發酵盤或竹制的發酵盤。比如，可采用長不大于2000mm、寬不大于1000mm， 高不大于60mm的不銹鋼不金屬淺盤作為發酵盤。
[0047] 總的說來，相對于以前報道的主要為單純厭氧發酵的生物學方法。本發明方法是 以好氧發酵方式為基礎，同時加入酶處理過程，在提高棉酚去除率的同時，有效降低抗營養 因子和提高蛋白消化率，提高了棉柏的飼喂價值，起到了綜合優化的作用，其實現的難度非 常大，但是能獲得非常好的綜合效益。本發明方法與傳統發酵法比較見表1。
[0048]表1本發明方法與傳統發酵法處理棉籽柏比較
[0049]
[0050] 本發明與其它生物法不同，針對單一棉柏原料，創造性地使用高好氧固態發酵方 式，能快速分解毒性物質和顯著提高蛋白質和氨基酸含量，同步進行的酶水解作用則能很 有效地降解抗營養因子。
[0051] 下列試驗例與實施例中，所采用的扣囊復膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera)菌種已于2016年3月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心，保藏編號為CGMCC No. 12221。保藏地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院 微生物研究所。該菌株對菜柏中硫葡萄糖甙以及棉柏中棉酚均有較強脫毒能力，且試口服 安全無毒。
[0052]產朊假絲酵母來自四川大學微生物實驗室保存，原始來源于中國科學院微生物研 究所(北京），保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGNCC)，菌種編號CGNCC2.281; [0053]馬克斯克魯維酵母保藏于中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心，保藏 編號 CGMCCNo.9427;
[0054] 植酸酶購自北京昕大洋科技發展有限公司，纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶和木瓜蛋 白酶均購自四川華德生物工程有限公司。
[0055] 實施例1棉柏篩分預處理條件
[0056] 將棉柏原料用工業粉碎機粉碎，粉碎機篩孔為2.0mm。將粉碎后的棉柏分別用10 目、20目、30目、40目、60目和80目的篩網分篩，分別稱篩上和篩下物的重量。其中10目篩上 物全部是短絨毛，占原料總重比例約2% ; 20目篩上物是短絨毛和少量棉籽皮雜質，占原料 總重比例約8%，篩下物無肉眼可見明顯的短絨毛;從30目至80目分篩結果，篩上物中棉仁 隨篩孔越細而增多。綜合以上，選取20~30目篩分作為發酵前的預處理，降低纖維物質等雜 質含量。優選20目，分析結果:篩分前原料粗蛋白為44%，游離棉酚為852mg/kg;篩分后粗蛋 白為為46.2%，游離棉酚為833mg/kg。
[0057] 實施例2固體生產菌種的制備
[0058] 從扣囊復膜孢酵母(5&(^1^1'〇1115^(^818；1^13111186抑）的斜面保藏菌種中挑取1環 (接種環），接入l〇〇mL土豆培養液中，于30°C溫度搖瓶培養（180rpm)52h，得到扣囊復膜孢酵 母培養液。
[0059]取扣囊復膜孢酵母液50g，接入已滅菌的5000g麩皮玉米培養基（以干料計）中，拌 合均勻，于30°C溫度培養48h，即得扣囊復膜孢酵母固體菌種。
[0060] 土豆蔗糖培養液制備:將新鮮土豆削皮后切成大指姆大小的塊狀，稱取100g，加入 500g的自來水，煮沸20分鐘，紗布過濾，棄渣取上清液，用自來水定容到500g，再加入蔗糖 l〇g，溶化后，分裝250ml三角瓶，每瓶100g。滅菌120°C維持30分鐘。
[00611麩皮玉米培養基的制備：取麩皮750g，玉米250g，自來水800g，拌合均勻后，于120 °C滅菌30min，冷卻后可接種。
[0062] 分別從產骯假絲酵母菌（Candida utilis)和馬克斯克魯維酵母菌 (Kluyveromyces marxianus)的斜面保藏菌種中挑取1環(接種環），分別接入100g土豆鹿糖 培養液中，于30°C溫度培養50h，分別得到產朊假絲酵母菌培養液和馬克斯克魯維酵母菌培 養液;將產朊假絲酵母菌培養液〇. 85g:馬克斯克魯維酵母菌培養液0.15g混合接入100g土 豆蔗糖培養液中，于30°C溫度培養48h，即得到混合酵母液；
[0063]再取扣囊復膜孢酵母固體菌種8g，混合酵母液4g，混合接入已滅菌的1000g麩皮玉 米培養基（以干料計）中，拌合均勻，于30°C溫度培養52h，即得混合酵母菌固體菌種，用于發 酵生產。細胞計數為6.45 X 109/g培養物。
[0064]實施例3營養鹽的加入對處理結果的影響
[0065]將棉柏原料按實施例1粉碎，用20目篩分，得到棉柏粉。再按實施例2制備混合酵母 菌固體菌種。
[0066] 將1?屮〇4、1((：1、1^〇4小63〇4、2113〇4和植酸酶按下表分組加入，拌合均勻，于30°(：溫 度培養48h，測定發酵后的細胞數和粗蛋白含量。
[0067]
[0068] 選取營養鹽添加為第8組，SP :KC1 0 · 1 %、MgS〇4〇 · 05%、FeS〇4〇 .005%、 ZnS〇4〇 . 0025 %、植酸酶0.02 %。植酸酶對棉柏中植酸分解可為細胞生長提供磷源。以上植 酸酶活力單位為5000u/g。
[0069]實施例4發酵處理棉柏
[0070]將棉柏原料按實施例1粉碎，用20目篩分，得到棉柏粉，游離棉酚為833mg/kg。再按 實施例2分別制備扣囊復膜孢酵母固體菌種和混合酵母菌液。
[0071] 配制混合營養鹽:稱取KC1 100g、MgS〇4 50g、FeS〇4 5g和ZnS〇4 2.5g用粉碎機混合 粉碎，全部過100目。
[0072] 配制混合酶制劑:稱取植酸酶100g、纖維素酶20g、木聚糖酶10g、果膠酶10g、木瓜 蛋白酶1 〇g，混合攪拌均勾。
[0073] 取棉柏粉980g、玉米粉5g、混合酵母菌固體菌種12g、混合營養鹽2.5g、混合酶制劑 0.5g和800g水拌合混勻，在700 X 350mm不銹鋼盤中平鋪均勻，厚度4cm，于30 °C溫度下發酵 48h，50°C溫度下干燥24h后，即得到發酵棉籽蛋白。
[0074] 測定發酵后的細胞數為2.2 X 109/g，水分12.2%、粗蛋白51.7%、游離棉酚276mg/ kg〇
[0075] 天門冬氨酸4.41%、蘇氨酸1.60%、絲氨酸2.06%、谷氨酸9.22%、甘氨酸1.97%、 丙氨酸2.01%、胱氨酸0.56%、纈氨酸2.04%、蛋氨酸0.75%、異亮氨酸1.53%、亮氨酸 3.05%、酪氨酸1.33%、苯丙氨酸2.72%、賴氨酸2.07%、組氨酸1.33%、精氨酸5.16%、脯 氨酸2.03%、氨基酸總量43.83%。小肽含量10.3% (對照原料4.4%，水分8.08% )。
[0076]實施例5發酵處理棉柏
[0077]將棉柏原料按實施例1粉碎，用20目篩分，得到棉柏粉，游離棉酚為833mg/kg。再按 實施例2分別制備扣囊復膜孢酵母固體菌種和混合酵母菌液。
[0078] 配制混合營養鹽:稱取KC1 100g、MgS〇4 50g、FeS〇4 5g和ZnS〇4 2.5g用粉碎機混合 粉碎，全部過100目。
[0079]取棉柏粉974g、玉米粉15g、混合酵母菌固體菌種6.7g、混合營養鹽4g、混合酶制劑 0.3g和700g水拌合混勻，在700 X 350不銹鋼盤中平鋪均勻，厚度6cm，于32°C溫度下發酵 48h，50°C溫度下干燥20h后，即得到發酵棉籽蛋白。
[0080]測定發酵后的細胞數為1.65 X 109/g。水分9.8%、粗蛋白51.7%、乳酸含量 1.62%、游離棉酚32911^/1^。酸溶蛋白含量10.01%(對照原料為4.94%)，水蘇糖<50.01^/ kg、棉籽糖 < 50 · Omg/kg。
[00811實施例6發酵處理棉柏
[0082]將棉柏原料按實施例1粉碎，用20目篩分，得到棉柏粉，游離棉酚為833mg/kg。再按 實施例2分別制備扣囊復膜孢酵母固體菌種和混合酵母菌液。
[0083] 配制混合營養鹽:稱取KC1 100g、MgS〇4 50g、FeS〇4 5g和ZnS〇4 2.5g用粉碎機混合 粉碎，全部過100目。
[0084] 配制混合酶制劑:稱取植酸酶100g、纖維素酶20g、木聚糖酶10g、果膠酶10g、木瓜 蛋白酶1 〇g，混合攪拌均勾。
[0085] 取棉柏粉980g、玉米粉3g、混合酵母菌固體菌種15g、混合營養鹽lg、混合酶制劑lg 和600g水拌合混勻，在700 X 350mm不銹鋼盤中平鋪均勻，厚度6cm，于32 °C溫度下發酵50h， 50°C溫度下干燥20h后，即得到發酵棉籽蛋白。
[0086] 測定發酵后的細胞數為1.8\109/^，游離棉酚318!^/1^，水分11.12%、粗蛋白 50.11 %、乳酸含量1.49 %、酸溶蛋白含量10.8 % (未發酵原料為4.4%，水分8.08 % )，水溶 蛋白含量12 · 3 %、水蘇糖< 50 · 0mg/kg、棉籽糖< 50 · 0mg/kg。
[0087]實施例7規模化發酵處理棉柏
[0088]將棉柏原料按實施例1粉碎，用20目篩分，得到棉柏粉，游離棉酚為833mg/kg。再按 實施例2分別制備扣囊復膜孢酵母固體菌種和混合酵母菌液。
[0089]配制混合營養鹽:稱取KC1 2000g、MgS〇4 1000g、FeS〇4 100g和ZnS〇4 50g用粉碎機 混合粉碎，全部過100目。
[0090] 配制混合酶制劑:按植酸酶每1000g配纖維素酶200g、木聚糖酶100g、果膠酶100g、 木瓜蛋白酶l〇〇g的配比稱取需要量的原料，混合攪拌均勻。
[0091] 取棉柏粉970kg、玉米粉15kg、混合酵母菌固體菌種11kg、混合營養鹽3.2kg、混合 酶制劑〇. 8kg和800kg水拌合混勻，在2000 X 1000 X 60mm不銹鋼發酵盤(底部是40目篩網）中 平鋪均勻，厚度5cm，每盤裝料20kg(以干料計），共裝50盤，于33 °C溫度下發酵48h，50 °C溫度 下干燥20h后，即得到發酵棉籽蛋白。
[0092]測定發酵后的細胞數為2.05 X 109/g，水分12.5 %，粗蛋白50.8 %，游離棉酚 322mg/kg。
[0093] 天門冬氨酸4.52%、蘇氨酸1.64%、絲氨酸2.15%、谷氨酸9.35%、甘氨酸1.99%、 丙氨酸2.01%、胱氨酸0.68%、纈氨酸2.06%、蛋氨酸0.76%、異亮氨酸1.51%、亮氨酸 3.02 %、酪氨酸1.38 %、苯丙氨酸2.76 %、賴氨酸2.12 %、組氨酸1.38 %、精氨酸5.44 %、脯 氨酸1.95 %、氨基酸總量44.76%。酸溶蛋白11.5% (對照原料4.45%，水分8.9% )，水蘇糖 < 50 · 0mg/kg、棉籽糖 < 50 · 0mg/kg。
[0094]實施例8規模化發酵處理棉柏
[0095]將棉柏原料按實施例1粉碎，用20目篩分，得到棉柏粉，游離棉酚為845mg/kg。再按 實施例2方法分別制備扣囊復膜孢酵母固體菌種和混合酵母菌液。
[0096]配制混合營養鹽：稱取KC1 10kg、MgS〇4 5kg、FeS〇4 0.5kg和ZnS〇4 0.25kg用粉碎 機混合粉碎，全部過100目。
[0097] 配制混合酶制劑:稱取植酸酶10kg、纖維素酶2kg、木聚糖酶lkg、果膠酶lkg、木瓜 蛋白酶1 kg，混合攪拌均勾。
[0098] 取棉柏粉990kg、混合酵母菌固體菌種7kg、混合營養鹽2.2kg、混合酶制劑0.8kg和 900kg水拌合混勻，在2000 X 1000 X 60mm不銹鋼發酵盤(底部是40目篩網）中平鋪均勻，厚度 4cm，每盤裝料20kg(以干料計），共裝50盤，發酵室控溫33°C，發酵48h，50°C溫度下干燥20h 后，即得到發酵棉籽蛋白。
[0099] 測定發酵后的細胞數為1.9\109/^。游離棉酚325!^/1^，粗蛋白52.89%、水分 9.96%、灰分7.25%、天冬氨酸4.81%、賴氨酸2.29%、脯氨酸1.84%、亮氨酸2.98%、苯丙 氨酸2.74%、甘氨酸2.24%、纈氨酸2. 14%、組氨酸1.61%、絲氨酸2.44%、異亮氨酸 1.53 %、蛋氨酸0.61 %、丙氨酸2.08 %、谷氨酸9.35 %、蘇氨酸1.71 %、精氨酸5.62 %、胱氨 酸0.86 %、游離氨1.43 %。酸溶蛋白11.5 % (對照原料4.41 %，水分8.5 % )，水蘇糖< 50 · Omg/kg、棉籽糖 < 50 · Omg/kg。
[0100] 實施例9規模化發酵處理棉柏并進行育肥豬養殖實驗
[0101] 將棉柏原料按實施例1粉碎，用20目篩分，得到棉柏粉，游離棉酚為845mg/kg。再按 實施例2方法分別制備扣囊復膜孢酵母固體菌種和混合酵母菌液。
[0102] 配制混合營養鹽：稱取KC1 10kg、MgS〇4 5kg、FeS〇4 0.5kg和ZnS〇4 0.25kg用粉碎 機混合粉碎，全部過100目。
[0103] 配制混合酶制劑:稱取植酸酶10kg、纖維素酶2kg、木聚糖酶lkg、果膠酶lkg、木瓜 蛋白酶1 kg，混合攪拌均勾。
[0104] 取棉柏粉4900kg、玉米粉30kg、混合酵母菌固體菌種50kg、混合營養鹽15kg、混合 酶制劑5kg和4000kg水拌合混勻，在2000 X 1000 X 60mm不銹鋼發酵盤(底部是40目篩網）中 平鋪均勻，厚度5cm，每盤裝料20kg(以干料計），共裝250盤，發酵室溫度34.5 °C，發酵46h，50 °C溫度下干燥20h后，即得到發酵棉籽蛋白。
[0105] 測定發酵后的細胞數為1.7\109/^。游離棉酚32211^/1^。粗蛋白53.47%、水分 10.12%、灰分6.89%、天冬氨酸4.83%、賴氨酸2.18%、脯氨酸1.77%、亮氨酸2.95%、苯丙 氨酸2.99%、甘氨酸2.26%、纈氨酸2.05%、組氨酸1.64%、絲氨酸2.45%、異亮氨酸 1.45%、蛋氨酸0.60%、丙氨酸2.07%、谷氨酸9.49%、蘇氨酸1.69%、精氨酸5.64%、胱氨 酸0.89 %、游離氨1.68 %。酸溶蛋白11.8 % (對照原料4.47 %，水分8.65 % )，水蘇糖< 50 · Omg/kg、棉籽糖 < 50 · Omg/kg。
[0106] 選內江豬和杜洛克二元雜交豬120只，隨機分為2組，每組60只，1組喂傳統原料的 全價料，另1組喂加有發酵棉籽蛋白的生物飼料。傳統飼料組平均體重65.4kg，生物飼料組 平均體重64.85kg。
[0107] 傳統飼料配方：玉米69 %、豆柏（粗蛋白43 % ) 16 %、棉柏（粗蛋白44 % ) 6 %、麩皮 5%，微量調節劑4%。生物飼料配方：玉米69%、豆柏7%、發酵棉籽蛋白（粗蛋白53.47% ) 13%、麩皮7%，微量調節劑4%。
[0108] 生物飼料是將發酵棉籽蛋白13%替換傳統飼料組中棉柏和部分豆柏，保持兩組粗 蛋白一致，代謝能相當，差額部分用2%麩皮補齊。
[0109] 兩組配方單價:傳統飼料組高于生物飼料組36元/噸。
[0110]在同等飼養條件下喂養82天。傳統飼料組：日增重685g、料肉比3.572、錢肉比 7.86;生物飼料組：日增重736g、料肉比3.410、錢肉比7.38,成本降低0.48元/每kg體重增 重。
[0111] 上述的4份微量調節劑包括如下成分：磷酸氫鈣10g、賴氨酸2g、銅CuS.Omg、鐵 Fe80.0mg、猛Mn60.0mg、梓Zn 40.0mg、砸Se 0.15mg、鵬I 0.35mg、維生素 A 50000IU、維生素 D310000IU、維生素 E 25IU、維生素 K35mg、維生素 B1210mg、維生素 B120mg、維生素 B216mg、維 生素 B6 6mg、煙酰胺35mg、泛酸25mg、葉酸0.5mg。微量調節劑中IU--國際單位。
[0112] 實施例10規模化發酵處理棉柏并進行生長肉雞養殖實驗
[0113]將棉柏原料按實施例1粉碎，用20目篩分，得到棉柏粉，游離棉酚為845mg/kg。再按 實施例2方法分別制備扣囊復膜孢酵母固體菌種和混合酵母菌液。
[0114] 配制混合營養鹽：稱取KC1 10kg、MgS〇4 5kg、FeS〇4 0.5kg和ZnS〇4 0.25kg用粉碎 機混合粉碎，全部過100目。
[0115] 配制混合酶制劑:稱取植酸酶10kg、纖維素酶2kg、木聚糖酶lkg、果膠酶lkg、木瓜 蛋白酶1 kg，混合攪拌均勾。
[0116] 取棉柏粉980kg、玉米粉7kg、混合酵母菌固體菌種10kg、混合營養鹽2.2kg、混合酶 制劑0.8kg和800kg水拌合混勻，在2000 X 1000不銹鋼發酵盤(底部是40目篩網）中平鋪均 勻，厚度4cm，每盤裝料20kg(以干料計），共裝50盤，發酵室控溫34.8°C，發酵45h，50°C溫度 下干燥20h后，即得到發酵棉籽蛋白。
[0117] 測定發酵棉籽蛋白成品中細胞數為2.15X109/g。粗蛋白49.4%、水分13.3%，游 離棉酸317mg/kg。
[0118] 天門冬氨酸4.52%、蘇氨酸1.64%、絲氨酸2.17%、谷氨酸9.77%、甘氨酸2.03%、 丙氨酸1.98%、胱氨酸0.60%、纈氨酸2.02%、蛋氨酸0.76%、異亮氨酸1.53%、亮氨酸 3.04 %、酪氨酸1.38 %、苯丙氨酸2.62 %、賴氨酸2.19 %、組氨酸1.40 %、精氨酸5.58 %、脯 氨酸2.00%、氨基酸總量45.21 %。植酸降解率約30%，果膠降解率42%，酸溶性蛋白11.2% (對照原料4 · 43 %，水分8 · 5 % )。
[0119] 肉雞喂養實驗
[0120] 選600只1.6kg左右青腳白皮麻羽雞，隨機分為2組，每組300只，對照組平均初重 1 · 645kg/只，生物組平均初重1 · 618kg/只。
[0121] 對照組配方為：玉米68 %、豆柏（粗蛋白43 % ) 18 %、棉柏（粗蛋白44 % ) 6 %、麩皮 3%、豆油1 %、微量調節劑4% ;生物飼料組配方為:玉米68 %、豆柏(粗蛋白46% ) 10%、發酵 棉籽蛋白（粗蛋白51.3 %、水分折算按10 % ) 13 %、麩皮4%、豆油1 %、微量調節劑4 %。生物 飼料組用13%發酵棉籽蛋白替換8%豆柏和6%棉柏，不足的1%用麩皮補足。兩組能量和粗 蛋白水平基本一致。生物蛋白組配方成本單價降低30元/噸飼料。
[0122] 在同等飼養條件下喂養31天。對照組：總增重110.27kg，料肉比為2.72、飼料價格 2.2元/kg錢肉比5.98:1，生物飼料組：總增重120.08kg，料肉比為2.59、飼料價格2.17元/ kg、錢肉比為5.62:1，即每公斤增重降低成本0.36元。生物組病死數0只，對照組病死數1只。 生物組飼料組未加任何抗生素。
[0123] 上述微量調節劑為按每kg飼糧:磷酸氫鈣10g、膽堿lg、小蘇打lg、賴氨酸2g、蛋氨 酸lg、植酸酶0 · 2g、銅Cu8 · Omg、鐵Fe80 · Omg、猛Mn60 · Omg、鋅Zn 40 · Omg、硒Se 0 · 15mg、鵬I 0.35mg、維生素 A 50000IU、維生素 D310000IU、維生素 E 25IU、維生素 K35mg、維生素 B1210mg、 維生素 BdOmg、維生素 B2 16mg、維生素 B6 6mg、煙酰胺35mg、泛酸25mg、葉酸Ο · 5mg。對照組飼 料微量調節劑中每千克還含有:維吉尼亞霉素20mg，鹽霉素60mg。生物組飼料微量調節劑中 每千克多補充:賴氨酸〇. 4g。微量調節劑中IU-國際單位。
【主權項】
1. 發酵棉籽蛋白，其特征在于：由以下重量配比的原料發酵而成：棉柏粉97~99份、玉 米粉0~1.5份、混合酵母菌固體菌種0.7~1.5份、混合營養鹽0.1~0.4份、混合酶制劑0.03 ~0.1份、水;水的總重量占其它五種原料總重量的0.6~0.9倍。2. 根據權利要求1所述的發酵棉籽蛋白，其特征在于：由以下重量配比的原料發酵而 成:棉柏粉98份、玉米粉0.5份、混合酵母菌固體菌種1.2份、營養鹽0.25份、混合酶制劑0.05 份和80份水。3. 根據權利要求1或2所述的發酵棉籽蛋白，其特征在于:所述的棉柏粉為棉籽經榨油 后的柏，再經過粉碎和篩分除去雜質。4. 根據權利要求1~3任一項所述的發酵棉籽蛋白，其特征在于:所述的混合酵母菌固 體菌種包括的菌種為：扣囊復膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)、產骯假絲酵母菌 (Candida utilis)和馬克斯克魯維酵母菌(Kluyveromyces marxianus)。5. 根據權利要求1~4任一項所述的發酵棉籽蛋白，其特征在于:所述的營養鹽的制備 方法為:按重量配比計，取1份KC1、0.5份MgS〇4、0.05份FeS〇4和0.025份ZnS〇4混勻即可。6. 根據權利要求1~5任一項所述的發酵棉籽蛋白，其特征在于:按重量配比計植酸酶： 纖維素酶:木聚糖酶:果膠酶:木瓜蛋白酶=10: 2:1:1:1，將五者混勻即可;其中，所述植酸 酶的酶活力為5000單位，所述纖維素酶的酶活力為5000單位，所述木聚糖酶的酶活力為10 萬單位，所述果膠酶的酶活力為3萬單位，木瓜蛋白酶酶活力為80萬單位。7. 制備權利要求1~8任一項所述的發酵棉籽蛋白的固態好氧發酵方法，其特征在于： 包括以下步驟： A、 粉碎和篩分:取棉柏用2.0篩子的粉碎機粉碎，再用20~30目孔徑的篩子粉篩后的棉 柏粉； B、 混合:取棉柏粉、玉米粉、混合酵母菌固體菌種、營養鹽、混合酶制劑和水混勻得發酵 料； C、 發酵:將發酵料在好氧狀態下于30~35°C下發酵45~50h，干燥后即得到發酵棉籽蛋 白。8. 根據權利要求8所述的發酵棉籽蛋白的制備方法，其特征在于:步驟B中，好氧狀態發 酵時發酵料的厚度為不大于60mm。
【文檔編號】A23K10/37GK106071106SQ201610445999
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月17日
【發明人】鄧小晨, 吳謙
【申請人】四川伯禹生物工程有限公司