一種復合型抗氧化肽及制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及功能性食品加工技術領域，具體涉及一種復合型抗氧化肽及其制備方法。
【背景技術】
[0002]玉米醇溶蛋白是玉米中的主要蛋白質，具有獨特的溶解特性、耐熱性、成膜性和抗氧化性，可用于防潮隔氧、抗紫外線、保鮮、防靜電等，還有一定的抑菌作用，其含有高比例的亮氨酸、丙氨酸和異亮氨酸等疏水性脂肪族氨基酸，在其多肽鏈中存在抗氧化、抗高血壓，促酒精代謝等的功能序列區，采用必要的改性方法，可以使其功能特性釋放出來，用于開發功能食品。
[0003]大豆蛋白是一種營養豐富的優質植物蛋白，主要由伴球蛋白(7S)和球蛋白(11S)組成，經過水解后可以得到一定功能性質的肽段，一方面具備易消化、抗疲勞、增強體力等特性，還具備一定的生理活性物質，在機體內有多種生理功能，使大豆肽在保健食品中的應用具有廣泛的前景。特別經過生物酶改性，是一種新興、無毒副作用、安全可行的改性方式，具有重要的應用意義。
[0004]啤酒糟歷來被認為是有價值的飼料，它的蛋白質含量高達25%~30%。經啤酒糟超聲堿提的麥芽蛋白具有較高的營養價值和較好的功能性質，但不很理想，其功能特性尚不能滿足現代食品加工的要求，尤其是溶解性較差的問題，限制了麥芽蛋白在食品工業上的應用，有必要對其進行改性和修飾，從而使麥芽蛋白的功能性質得以改善。
[0005]生物活性復合肽是多種原料綜合利用的新型研究成果，可有效的提高和拓展生物活性肽的生理功能，實現各種特性的優勢互補，同時其抗氧化活性與加工特性均有了較強的改善，在保健品的開發上有著廣闊的前景。
[0006]目前生物活性肽的常用制備方法有化學合成法、酶解法和微生物發酵法。化學法存在成本高，有殘留化合物等問題，僅用于生產高價的藥理級肽。酶解法由于其生產條件溫和、反應過程易于控制，已被廣泛應用到生物活性肽的工業生產上，然而大多數商品酶制劑價格昂貴，微生物發酵法制備的抗氧化肽苦味較低，芳香味較濃，然而微生物發酵法結合酶解法在抗氧化肽的制備方面還略有欠缺，仍多處于實驗室廣泛探究中。

【發明內容】

[0007]本發明的目的是為了得到一種具備玉米醇溶蛋白、大豆水解蛋白以及麥芽蛋白多種功能特性的發酵型、速溶抗氧化肽產品，具備降壓、抗疲勞、醒酒、抗氧化以及優質加工特性的功能性。
[0008]本發明的另一個目的是解決單一品種抗氧化肽功能性不足的問題。
[0009]本發明是一種利用枯草芽孢桿菌種子菌懸液液態發酵玉米醇溶蛋白、大豆水解蛋白及麥芽蛋白混合蛋白制備復合抗氧化肽的方法，是通過以下步驟實現的:
一、一種復合型抗氧化肽發酵底物包括下述重量比的原料: 玉米醇溶蛋白 70~85%;
大豆水解蛋白 10~20% ;
麥芽蛋白5~10%;
二、其制備方法如下:
1、制備玉米醇溶蛋白:
取玉米蛋白粉，經二氧化碳超臨界脫色工藝，反應溫度45~50°C，出口閥溫度90~100°C，反應壓力300~400bar，提取時間120min，流體流量6L/h進行脫色除雜處理。依微波-超聲聯合浸提，經脫色的玉米蛋白粉按1:20的料液比(m/v)加入70%的乙醇溶液，以440W輸出功率的微波反應器提取三次，每次60s，4000r/min離心30min取上清液備用；將去上清液后的蛋白粉按1:10的料液比(m/v)加入70%的乙醇，用超聲波復提，萃取溫度45~50°C，超聲作用時間20~25min，合并兩次離心上清液，減壓濃縮，控制乙醇濃度不高于50%。將減壓濃縮液加入冷水稀釋，同時調pH6.0-6.2，得到玉米醇溶蛋白沉淀，以純凈水反復沖洗，得沉淀物。將沉淀物置超低溫冰箱-60~-80°C冷凍24h，再由真空冷凍干燥機冷凍干燥10h得玉米醇溶蛋白成品；
2、制備大?水解蛋白:
取低溫豆柏，加入豆柏20倍的純凈水，用2 mol/L NaOH調pH至80~8.1，攪拌2.5h后，在4°C條件下4000r/min離心30min，離心后將上清液以2 mol/L HC1調pH至4.2-4.5。在4°C條件下8000r/min離心20min。用純凈水洗滌沉淀三次，加入一定比例的純凈水用乳化機使沉淀形成分散體系，并用2 mol/LNaOH調pH至7.0~7.2。真空冷凍干燥備用。將得到的大豆分離蛋白用PH6.2的磷酸鹽緩沖溶液配制一定量的蛋白溶液，采用低頻低溫超聲，超聲時間20min對大豆分離蛋白進行改性。改性后的大豆蛋白采用超靜壓兩步酶水解反應生成大豆水解蛋白，第一步:胃蛋白酶在超靜壓200MPa，pH2.0，溫度37°C，添加量5%，酶解15min ;第二步，迅速調節pH 8.5，溫度60 °C，添加6%堿性蛋白酶(2.0X104 U/g)，在恒定pH條件下反應12h，置于100°C水浴滅酶15min，冷卻室溫后4000r/min離心20min取上清液，調節pH至等電點，8000r/min離心30min取沉淀物。將沉淀物置超低溫冰箱_60~-80°C冷凍24h，再由真空冷凍干燥機冷凍干燥10h得大豆水解蛋白成品；
3、制備麥芽蛋白:
取啤酒糟，按1:12的料液比(m/v)加入0.lmol/L的氫氧化鈉溶液，在50~60°C，功率為180~200W的超聲提取器中提取1~1.5h，4000r/min離心20min，取上清液，調節pH為4.0-4.5，再8000r/min冷凍離心分離，沉淀置超低溫冰箱-60~_80°C冷凍24h，再由真空冷凍干燥機冷凍干燥10h得麥芽蛋白成品；
4、按照配方比例合并前三步得到的玉米醇溶蛋白，大豆水解蛋白以及麥芽蛋白，按1:20的料液比(m/v)加入純凈水，攪拌均勻成懸濁液的分散體系；
5、將上述均勻的分散體系調節pH至7.8~8.0，用高壓蒸氣滅菌鍋在121°C殺菌20min，取出冷卻至室溫，加入5% (mL / mL)酶活力為2000 U/mL的枯草芽孢桿菌種子菌懸液，混勻，于37 °C、150~180 r/min條件下振蕩培養48 h，置沸水浴中加熱15 min，然后迅速冷卻至室溫，以4000 r/min離心20 min獲取上清液，調節等電點至4.5，沉降離心，以純凈水洗滌后，再離心，取沉淀物；
6、將上述沉淀物置超低溫-60~-80°C冰箱冷凍24h，再由真空冷凍干燥機冷凍干燥，冷阱溫度_75~-80°C，真空度1.0Pa，冷凍干燥10h得復合型抗氧化肽成品。
[0010]本發明以枯草芽孢桿菌種子菌懸液為發酵菌，以玉米醇溶蛋白、大豆水解蛋白及麥芽蛋白混合分散體系為發酵底物，進行液態發酵，將枯草芽孢桿菌種子發酵法和酶水解底物結合起來，在發酵過程中可以分解、改性大量的功能性抗氧化蛋白肽。本發明具有簡化工藝流程，降低制備成本，使產物多樣性等優點，制備的復合型抗氧化肽，功能突出，速溶性強及加工特性顯著等優勢，適用于降壓、抗疲勞、醒酒、抗氧化等功能性蛋白肽產品的開發。該發明以發酵法改性醇溶蛋白使其研究階段進入高潮期，解決單一品種抗氧化肽功能性不足的問題。
【具體實施方式】
[0011]實施例1按照下列步驟制備本發明的復合型抗氧化肽:
1、制備玉米醇溶蛋白:取500g濕法生產玉米淀粉的主要副產物玉米蛋白粉，要求蛋白含量70%以上，經二氧化碳超臨界脫色工藝，反應溫度45°C，出口閥溫度100°C，反應壓力400bar，提取時間120min，流體流量6L/h進行脫色除雜處理。依微波_超聲聯合浸提，經脫色的玉米蛋白粉加入70%的乙醇lOOOOmL，以440W輸出功率的微波反應器提取三次，每次60s，4000r/min離心30min取上清液備用；將去上清液后的蛋白粉加入70%的乙醇5000mL,用超聲波復提，萃取溫度45°C，超聲處理20min，合并兩次離心上清液，減壓濃縮，控制乙醇濃度不高于50%。將減壓濃縮液加入冷水稀釋，同時調pH6.0，得到玉米醇溶蛋白沉淀，以純凈水反復沖洗，得沉淀物。將沉淀物置超低溫冰箱_80°C冷凍24h，再由真空冷凍干燥機冷凍干燥10h得玉米醇溶蛋白成品；
2、制備大豆水解蛋白:取低溫豆柏500g加入10000g的純凈水，用2mol/L NaOH調pH至8.1，攪拌2.5h后，在4°C條件下4000r/min離心30min，離心后將上清液以2 mol/L HC1調pH至4.5。在4°C條件下8000r/min離心20min。用純凈水洗滌沉淀三次，加入一定比例的純凈水用乳化機使沉淀形成分散體系，并用2 mol/LNaOH調pH至7.0。真空冷凍干燥備用。取得到的大豆分離蛋白100g用pH6.2的磷酸鹽緩沖溶液配制一定量的蛋白溶液，采用低頻低溫超聲(20KHz，0°C水浴循環，400W)條件下超聲時間20min對大豆分離蛋白進行改性。改性后的大豆蛋白采用超靜壓兩步酶水解反應生成大豆水解蛋白，胃蛋白酶先在超靜壓200MPa，pH2.0，溫度37°C，酶添加量5g，酶解15min ;然后迅速調節pH 8.5，溫度60 °C，添加6g堿性蛋白酶(2.0X104 U/g)在恒定pH條件下反應12h，置于100°C水浴滅酶15min，冷卻室溫后4000r/min離心20min取上清液，調節pH至等電點，8000r/min離心30min取沉淀物。將沉淀物置超低溫冰箱_80°C冷凍24h，再由真空冷凍干燥機冷凍干燥10h得大豆水解蛋白成品；
3、制備麥芽蛋白:啤酒廠生產啤酒的副產物啤酒糟500g，要求蛋白含量28%以上，加入6000 mL 0.lmol/L的氫氧化