青貯飼料接種劑的穩定性和用于提高青貯飼料的有氧穩定性的方法
【專利摘要】提供了一種用于處理青貯飼料的方法，其包括將青貯飼料接種劑加入青貯飼料中，所述青貯飼料接種劑包含青貯飼料保存有效量的希氏乳桿菌(Lactobaci l lus hi lgardi i)。所述青貯飼料接種劑能有效防止或降低有氧酸敗。CNCM I-478420130626 CNCM I-478520130626
【專利說明】青膽飼料接種劑的穩定性和用于提高青膽飼料的有氧穩定性 的方法
[0001] 本發明設及青膽飼料。更具體地，設及青膽飼料接種劑和使用青膽飼料接種劑提 高青膽飼料的有氧穩定性的方法。
[0002] 青膽飼料是飼喂反當動物(如，反當動物，如牛和綿羊）的發酵的、高水分草料。將 青膽飼料發酵并儲存于儲料倉中，運是一種稱為青膽法的方法。青膽飼料最常見的是由草 或谷類作物制得，包括黑麥草、首猜、羊茅草、玉米或高梁。青膽飼料由整菌株植物或其部分 制得。青膽飼料還可W由許多其他農田作物制得，包括甘薦等等，如，例如，當進行時，有時 候使用針對燕麥的oatlage，針對首猜的半干青膽飼料。有時使用混合物，如燕麥和魏豆。
[0003] 青膽飼料的生產和相關的作物耕作在近些年已經發展到可W限定多種不同方法 的程度。運些是：（i)具有特別低干物質（例如，低于25%)的嫩草的青膽；（ii)較高干物質， 更成熟草的青膽，或通過萎黨獲得的高干物質但是嫩草的青膽;和（iii)整個玉米，包括賴 桿和玉米穗軸的青膽，通常為約35%的干物質濃度，或整個谷類作物的青膽，例如，小麥， 45-50 %干物質。
[0004] 盡管運些方法通常引起良好的產量，但不是沒有問題。特別是在第(ii)和（iii)情 況中，經常出現一個主要問題。運是稱為有氧酸敗的現象。有氧酸敗的過程在料倉打開，物 質暴露于空氣時發生。其可W分成特定的階段。首先，存在初始階段，其中酵母和有時醋酸 細菌開始呼吸保存的有機酸，提高青膽飼料pH，并且溫度開始上升。初始的抑升高后，存在 第二個階段，其中桿菌的活性是明顯的，并且與遞增的溫度相關。再一個階段包括各種微生 物，包括真菌的活性。
[0005] 在含有實質性含量的干物質（即，超過30%)的那些青膽飼料中，酸敗的問題特別 嚴重。一旦青膽飼料堆打開并暴露于空氣，或多或少可W看到酸敗。
[0006] 生物添加劑，如細菌接種劑，已經廣泛用于改善青膽飼料的加工，主要是用于提高 乳酸產生的程度和速率，W及防止好養酸敗。Mann等的美國專利No.6,326,037提供了用于 改善運種狀況的方法和組合物。特別地，其中描述了至少部分基于將好養酸敗過程鑒定為 與暴露于進入的空氣時料堆中的升溫密切相關。隨后所述青膽飼料的檢查顯示出高濃度的 嗜熱革蘭氏陽性細菌，包括桿菌，酵母和霉菌。運顯然證明了二次發酵的開始，類似于堆肥 的開始(主發酵是青膽過程）。在運個發酵階段中，酵母和霉菌占優勢。顯然，為了防止酸敗， 需要殺滅或抑制的Ξ種主要類別的生物體是產抱子細菌、酵母和真菌。只消除一種類別可 能導致剩余類別的增殖，使得不能防止酸敗。
[0007] 因此，Mann教導了通過使用處理生物體來防止酸敗，所述處理生物體至少在第一 種情況中，抑制啟動有氧酸敗的微生物，主要是酵母，W及在青膽飼料表面的真菌。能夠起 到該作用的生物體還可W抑制其他酸敗微生物的發展，并且可W通過篩選來鑒定。符合運 個要求的布氏乳桿菌化actobacillus buchneri)種的生物體已經于1996年2月13日保藏于 National Collection of Industrial and Marine Bacteria。其保藏號為40788。
[000引盡管使用布氏乳桿菌的處理降低了青膽飼料中的酸敗，但只是在有限的程度上。 因此，仍然需要改善的青膽飼料處理，特別是用于提高青膽飼料的有氧穩定性，同時提高回 收的干物質量。
[0009] 發明概述
[0010] 在一個方面中，提供了一種用于處理青膽飼料的方法。該方法包括將包含青膽飼 料保存有效量的希氏乳桿菌(Lactobacillus hiIgardii)的青膽飼料接種劑加入所述青膽 飼料中。所述青膽飼料接種劑能有效防止或降低有氧酸敗。
[0011] 在另一個方面中，提供了一種包含青膽飼料保存有效量的希氏乳桿菌的青膽飼料 接種劑。
[0012] 在青膽飼料接種劑的一個方面中，所述青膽飼料接種劑進一步包含載體。
[0013] 在進一步的方面中，提供了包含青膽飼料保存有效量的希氏乳桿菌的青膽飼料。
[0014] 在所述方法的一個方面中，在所述青膽飼料接種劑和所述青膽飼料中，希氏乳桿 菌是具有2013年6月26日提交的保藏號CNCM 1-4784的希氏乳桿菌菌株SIL51和具有2013年 6月26日提交的保藏號CNCM 1-4785的希氏乳桿菌菌株SIL52中的至少一種。所述菌株已經 被法國Lai lemand SAS 1 化ue des B;riquettiers,31702Bla即ac Cedex保藏于國立微生 物保藏中屯、（Insti1:ut Pasteur 25Rue Du Docteur Roux 75724Pa;ris Cedex 15)。
[0015] 在所述方法的一個方面中，所述青膽飼料接種劑進一步包含載體。
[0016] 在再進一步的方面中，提供了具有2013年6月26日提交的保藏號CNCM 1-4784的希 氏乳桿菌菌株SIL51的分離菌株或其遺傳等價物。
[0017] 在另一個方面中，提供了具有2013年6月26日提交的保藏號CNCM 1-4785的希氏乳 桿菌菌株SIL52的分離菌株或其遺傳等價物。
[001引發明詳述
[0019] 根據本發明，已經分離和純化了提高青膽飼料的有氧穩定性的乳酸細菌。更具體 地，希氏乳桿菌已經顯示出增強青膽飼料的有氧穩定性。此外，當接種于青膽飼料時，希氏 乳桿菌菌株產生保存完好的青膽飼料，并且其中與有氧酸敗和加熱相關的二次發酵的開始 得到降低或防止。
[0020] 本發明的菌株從甘薦（Saccharum SPP.)青膽飼料分離。該菌株純化和分離后，進 行了分類學研究W鑒別該菌株。其中兩個菌株鑒別為希氏乳桿菌并且給予原型號SIL51和 SIL52。
[0021] 因此，本發明提供了青膽飼料接種劑和使用青膽飼料接種劑提高青膽飼料的有氧 穩定性的方法。
[0022] 在本文中使用時，術語"青膽飼料保存有效量"將理解為表示至少足W保存青膽飼 料的量。因此，所述量為至少足W提高青膽飼料的穩定性，但優選是足W提高青膽飼料的穩 定性同時提高收集的干物質量的量。
[0023] 在本文中使用時，術語"有氧穩定性"將理解為表示在升高高于環境溫度超過2°C 前青膽飼料的溫度保持穩定的小時數。
[0024] 現在將參考本文中描述的實施方案。將理解并不打算由此限制本發明的范圍。進 一步理解本發明的公開內容包括所示實施方案的任何改變和變化并且包括本發明公開原 理的更多應用，如本發明公開所屬領域中的技術人員通常進行的。
[0025] 在一個實施方案中，提供了一種用于處理青膽飼料的方法。該方法包括將青膽飼 料接種劑加入所述青膽飼料中的步驟，所述青膽飼料接種劑包含青膽飼料保存有效量的希 氏乳桿菌。所述青膽飼料接種劑能有效防止或降低有氧酸敗。
[0026] 還提供了一種至少包含希氏乳桿菌菌株的青膽飼料接種劑。更具體地，所述青膽 飼料接種劑包含青膽飼料保存有效量的希氏乳桿菌種。
[0027] 在上述方法和青膽飼料接種劑的一個實施方案中，希氏乳桿菌菌株是2013年6月 26日提交的希氏乳桿菌菌株CNCM I-4784(SIL51)、2013年6月26日提交CNCM 1-4785 (SIL52)的分離菌株，或其遺傳等價物。將理解還考慮了 2013年6月26日提交的菌株CNCM I- 4784(SIL51)和CNCM I-4785(SIL52)的保持了本發明中所述的提高草料有氧穩定性的功能 活性的突變體或遺傳等價物。
[0028] 與誘導突變或遺傳等價物的方式無關，關鍵問題在于它們能夠與親本菌種和/或 菌株一樣來提高青膽飼料的有氧穩定性。換句話說，本發明包括導致此類微小改變(例如， 微小的分類學改變)的突變。
[0029] 根據本發明的青膽飼料接種劑可W是液體或固體形式并且可W包含其他細菌菌 株。根據本發明的青膽飼料接種劑可W包含合適的載體或可W按原樣使用。W固體形式時， 該青膽飼料接種劑可W包含固體載體。合適的載體可W是含水或非含水形式或固體形式。 含水或非含水液體形式載體的實例包括水、油和石蠟(paraf ins)。固體形式載體的實例包 括有機或無機載體，如，例如，麥芽糖糊精、淀粉、碳酸巧、纖維素、乳清、磨碎的玉米忍和二 氧化娃。固體組合物可輕質粉塵的形式直接施用于草料中，或如果將其分散于液體載 體中，可W將其成功地噴在草料上。將理解可W使用用于本發明目的的任何其他合適的載 體。
[0030] 顯然抑制物質可能是次生代謝產物。因此，當用于青膽飼料中時，如果青膽飼料打 開太快，可能看不到完全的作用。青膽飼料優選保持密閉至少30天，并且更優選至少45天。 最佳時間段特別是取決于青膽飼料堆的大小和被青膽材料的性質。
[0031] 根據本發明，適用于青膽的材料是易受有氧酸敗影響的那些。所述材料通常含有 至少20%重量的干物質。運樣的材料包括，例如，黑麥或傳統青草、玉米，包括高水分玉米、 整菌株玉米、紫花首猜、枯萎的青草、小麥、豆類、高梁、向日葵、大麥、其他整菌株谷類作物 和其他農田作物，如甘薦。青膽飼料可W是捆包(bales)(-種特別易受有氧酸敗影響的形 式）、氧限制袋、料倉、直立倉狀青膽魯、氧限制青膽魯、袋、堆或任何其他合適的易受有氧酸 敗影響的存儲形式。在一個實施方案中，本發明的青膽飼料接種劑可W與任何合適的動物 飼料一起使用，不管該飼料是固體還是液體，用于飼喂動物，如，例如，豬、家禽或反當動物。
[0032] W下實施例用于進一步描述和限定本發明，并且并不打算W任何方式來限制本發 明。 實施例
[0033] 實施例1:
[0034] 從大約12月大的植物新鮮切割的甘薦制得青膽飼料。人工采收甘薦并使用實驗室 型切碎機(Pinheiro,型號:PP-47)切成大約30mm的長度。將3kg切碎的材料與接種劑混合并 且在PVC塑料倉(迷你-青膽魯，10cm直徑和60cm長）中調和，所述倉用含有用于氣體釋放的 Bunsen閥的密封蓋密封。將青膽魯中的材料壓縮成大約630± 19.9kg m-3的密度。將迷你- 青膽魯儲存在室溫并且在儲存61天后分析，對于每個青膽魯，準備了 Ξ個重復。
[00；3日]使用植物乳桿菌(Xactobacillus plantarunOSIL 34(植物乳桿菌通常用作青膽 飼料接種劑)和希氏乳桿菌菌株SIL 51 (2013年6月26日的CNCM 1-4784)和SIL 52(2013年6 月26日的CNCM 1-4785)作為接種劑來生產青膽飼料。從甘薦青膽飼料分離了植物乳桿菌 和希氏乳桿菌菌株，并且鑒定為具有98%序列同一性。將沒有使用任何接種劑的青膽飼料 用作對照。根據 Avi 1e 等（Ef f e C t S of an indigenous and a commercial Lactobacillus buchneri strain on quality of sugar cane silage,Grass Forage Sci 6:384-394,2009)來培養接種劑。最終培養后，在De Man Rogosa aiarpe瓊脂（Oxoid CM361，Basingstoke，化mpshire，英國）上計數細胞數，并且將培養物的濃度調節至91og cfu nd-l。將培養物與80mL無菌蒸饋水混合并且噴在切碎的甘薦上至61og cfu g-1草的終 濃度。對照接受了相同量的不含任何細菌的水。對于每次處理，使用分開的噴霧器，W避免 交叉污染。
[0036] 記錄了空的和滿的青膽魯的重量。密封后，將青膽魯維持在室溫(平均25Γ)并且 防止日曬雨淋。青膽61天后，在打開之前，將滿的青膽魯稱重。使用新鮮草料和青膽飼料的 重量和DM含量計算了干物質(DM)的損耗。
[0037] 與其他菌株和對照相比，使用植物乳桿菌（SIL 34)的接種獲得了具有較低DM含 量，較高DM損耗和較高NDF的青膽飼料。在接種了希氏乳桿菌菌株SIL 51和SIL 52的青膽飼 料中，發現與SIL 34和對照相比，DM損耗較低(表1)。接種運些相同菌株還獲得了具有較高 DM含量和較低NDF的青膽飼料。該接種劑沒有影響青膽飼料的pH值和可溶性碳水化合物含 量。
[0038] 表1在沒有使用接種劑和使用不同接種劑青膽第61天時甘薦青膽飼料的化學組成
[0039]
[0040]
[0041 ] b-干物質含量;C-新鮮物質；d-中性去污劑纖維；e-水溶性碳水化合物;f:乳酸細 困。
[0042] 一欄中具有不同字母的平均值是顯著差異的(p<0.05)。
[0043] 分析程序
[0044] 在打開那天，從每個迷你青膽魯中取出兩個樣品，并且將迷你魯中的所有內含物 均質。將樣品之一稱重并在風扇輔助烘箱中在55Γ下干燥96小時；另一個樣品用于制備水 提物，W測定pH值，評價微生物群和檢查發酵終產物。
[0045] 將干燥的樣品在使用30-目篩網的Willey-型研磨機中磨碎，并儲存在標記的塑料 罐中。分析了樣品的DM含量（A0AC(1990)0fficial methods of analyses,第15版， Washington,DC,USA：Association of Official Analytical Chemists)，通過酪方法分析 了水溶性碳水化合物（WSC)(Dubois M，Gilles KA，化milton JK，Rebers PA，Smith F (1956)Colorimetric method for determination of sugars 曰nd related substances， Anal化em 28:350-356)和通過Holden描述的分析了中性去污劑纖維（NDFKComparison of methods of in vitro dry matter digestibility for ten 565feeds.J Dairy Sci 82:1791-1794; 1999)，使用Ankom纖維分析儀（ANKOM Technology Coloration Jai巧o;rt， NY, USA)并基于DM來表示。
[0046] 根據C曰rv曰Iho等（Effects of propionic acid and Lactobacillus buchneri (SIL 72)曰ddition on fermentative 曰nd microbiological characteristics of sugar cane silage treated with or without calcium oxide,Grass Forage Sci doi: 10.1111/j . 1365-2494.2012.00863. X)，通過HPLC測量了 乙醇、1，2-丙二醇 W及乳酸、乙酸、 丙酸和下酸的水平。通過將其停留時間與已知標準品的停留時間進行比較來鑒別酸、乙醇 和1,2-丙二醇。通過外部校準方法來測定鑒定的化合物的濃度。HPLC裝置（Shimadzu型號 LC-lOAi ; Shimadzu Co巧.，東京，日本)配備有由紫外檢測儀(UV-VisSPD-lOAi)和折射率檢 測儀（RID 10A)組成的雙檢測系統。將在50°C下運行的來自aiimadzu(Shim-pack SCR- 101H;7.9mm X 30cm)的離子排阻柱用于色譜分離。移動相由lOOmM高氯酸溶液組成，使用 0.6mL分鐘-1的流速。通過UV吸收(210nm)檢測了酸。使用折射率檢測儀鑒定了乙醇和1,2- 丙二醇。使用電位計化xpandomatic Beckman SS-2)測量了抑值。
[0047] 如表2中所示，接種了SIL 51和SIL 52菌株的具有最低DM損耗的青膽飼料具有濃 度低于SIL 34和對照的乙醇濃度。導致具有最高DM損耗的青膽飼料的SIL 34產生了最高量 的乳酸。在接種了SIL 51和SIL 52菌株的青膽飼料中，還注意到了與SIL 34和對照相比較 高濃度的乙酸和1,2-丙二醇。丙酸水平相似地低，與SIL 34和對照青膽飼料一致。
[0048] 表2在沒有使用接種劑和使用希氏乳桿菌接種劑青膽第61天時甘薦青膽飼料的乳 酸、乙酸、丙酸和下酸W及乙醇和1，2-丙二醇
[0049]
[0化日]微生物分析
[0051]將新鮮草料和接種61天后的甘薦青膽飼料的樣品（70g)與630mL的0.1%無菌蛋白 腺水混合并在軌道混合器中用12化pm攬拌20分鐘。隨后，制備10-倍稀釋，W定量不同的微 生物組。在厭氧解育(AnaeroGen; 0x0 id，Bas ingstoke，UK)后，使用含有0.1 %鹽酸半脫氨酸 (Merck, Dasmstadt，德國）和0.4%放線菌酬（0.4%)(Sigma)的MRS瓊脂（De Man Rogosa Sha巧e，Difco，Detroit，MI，USA)將乳酸細菌(LAB)逐一計數。將平板在30°C下解育48小時。 將平板在28°C下解育72小時后，在Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol培養基 (DRBC，DifCO;Becton Dickinson，Sparks，MD，USA)上，將酵母和絲狀真菌逐一計數。對于所 有微生物，只計數含有30至300c化的平板。
[0052] 青膽飼料的有氧穩定性的評價
[0053] 青膽90天后，打開迷你青膽魯，并且從每個迷你青膽魯中取出大約3kg的重復Ξ份 的樣品，并且放入5-kg塑料倉中，W評價其有氧穩定性。將溫度計插入青膽飼料堆中，至 10cm的深度，持續7天。將容器保存在具有26°C ( ± 1.5°C)受控溫度的房間中。每8小時記錄 青膽飼料溫度。使用接近于倉的溫度計測量環境溫度。有氧穩定性被定義為在升高高于環 境溫度超過2 °C前青膽飼料保持穩定的小時數。
[0054] 表3.使用接種劑的甘薦青膽飼料的有氧穩定性
[0化5]
[0056] 如表3中所示，在青膽魯打開后，對照青膽飼料的溫度穩定了大約21.3小時，而接 種了SIL 51和52菌株的青膽飼料分別在26.7和21.3小時后失去溫度穩定性。SIL 51和52菌 株達到最大溫度的時間都較長。因此，SIL 51和SIL 52菌株獲得了具有比SIL 34和對照青 膽飼料更好的溫度穩定的青膽飼料。
[0057] 接種了植物乳桿菌株SIL 34的產生了乳酸的青膽飼料在24小時后失去了溫度穩 定性。然而，SIL 34菌株獲得了具有較高乙醇含量、較高酵母計數和更高DM損耗的青膽飼 料。SIL 51和SIL 52菌株給青膽飼料提供了更好的特征，如較小的酵母群、較低的乙醇含量 和較低的DM損耗。
[005引實施例2:玉米青膽飼料的有氧穩定性
[0化9] 使用布氏乳桿菌NCIMB40788(Mann等的美國專利齡.6,326,037)、植物乳桿菌5化 34和希氏乳桿菌菌株SIL 51 (2013年6月26日提交的CNCM 1-4784)和SIL 52(2013年6月26 日提交的CNCM 1-4785)作為接種劑，如實施例1中所述的，在微-青膽魯中生產了玉米青膽 飼料。將未使用任何接種劑的青膽飼料用作對照。按照實施例1中所述的培養了接種劑。
[0060] 青膽90天后，打開迷你青膽魯，并且從每個迷你青膽魯中取出大約3kg的樣品，并 且放入化g塑料倉中，W評價其有氧穩定性。將數據記錄儀插入青膽飼料堆中，至10cm的深 度，持續7天。使用位于倉附近的數據記錄儀測量了環境溫度。關于青膽飼料有氧穩定性的 數據顯示于表4中。
[0061] 表4.使用接種劑的玉米青膽飼料的有氧穩定性。
[0062]
[0063] 劑量 l = l〇5cfu/g;2=l〇6cfu/g
[0064] 如表4中所示，打開青膽魯后，對照青膽飼料的溫度穩定了大約42.7小時，而接種 了SIL 51和52菌株的青膽飼料分別在73.05和53.35小時后失去溫度穩定性。接種了SIL 34的青膽飼料穩定了 17.4小時。接種布氏乳桿菌NCIMB 40788的青膽飼料穩定了60.5小時。 SIL 51和SIL 52菌株獲得了溫度穩定性優于接種了SIL 34和對照青膽飼料的青膽飼料。 SIL 51和SIL 52菌株還獲得了溫度穩定性優于NCIMB 40788青膽飼料的青膽飼料。
[0065] 盡管已經結合其特定的實施方案描述了本發明，但將理解其能夠進一步修改并且 運種描述旨在涵蓋一般來說，按照本發明的原理本發明的任何變化、使用或適應性的改變， 并且包括在本發明所屬領域內已知的做法或慣例內的本發明公開內容的運種脫離，并且其 可適用于本文中之前所闡明的必要特征，并且落入W下所附權利要求的范圍。
【主權項】
1. 青飼料接種劑，其包含青飼料保存有效量的希氏乳桿菌（Lactobacil lus hilgardii)〇2. 根據權利要求1的青貯飼料接種劑，其中所述希氏乳桿菌是具有2013年6月26日提交 的保藏號CNCM 1-4784的希氏乳桿菌菌株SIL51和具有2013年6月26日提交的保藏號CNCM 1-4785的希氏乳桿菌菌株SIL52中的至少一種，或其遺傳等價物。3. 用于處理青貯飼料的方法，包括將青貯飼料接種劑加入所述青貯飼料中，所述青貯 飼料接種劑包含青1C飼料保存有效量的希氏乳桿菌，所述青1C飼料接種劑能有效防止或降 低有氧酸敗。4. 根據權利要求3的方法，其中所述希氏乳桿菌是具有2013年6月26日提交的保藏號 CNCM 1-4784的希氏乳桿菌菌株SIL51和具有2013年6月26日提交的保藏號CNCM 1-4785的 希氏乳桿菌菌株SIL52中的至少一種，或其遺傳等價物。5. 根據權利要求3或4的方法，其中所述青貯飼料是傳統青草、玉米、紫花苜蓿、枯萎的 青草、谷類作物或甘蔗青貯飼料。6. 根據權利要求3至5任一項的方法，其中所述青貯飼料在捆包、袋、倉、倉狀青貯窖或 青貯窖中。7. 青貯飼料，其包含青貯飼料保存有效量的希氏乳桿菌。8. 權利要求7的青貯飼料，其中所述希氏乳桿菌是具有2013年6月26日提交的保藏號 CNCM 1-4784的希氏乳桿菌菌株SIL51和具有2013年6月26日提交的保藏號CNCM 1-4785的 希氏乳桿菌菌株SIL52中的至少一種，或其遺傳等價物。9. 具有2013年6月26日提交的保藏號CNCM 1-4784的希氏乳桿菌菌株SIL51的分離菌 株，或其遺傳等價物。10. 具有2013年6月26日提交的保藏號CNCM 1-4785的希氏乳桿菌菌株SIL52的分離菌 株，或其遺傳等價物。
【文檔編號】A23K30/18GK106028829SQ201480044449
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2014年7月3日
【發明人】R·弗雷塔斯施宛, C·L·席爾瓦艾維拉, J·卡多索品托, E·舍沃, R·施密特
【申請人】丹斯塔發酵股份公司