專利名稱：來源于擬南芥屬的尿嘧啶通透酶用作除草劑靶基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種從擬南芥屬(arabidopsis)中分離的編碼幼苗生長所必需的蛋白質的基因。本發明也包括利用該蛋白質作為除草劑靶標的方法，這是基于該基因對于正常生長和發育的重要性。本發明也可作為篩選試驗用于鑒定是可能的除草劑的抑制劑。本發明也可用于除草劑耐受性植物、植物組織、植物種子和植物細胞的開發。
用除草劑控制農田中不希望的植被如雜草的應用幾乎已普遍實施。除草劑市場每年超過150億美元。盡管如此廣泛的應用，雜草的控制對于農民仍是一個重要且高代價的問題。
除草劑的有效使用需要完善的管理。例如，施用的時間和方法及雜草植物的生長階段對于用除草劑獲得良好的雜草控制是關鍵的。由于多種雜草種耐受除草劑，所以新的有效除草劑的生產變得越來越重要。現在能用采用重組DNA技術的高通量篩選發現新型除草劑。發現為植物生長和發育所必需的代謝酶能通過標準分子生物學技術重組產生，并能在篩選新型酶活性抑制劑中用作除草劑的靶標。通過這種篩選發現的新型抑制劑然后可作為除草劑來抑制不希望的植被。
遺憾的是，具有較高效能、較廣雜草譜和在土壤中較快降解的除草劑也可能具有較大的作物植物毒性。解決該問題的一個辦法是產生對除草劑有抗性或耐受性的作物。耐受除草劑的作物雜種或變種使得能用除草劑消滅雜草，而無損害作物的危險。耐受性的產生使得能在以前由于作物對除草劑敏感而避免或限制其應用(例如種子出土前施用)的情況下對作物施用除草劑。例如，Anderson等人的美國專利號4,761,373涉及對多種咪唑啉酮或磺酰胺除草劑有抗性的植物。這種抗性由一種改變的乙酰羥酸合酶(AHAS)賦予。Goodman等人的美國專利號4,975,374涉及含有編碼突變谷氨酰胺合成酶(GS)的基因的植物細胞和植物，其耐受已知可抑制GS的除草劑如膦絲菌素和甲硫氨酸磺酰亞氨的抑制。Bedbrook等人的美國專利號5,013,659涉及表達突變乙酰乳酸合酶的植物，該酶使植物耐受磺酰脲除草劑的抑制。Somers等人的美國專利號5,162,602公開了耐受環己二酮和芳氧基苯氧基丙酸除草劑的植物。這種耐受性由一種改變的乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)賦予。
盡管有上述進展，但仍存在固有的和新出現的關于不希望的或有害的植被生長(例如雜草)的問題。而且，由于人口持續增長，食物缺乏將越來越嚴重。因此，一直需要但仍未發現有效且經濟的新的除草劑。定義為清楚起見，在本說明書中使用的某些術語定義如下嵌合用來指一種DNA序列(如載體或基因)，其包含超過一種不同來源的DNA序列，它們通過重組DNA技術融合在一起，產生一種非天然存在的DNA序列。
輔因子酶催化反應中所需的天然反應物，如有機分子或金屬離子。輔因子包括，例如，NAD(P)、核黃素(包括FAD和FMN)、葉酸、鉬蝶呤(molybdopterin)、硫胺素、生物素、硫辛酸、泛酸和輔酶A、S-腺苷甲硫氨酸、吡哆醛磷酸、泛醌、甲基萘醌類。任選地，輔因子能再生并重新使用。
DNA改組DNA改組是一種在DNA分子中優選地隨機引入突變或重排或在兩種或多種DNA分子間優選地隨機產生DNA序列交換的方法。DNA改組產生的DNA分子是一種改組DNA分子，它是由至少一種模板DNA分子衍生的非天然存在的DNA分子。改組DNA編碼一種相對于模板DNA所編碼的酶而言改變的酶，優選地相對于模板DNA所編碼的酶具有改變的生物活性。
酶活性在此是指酶催化底物轉化為一種產物的能力。酶的底物包括酶的天然底物，還包括也能被該酶轉化為一種產物或產物類似物的天然底物的類似物。酶活性的測定方法包括例如，在一段時間之后測定反應產物的量，或在一段時間之后測定反應混合物中殘留的底物的量。酶活性的測定方法也包括，在一段時間后測定反應混合物中殘留的未用的反應輔因子的量，或在一段時間后測定反應混合物中消耗的輔因子的量。酶活性的測定方法也包括，在一段時間后測定反應混合物中殘留的自由能或高能分子供體(例如ATP、磷酸烯醇丙酮酸、乙酰磷酸或磷酸肌酸)的量，或在一段時間后測定反應混合物中消耗的自由能或高能分子供體(例如ADP、丙酮酸、乙酸或肌酸)的量。
表達是指內源基因或轉基因在植物中的轉錄和/或翻譯。例如，對于反義構建體，表達可以僅指反義DNA的轉錄。
基因是指一種編碼序列或相關的調節序列，其中該編碼序列可轉錄為RNA如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有義RNA或反義RNA。調節序列的實例是啟動子序列、5’和3’非翻譯序列。可能存在的其他元件是例如內含子。
目的……基因是指當轉移給植物時賦予該植物一種希望的特性的任何基因，這些特性如抗生素抗性、病毒抗性、昆蟲抗性、病害抗性、或對其他害蟲的抗性、除草劑耐受性、提高的營養價值、改善的在工業加工中的表現或改變的繁殖能力。“目的基因”也可以是轉移給植物以在該植物中產生具商業價值的酶或代謝物的基因。
除草劑一種用來殺死或抑制植物、植物細胞、植物種子或植物組織生長的化學物質。
異源DNA序列與被導入的宿主細胞不天然相關的一種DNA序列，包括天然存在的DNA序列的非天然存在的多個拷貝。
同源DNA序列與被導入的宿主細胞天然相關的一種DNA序列。
同一性序列同一性的百分數用基于動態編程算法的計算機程序確定。在本發明范圍中優選的計算機程序包括BLAST(基本局部對比搜索工具)搜索程序，其用來搜索所有可獲得的序列數據庫，而不論查詢條件是蛋白質還是DNA。該搜索工具的BLAST 2.0版(缺口BLAST)已在因特網上公開(當前http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。與總體對比相反，它使用搜索局部的試探性算法，因此能探明只共有分離區域的序列之間的關系。BLAST搜索中指定的得分具有明確的統計學解釋。
抑制劑一種化學物質，其能滅活蛋白質如生物合成酶、受體、信號轉導蛋白、結構基因產物或植物生長或存活所必需的轉運蛋白的酶活性。在本發明說明書中，抑制劑是一種可滅活源自植物的4788的酶活性的化學物質。
等基因的除了可在轉基因的存在與否方面不同之外，遺傳學上相同的植物。
分離的在本發明說明書中，分離的DNA分子或分離的酶是經人工而存在于其天然環境之外的DNA分子或酶，因此不是一種天然產物。分離的DNA分子或酶可以純化的形式存在，或存在于非天然環境如轉基因宿主細胞中。
標記基因一種編碼選擇性或可篩選性狀的基因。
成熟蛋白質通常導向于細胞器如葉綠體，且轉運肽已被從其上切除的蛋白質。
最小啟動子啟動子元件，特別是TATA元件，其為無活性的，或可在無上游激活的情況下具有大大降低的啟動子活性。在適當轉錄因子的存在下，最小啟動子負責允許轉錄。
改變的酶活性不同于植物中天然存在的酶(即在未直接或間接人工操作這種活性時天然存在的酶活性)的酶活性，其耐受可抑制天然存在的酶活性的抑制劑。
有效連接/相關如果如下兩種序列如此排列使得調節DNA序列影響編碼一種RNA或蛋白質的DNA序列的表達，那么認為該調節DNA序列與編碼RNA或蛋白質的DNA序列“有效連接”或“相關”。
植物是指任何植物，特別是種子植物。
植物細胞植物的結構與生理學單位，包括原生質體和細胞壁。植物細胞可能為分離的單細胞或培養細胞的形式，或者作為高級組織單位如植物組織或植物器官的一部分。
植物材料是指葉、莖、根、花或花部分、果實、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、卵細胞、合子、胚、種子、插條、細胞或組織培養物或其他任何部分或植物的產物。
前蛋白通常導向細胞器如葉綠體且仍含有其轉運肽的蛋白質。
重組DNA分子用重組DNA技術連接在一起的DNA序列的組合。
重組DNA技術用來連接DNA序列的方法，例如，如Sambrook等人，1989，冷泉港，NY冷泉港實驗室出版社所述。
選擇性標記一種基因，其在植物細胞中的表達給予該細胞一種選擇有利性。與未轉化的細胞的生長相比，用選擇性標記基因轉化的細胞所具有的選擇有利性可能是由于其在負選擇劑(如抗生素或除草劑)存在下生長的能力。與未轉化的細胞相比，轉化細胞具有的選擇有利性也可能是由于其增強的或新的利用添加的化合物作為養分、生長因子或能源的能力。選擇性標記基因也指在植物細胞中的表達給予該細胞負選擇和正選擇有利性的基因或基因組合。
顯著提高大于測定技術中固有誤差限度的酶活性的提高，優選地在抑制劑存在下比野生型酶活性提高約2倍或更多，更優選地提高約5倍或更多，最優選地提高約10倍或更多。
顯著低于意思是酶反應產物的量大于測定技術中固有誤差的限度，優選地在不含抑制劑時比野生型酶活性降低約2倍或更多，更優選地降低約5倍或更多，最優選地降低約10倍或更多。
最廣義地來說，當在此對核苷酸序列使用時，術語“基本類似”意思是一種對應于參照核苷酸序列的核苷酸序列，其中相應的序列編碼一種具有與參照核苷酸序列編碼的多肽基本相同的結構和功能的多肽，例如，只發生不影響多肽功能的氨基酸改變。希望地，基本類似的核苷酸序列編碼參照核苷酸序列所編碼的多肽。術語“基本類似”特別包括已改變序列來優化在特定細胞中表達的核苷酸序列。基本類似的核苷酸序列與參照核苷酸序列之間同一性的百分數希望地為至少65％，更希望地為至少75％，優選地至少85％，更優選地至少90％，更優選地至少95％，再更優選地至少99％。使用Smith-Waterman序列對比算法進行序列對比(見，例如，Waterman,M.S.《計算生物學介紹圖譜、序列與基因組》。Chapman&Hall.倫敦1995.ISBN 0-412-99391-0，或http:∥www-hto.usc.edu/software/seqaln/index.html)。按下列參數使用localS程序1.16版匹配1，錯配罰0.33，開放罰區間(open-gap):2，擴展罰區間(extended-gap):2。與參照核苷酸序列“基本類似的”核苷酸序列在下列條件下可與參照核苷酸序列雜交7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA,50℃，用2×SSC、0.1％SDS在50℃下洗滌；更希望的是7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA,50℃，用1×SSC、0.1％SDS在50℃下洗滌；更希望的是7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA,50℃，用0.5×SSC、0.1％SDS在50℃下洗滌；優選的是7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mMEDTA,50℃，用0.1×SSC、0.1％SDS在50℃下洗滌；更優選的是7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA,50℃，用0.1×SSC、0.1％SDS在65℃下洗滌。
當在此對蛋白質使用時，術語“基本類似”意思是一種對應于參照蛋白質的蛋白質，其中該蛋白質具有與參照蛋白質基本相同的結構和功能，例如，只發生不影響多肽功能的氨基酸序列的變化。當用于蛋白質或氨基酸序列時，基本類似的與參照蛋白質或氨基酸序列之間的同一性百分數希望地至少為65％，更希望地至少75％，優選地至少85％，更優選地至少90％，更優選地至少95％，再更優選地至少99％。
底物底物是可被酶天然識別并能在該酶天然行使其功能的生物化學途徑中將其轉化為一種產物的分子，或是該分子的一種修飾形式，其也可被酶識別，并在類似于天然發生的反應的酶促反應中被該酶轉化為一種產物。
耐受性當接觸足以抑制天然、未改變的植物之正常生長或行使功能的量的抑制劑或除草劑時，持續正常生長或行使功能的能力。
轉化一種向細胞、組織或植物中導入異源DNA的方法。轉化的細胞、組織或植物被認為不僅包括轉化方法的終產物而且包括其轉基因后代。
轉基因的用優選地包含與目的DNA序列有效連接的適當啟動子的重組DNA分子穩定轉化的。序列表中的序列簡述
SEQ ID NO:1擬南芥4788基因的基因組DNA序列SEQ ID NO:2擬南芥4788基因的cDNA序列SEQ ID NO:3擬南芥4788蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:4寡核苷酸SLP346for本發明的一個目的在于提供一種有效且有益的鑒定新型除草劑的方法。本發明的一個特征在于擬南芥屬中推斷的通透酶基因的鑒定。本發明的另一個特征在于發現了推斷的通透酶基因是幼苗生長和發育所必需的。本發明的一個優點是新發現的具有新型除草作用模式的必需基因使本領域技術人員能容易且快速地鑒定新型除草劑。
本發明的一個目的在于為測定具有除草劑活性的抑制化合物提供一種必需的植物基因。遺傳學結果顯示，當擬南芥屬中推斷的通透酶基因突變時，產生的表型在純合狀態中是幼苗致死的。這表明了突變基因所編碼的基因產物的重要作用。
利用T-DNA插入誘變，本發明的發明者證明了該活性在擬南芥幼苗中是必需的。這意味著可抑制植物中蛋白質功能的化學品可能對植物具有有害作用，并且可能是良好的除草劑候選物。因此本發明提供利用以下所述基因序列編碼的純化的蛋白質鑒定其抑制劑的方法，然后可用該抑制劑作為除草劑例如在作物生長的田地中抑制不希望的植被的生長，特別是農業上重要的作物，如玉米及其他谷類作物，如小麥、燕麥、黑麥、高粱、稻、大麥、谷子、草皮草和牧草等，以及棉花、甘蔗、甜菜、油籽油菜和大豆。
本發明公開了一種來源于擬南芥屬的新型核苷酸序列，稱為4788基因。該基因組克隆的核苷酸序列示于SEQ ID NO:1中，相應cDNA克隆的核苷酸序列示于SEQ ID NO:2中，擬南芥4788蛋白質的氨基酸序列示于SEQ ID NO:3中。本發明也包括與SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示基本類似的核苷酸序列。
本發明也包括與SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示基本類似的核苷酸序列，其中該核苷酸序列是一種植物核苷酸序列。優選的是一種與SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示基本類似的核苷酸序列，其中該核苷酸序列是一種擬南芥(Arabidopsis thaliana)核苷酸序列。
還包括一種與SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示基本類似的核苷酸序列，其中所編碼的蛋白質具有通透酶活性。更優選的是一種與SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示基本類似的核苷酸序列，其中所編碼的蛋白質具有嘌呤或嘧啶通透酶活性。特別優選的是一種與SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示基本類似的核苷酸序列，其中所編碼的蛋白質具有尿嘧啶通透酶活性。還包括一種氨基酸序列，其包含由基本類似于SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。還包括一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所編碼的氨基酸序列。
本發明也包括氨基酸序列與SEQ ID NO:3所示氨基酸序列基本類似的蛋白質。
也包括一種包含基本類似于SEQ ID NO:3的氨基酸序列的氨基酸序列。優選的是一種包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的氨基酸序列。
包括一種氨基酸序列，其包含由基本類似于SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列，其中該蛋白質具有通透酶活性。更優選的是一種氨基酸序列，其包含由基本類似于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列，其中該蛋白質具有嘌呤或嘧啶通透酶活性。特別優選的是一種氨基酸序列，其包含由基本類似于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列，其中該蛋白質具有尿嘧啶通透酶活性。
還包括一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所編碼的氨基酸序列的至少20個連續氨基酸殘基。
還包括一種氨基酸序列，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的至少20個連續氨基酸殘基。
另一個實施方案是一種嵌合基因，其包含一種與基本類似于SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列有效連接的啟動子。
還包括一種重組載體，其包含一種含有與基本類似于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列有效連接的啟動子的嵌合基因，其中該載體能穩定地轉化至宿主細胞中。
還包括一種宿主細胞，其含有包含一種嵌合基因的載體，該嵌合基因包含與基本類似于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列有效連接的啟動子，其中該載體能穩定地轉化至宿主細胞中，而該核苷酸序列可在該細胞中表達。
根據本發明的一種優選的宿主細胞是真核細胞，更優選的是一種選自昆蟲細胞、酵母細胞和植物細胞的宿主細胞。另一種優選的宿主細胞是原核細胞，更優選的是一種細菌細胞。
也包括一種植物，其含有包含一種嵌合基因的載體，該嵌合基因包含與基本類似于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列有效連接的啟動子，其中該載體能穩定地轉化至植物細胞中；也包括這種植物的后代和種子，該種子任選地被處理(例如涂層或覆蓋)和/或包裝，例如，與使用說明書一起置于袋子或其他容器中。更優選的是根據本發明的一種植物，其中該植物耐受通透酶活性抑制劑；也包括這種植物的后代和種子，該種子任選地被處理(例如涂層或覆蓋)和/或包裝，例如，與使用說明書一起置于袋子或其他容器中。
本發明的另一個實施方案是一種方法，用于制備編碼具有改變的通透酶活性的基因產物的核苷酸序列，包括a)改組一種基本類似于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列，b)表達得到的改組核苷酸序列，和c)篩選與未改變的核苷酸序列的基因產物的通透酶活性相比，改變的通透酶活性。
優選的是根據本發明的一種方法，其中該核苷酸序列是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。更優選的是根據本發明的一種方法，其中所述通透酶活性是嘌呤或嘧啶通透酶活性。特別優選的是根據本發明的一種方法，其中所述通透酶活性是尿嘧啶通透酶活性。
本發明還包括一種改組的DNA分子，其可通過制備編碼具有改變的通透酶活性的基因產物的核苷酸序列的方法獲得，該方法包括a)改組一種基本類似于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列，b)表達得到的改組核苷酸序列，和c)篩選與未改變的核苷酸序列的基因產物的通透酶活性相比，改變的通透酶活性。
本發明的另一個實施方案是通過根據本發明的方法產生的一種改組DNA分子。
本發明也包括一種通過根據本發明的方法獲得的改組DNA分子，其中該改組DNA分子編碼一種對通透酶活性抑制劑的耐受性增強的基因產物。
本發明的另一個實施方案是一種嵌合基因，其包含與通過根據本發明的方法產生的改組DNA分子有效連接的啟動子。
本發明的另一個實施方案是一種含有一種嵌合基因的重組載體，該嵌合基因包含與通過根據本發明的方法產生的改組DNA分子有效連接的啟動子，其中該載體能穩定地轉化至宿主細胞中。
還包括一種宿主細胞，其含有包含一種嵌合基因的根據權利要求的載體，該嵌合基因包含與通過所述方法產生的改組DNA分子有效連接的啟動子，其中該載體能穩定地轉化至宿主細胞中，而該核苷酸序列可在該細胞中表達。優選的是根據本發明的一種宿主細胞，它是一種真核細胞，更優選的是該宿主細胞選自昆蟲細胞、酵母細胞和植物細胞。也優選根據本發明的一種宿主細胞，它是一種原核細胞，更優選的是一種根據本發明的宿主細胞，是一種細菌細胞。
另一個實施方案是一種植物，其包含含有根據本發明的載體的植物細胞，該載體包含的嵌合基因包含與通過根據本發明的方法產生的改組DNA分子有效連接的啟動子，其中該載體能穩定地轉化至植物細胞中，而該核苷酸序列可在該細胞中表達；也包括這種植物的后代和種子，該種子任選地被處理(例如涂層或覆蓋)和/或包裝，例如，與使用說明書一起置于袋子或其他容器中。
另一個實施方案是一種耐受通透酶活性抑制劑的根據本發明的植物；也包括這種植物的后代和種子，該種子任選地被處理(例如涂層或覆蓋)和/或包裝，例如，與使用說明書一起置于袋子或其他容器中。
另一個實施方案是一種鑒定具有除草活性的化合物的方法，包括a)在有利于結合的條件下，將一種包含由基本類似于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列的蛋白質，與一種待測定其結合該蛋白質的能力的化合物相結合，b)選擇步驟(a)中鑒定的一種能結合該蛋白質的化合物，c)將步驟(b)中鑒定的化合物施用于一種植物，檢測其除草活性，和d)選擇具有除草活性的化合物。
還包括一種可按照根據本發明的方法鑒定的具有除草活性的化合物。
還包括一種鑒定具有除草活性的通透酶活性抑制劑的方法，其包括a)將一種通透酶與一種待測定其抑制該通透酶活性的能力的化合物，在有利于這種抑制的條件下相結合，b)選擇步驟(a)中鑒定的一種能抑制該通透酶活性的化合物，c)將步驟(b)中鑒定的化合物施用于一種植物，檢測其除草活性，和d)選擇具有除草活性的化合物。
本發明包括一種根據本發明的方法，其中該通透酶是一種嘌呤或嘧啶通透酶，更優選地，該通透酶是一種尿嘧啶通透酶。
本發明的另一個實施方案是一種可按照根據本發明的方法鑒定的具有除草活性的化合物。
另一個實施方案是一種鑒定通透酶活性抑制劑的方法，其包括a)將SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2，或與之基本類似的核苷酸序列導入一種通透酶缺陷的宿主細胞如大腸桿菌uraA中，使得該序列可功能性表達；b)將含有該核苷酸序列的宿主細胞與最低抑制濃度的5-氟尿嘧啶，和一種待測定其抑制該通透酶活性的能力的化合物，在有利于這種抑制的條件下結合；c)在步驟(b)的條件下測定宿主細胞的生長；和d)選擇在步驟(c)中可抑制宿主細胞生長的化合物。
還包括一種可按照根據本發明的方法鑒定的具有除草活性的化合物。
還包括一種抑制植物生長的方法，其包括，以足夠抑制該植物生長的量向該植物施用一種化合物，該化合物可抑制包含由基本類似于SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列的氨基酸序列的活性。
還包括一種鑒定具有除草活性的化合物的方法，其包括a)在有利于結合的條件下，將權利要求10的蛋白質與一種待測定其結合該蛋白質的能力的化合物相結合，b)選擇步驟(a)中鑒定的一種能結合該蛋白質的化合物，c)將步驟(b)中鑒定的化合物施用于一種植物，檢測其除草活性，和d)選擇具有除草活性的化合物。
以及可按照根據本發明的方法鑒定的具有除草活性的化合物。
還包括一種改進作物的方法，其包括，以可抑制不希望的植被生長，但不明顯抑制除草劑耐性植物或種子生長的量，向耐受通透酶抑制劑的選自根據本發明的植物或種子的除草劑耐性植物或種子，施用一種具有除草活性的根據本發明的化合物。
本發明也包括利用4788基因產物作為除草劑靶標的方法，這基于該基因對于正常生長和發育的重要性。此外，本發明也能在篩選試驗中用來鑒定是可能的除草劑的抑制劑。
在另一個優選的實施方案中，本發明描述了一種用于鑒定能抑制植物中4788活性的化學品的方法，其優選地包括下列步驟a)獲得優選地穩定轉化的轉基因植物、植物組織、植物種子或植物細胞，其含有一種編碼具有4788活性的酶，并能過量表達酶活性4788基因產物的非天然核苷酸序列；b)對轉基因植物、植物細胞、組織或部分，并對等基因的未轉化植物、植物細胞、組織或部分施用一種化學品；c)在應用化學品后測定轉基因的和未轉化的植物、植物細胞、組織的生長或生存力；d)對比施用化學品后轉基因的與未轉化的植物、植物細胞、組織的生長或生存力；和e)選擇可抑制非轉基因植物、植物細胞、組織或部分的生存力或生長，而不明顯抑制等基因轉基因植物、植物細胞、組織或部分的生存力或生長的化學品。在一個優選的實施方案中，具有4788活性的酶由一種來源于植物，優選地來源于擬南芥的核苷酸序列編碼，該序列希望地與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列相同或基本類似。在另一個實施方案中，具有4788活性的酶由一種能編碼SEQ ID NO:3的氨基酸序列的核苷酸序列編碼。在又另一個實施方案中，具有4788活性的酶具有與SEQ ID NO:3所示氨基酸序列相同或基本類似的氨基酸序列。
本發明還包括具有改變的4788活性因此耐受在通常抑制天然存在的4788活性的水平上的除草劑的抑制植物、植物組織和植物細胞；也包括這種植物的后代和種子，該種子任選地被處理(例如涂層或覆蓋)和/或包裝，例如，與使用說明書一起置于袋子或其他容器中。本發明包括的除草劑耐性植物包括可能是正常抑制除草劑的靶標的那些植物，特別是上述農業上重要的作物。根據該實施方案，植物、植物組織、植物種子或植物細胞用一種重組DNA分子轉化，優選地穩定轉化，該重組DNA分子包含一種在植物中起作用的適當啟動子，其與編碼改變的4788基因的核苷酸編碼序列有效連接，其耐受通常抑制野生型未改變4788基因產物活性的濃度的除草劑的抑制。通過對植物提供多拷貝的野生型4788基因，或通過在強于野生型的啟動子的控制下過量表達野生型4788基因，提高野生型除草劑敏感的4788蛋白的表達，也可賦予植物改變的4788活性。然后用常規篩選技術篩選這樣產生的轉基因植物、植物組織、植物種子或植物細胞，由此分離、表征并培育除草劑耐性系。另外，也可用隨機或位點特異性誘變產生除草劑耐性系。
因此，本發明提供用一種DNA分子轉化的植物、植物細胞或植物組織，該DNA分子包含自一種植物分離的編碼具有4788活性的酶的核苷酸序列，也包括這種植物的后代和種子，該種子任選地被處理(例如涂層或覆蓋)和/成包裝，例如，與使用說明書一起置于袋子或其他容器中，其中該酶具有4788活性，并且該DNA分子賦予該植物、植物細胞、植物種子或植物組織對其量通常抑制天然存在的4788活性的除草劑的耐受性。根據本實施方案的一個實施例，具有4788活性的酶由一種與SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列相同或基本類似的核苷酸序列所編碼，或者具有與SEQ ID NO:3所示氨基酸序列相同或基本類似的氨基酸序列。
本發明也提供一種抑制植物生長的方法，包括對植物施用一種可抑制植物中天然存在的4788活性的化學品的步驟。在有關方面，本發明涉及一種在種植作物種子或植物的田地中選擇性抑制不希望的植被生長的方法，包括下列步驟(a)任選地種植除草劑耐受性作物或作物種子，它們是耐受可抑制天然存在的4788活性的除草劑的植物或植物種子；和(b)以可抑制天然存在的4788活性的量，對田地中的作物或作物種子和不希望的植被施用一種除草劑，其中該除草劑可抑制雜草的生長，而不明顯抑制作物的生長。
根據以下的發明描述和非限制性實施例，本領域技術人員將明白本發明的其他目的和優點。Ⅰ．由T-DNA插入誘變所證明的擬南芥屬中4788基因的重要性如以下實施例所示，用T-DNA插入誘變第一次在擬南芥屬中證明了新型基因結構的確定，以及4788基因對于正常植物生長和發育的重要性。由于已確定了4788功能在植物中的重要性，并鑒定了編碼這種重要活性的基因，因此發明人提供了一種研發新除草劑的重要的探索工具。
鑒定幼苗致死突變分離的擬南芥插入突變系作為必需蛋白質鑒定的第一步。由自基因組中含有T-DNA插入的單個T1植物收集的T2種子開始，鑒定那些純合幼苗和致死幼苗分離的品系。通過將種子置于含有殺真菌劑苯菌靈和maxim的基本植物生長培養基上，并在室溫和光照下7天及14天后篩選不能存活的幼苗，從而發現這些品系。不能存活的表型包括改變的色素形成或改變的形態學。可在平板上直接觀察或在幼苗移植后在土壤中觀察這些表型。
當一種品系被確定為分離幼苗致死時，確定T-DNA中的抗性標記是否與致死性共分離(Errampalli等人(1991)植物細胞(The Plant Cell)3:149-157)。通過將種子置于含有選擇劑的培養基上并檢測幼苗對選擇劑的抗性或敏感性來進行共分離分析。所用選擇劑的實例是潮霉素或膦絲菌素。將大約35株抗性幼苗移植到土壤中，并檢測其后代幼苗致死性的分離。在T-DNA插入破壞了必需基因的情況下，每種植物中均存在抗性表型和幼苗致死表型的共分離。因此，在這種情況中，所有抗性植物在下一代中分離幼苗致死性；該結果表明，就引起這兩種表型的DNA而言每一抗性植物均是雜合的。
對于顯示T-DNA抗性標記與幼苗致死表型共分離的品系，進行Southern分析作為表征每種插入的分子性質的第一步。用自雜合子分離的基因組DNA和能與T-DNA載體DNA雜交的探針進行Southern分析。通常，特定植物中的T-DNA插入顯示含有插入單遺傳基因座的多拷貝T-DNA載體。根據Southern的結果，選擇適當的限制酶進行質粒拯救，以分子克隆側翼為T-DNA插入一端或兩端的擬南芥基因組DNA。通過限制酶消化分析這樣獲得的質粒，以根據其消化模式將這些質粒歸類。對每一種類的質粒克隆均測定DNA序列。分析所得序列中非T-DNA載體序列的存在。當發現這些序列時，使用BLAST和BLAST2程序(Altschul等人，分子生物學雜志215:403-410；Altschul等人(1997)核酸研究25:3389-3402)用其搜索DNA和蛋白質數據庫。每種基因的其他基因組序列和cDNA序列用標準分子生物學方法鑒定。Ⅱ．擬南芥4788基因的序列從標記的幼苗致死系#4788中分離側翼為T-DNA邊界的DNA，測序擬南芥4788基因。側翼為T-DNA邊界的擬南芥DNA與測序的擬南芥BAC(BAC T9J22，染色體2)的內部區域相同。該BAC克隆含有115851bp的序列，其中極小一部分對應于含有4788基因的基因組區。盡管已知BAC的信息，但發明人第一個最終確定了完整基因序列，并第一次證明4788基因產物是正常生長和發育所必需的，并闡明了4788基因產物的功能。本發明公開了擬南芥4788基因的核苷酸序列，以及擬南芥4788蛋白的氨基酸序列。對應于該基因組克隆的核苷酸序列示于SEQ IDNO:1中，相應的cDNA克隆示于SEQ ID NO:2中，編碼成熟蛋白質的氨基酸序列示于SEQ ID NO:3中。本發明也包括一種來源于植物的分離的氨基酸序列，其中該氨基酸序列與由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列所編碼的氨基酸序列相同或基本類似，其中該氨基酸序列具有4788活性。利用缺省設置的BLAST和BLAST2程序，4788基因的序列顯示與尿嘧啶通透酶有相似性。
4788基因也是擬南芥基因家族的一員。該基因家族至少由6個成員組成(Genbank Acc.#s:AC002505(2739376),BAC T9J22；AC004481(3337350),BAC F13P17；AC001229(2190545),BAC F5I14；AB009053(n/a)，克隆MQB2(第13個開放閱讀框)；U83501(1791307)；和AA712474(EST克隆194H6T7)，以及AA605567(EST克隆205J16XP))。Ⅲ．4788的重組產生及其應用為在宿主生物中重組產生4788，將編碼4788蛋白的核苷酸序列插入為所選宿主設計的表達盒中，并導入宿主中，在此重組產生。特定調節序列如啟動子、信號序列、5’和3’非翻譯序列和適用于所選宿主的增強子的選擇屬于本領域技術人員的水平之內。可將得到的含有與適當閱讀框有效連接的各個元件的分子插入一種能轉化宿主細胞的載體中。用于蛋白質重組產生的適當表達載體和方法眾所周知，宿主生物如大腸桿菌、酵母和昆蟲細胞(見，例如，Luckow和Summers，生物技術6:47(1988))，桿狀病毒表達載體，如來源于苜蓿銀紋夜蛾(Autographicacalifornica)核型多角體病毒(AcMNPV)的基因組的桿狀病毒表達載體。一種優選的桿狀病毒/昆蟲系統是pAcHLT(Pharmingen,San Diego,CA)，其用來在線性苜蓿銀紋夜蛾桿狀病毒DNA(Pharmingen,San Diego,CA)的存在下轉染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9細胞(ATCC)。用得到的病毒感染HighFive Tricoplusia ni細胞(Invitrogen,La Jolla,CA)。
在一個優選的實施方案中，編碼具有4788活性的蛋白質的核苷酸序列來源于真核生物，如哺乳動物、蒼蠅或酵母，但優選地來源于植物。在另一個優選的實施方案中，該核苷酸序列與SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列相同或基本類似，或者編碼一種具有4788活性的蛋白質，其氨基酸序列與SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列相同或基本類似。SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列編碼擬南芥4788蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。在另一個優選的實施方案中，該核苷酸序列來源于原核生物，優選地細菌，如大腸桿菌中的uraA基因(Andersen等人(1995)細菌學雜志(J.Bacteriol.)177:2008-2013)。用多種標準技術分離并純化重組產生的4788。目前可使用的技術將依所用的宿主生物，蛋白質是否分泌，及技術人員熟知的其他這類因素而不同(見，例如，Ausubel,F.等人，《現代分子生物學技術》第16章，John Wiley&Sons,Inc.出版(1994))。表征4788蛋白的試驗重組產生的4788蛋白可用于多種用途。例如，它們能在體外試驗中用來篩選尚未鑒定其靶標的已知除草化學品，來確定它們是否抑制4788。這種體外試驗也可作為更普通的篩選方法用來鑒定可抑制這種酶活性，因此是新型除草劑候選物的化學品。另外，重組產生的4788蛋白也可用于闡明這些分子的復雜結構，并進一步表征其與已知抑制劑的結合，以合理地設計新的抑制性除草劑及除草劑耐受形式的酶。在此處例舉的試驗中能使用包括微生物來源在內的任何來源的基本類似于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列和基本類似于SEQ ID NO:3的蛋白質。希望地，這些核苷酸序列和蛋白質來源于植物。更希望地，其來源于雙子葉植物。另外，這些核苷酸序列和蛋白質也可來自非玉米來源，另外可來自非單子葉植物來源。通透酶活性的測定4788基因產物據認為起通透酶的作用，更具體而言起類似于玉米Lpe1蛋白的尿嘧啶通透酶的作用(Schultes等人(1996)植物細胞8:463-475)。玉米的葉通透酶1基因產物類似于細菌和真菌的嘌呤和嘧啶通透酶，并已知lpe1中的突變不利地影響葉綠體發育。因此，lpe1編碼的蛋白質是一種可能的除草劑靶標，在此擬南芥4788基因產物的重要性進一步證明了這一點。根據植物蛋白質在缺乏相應活性的細菌宿主中的表達能發展一種新型試驗(Andersen等人(1995)細菌學雜志177:2008-2013)。
能發展一種簡單的試驗來篩選可影響植物編碼活性正常作用的化合物。這些化合物有希望在體外檢測體內除草活性。一種試驗包括在最低抑制濃度的5-氟尿嘧啶存在下在基本培養基中培養攜帶并功能表達4788基因的大腸桿菌uraA。這以96孔板的形式實現，以進行自動高通量篩選。在阻斷4788蛋白功能方面有效的化合物能抑制細胞攝取5-FU的能力，和細菌生長結果。這種生長用簡單的濁度測定法測定。
已經描述了基于植物基因在相應細菌突變體中表達的其他試驗。但是，除了是一種新型除草劑靶標之外，該試驗的一個特別的優點是，由于尿嘧啶通透酶在細胞表面表達，所以在抑制其功能方面有效的化合物不需要進入細胞來顯示其活性。這可能是利用細菌系統作為模型發現在植物中有效的化合物中存在的一個主要問題，因為已知由于細菌對化合物的不良攝取，多種有效除草劑缺乏對細菌的活性。體外抑制物試驗可與未知功能的蛋白質相互作用的小分子配體的發現在已確定一種蛋白質為可能的除草劑靶標后，下一步是進行一種可篩選大量化學品的試驗，來確定哪一種可與該蛋白質相互作用。盡管開發對已知功能的蛋白質的試驗是直接的，但用未知功能的蛋白質開發試驗更加困難。測該蛋白質與配體間相互作用的新技術。列出了三種方法的簡述，包括熒光相關光譜學、表面增強激光解吸/電離和biacore技術。現在發現了更多這樣的方法，根據本公開內容其中某些可用于自動化大規模篩選。
熒光相關光譜學(FCS)理論形成于1972年，但只是最近幾年FCS技術才成為可用的(Madge等人(1972)物理綜述信件(Phys.Rev.Lett.)29:705-708；Maiti等人(1997)美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)94:11753-11757)。FCS測定小樣品體積中熒光分子的平均擴散率。樣本容量能低至103個熒光分子，樣品體積可低至單個細菌的細胞質。擴散率是分子量的函數，隨分子量的增加而降低。因此FCS能通過測定分子量的改變，從而測定結合后分子擴散率的改變，用于蛋白質-配體相互作用分析。
表面增強激光解吸/電離(SELDI)由Hutchens和Yip在二十世紀八十年代后期發明(Hutchens和Yip(1993)質譜快訊(Rapid Commun.Mass Spectrom.)7:576-580)。當與飛行時間質譜儀(TOF)連接時，SELDI提供一種快速分析芯片上保留的分子的方法。它能通過共價結合芯片上的靶蛋白，并通過MS分析該蛋白質截留的小分子用于配體-蛋白質相互作用分析(Worrall等人(1998)分析生物化學(Anal.Biochem.)70:750-756)。
Biacore基于在配體與表面層上固定的蛋白質結合后該層表面折射率的變化。在該系統中，向帶有固定化蛋白質的2-5μl小室中連續注射許多小配體。用表面胞質基團共振(SPR)通過記錄從表面折射的激光檢測其結合。通常，隨表面層物質濃度特定改變的折射率改變實際上對于所有蛋白質和肽來說均相同，這使得一種方法適用于任何蛋白質(Liedberg等人(1983)傳感器與調節器(Sensors Actuators)4:299-304；Malmquist(1993)自然，361:186-187)。Ⅳ．體內抑制試驗在一個實施方案中，以不同濃度對植物施用例如經體外篩選鑒定的可疑除草劑。優選地向植物噴灑這種可疑除草劑。施用可疑除草劑之后，記錄其對植物的影響，例如死亡或生長的抑制。
在另一個實施方案中，對于4788活性抑制劑的一種體內篩選試驗使用能過量表達具有4788活性的核苷酸序列的轉基因植物、植物組織、植物種子或植物細胞，其中4788基因產物在該轉基因植物、植物組織、植物種子或植物細胞中有酶活性。該核苷酸序列優選地來源于真核生物，如酵母，但優選地來源于植物。在一個更優選的實施方案中，該核苷酸序列與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列相同或基本類似，或編碼一種具有4788活性的蛋白質，其氨基酸序列與SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列相同或基本類似。在另一個優選的實施方案中，該核苷酸序列來源于原核生物，優選地細菌，如大腸桿菌的uraA基因。
然后對轉基因植物、植物組織、植物種子或植物細胞，并對等基因的非轉基因植物、植物組織、植物種子或植物細胞施用一種化學品，在施用化學品并對比后測定轉基因的和非轉化的植物、植物組織、植物種子或植物細胞的生長或生存力。選擇能抑制非轉基因植物生長，但不影響轉基因植物生長的化合物作為4788活性的特異抑制劑。Ⅴ．除草劑耐受性植物本發明還涉及耐受可抑制這些植物中天然存在的4788活性的除草劑的植物、植物組織、植物種子和植物細胞，其中此耐受性由改變的4788活性賦予。通過對植物提供另外的野生型4788基因以提高野生型除草劑敏感4788的表達，通過在植物中表達修飾的除草劑耐受性4788基因，或通過這些技術的組合，可賦予根據本發明的植物改變的4788活性。代表性植物包括為了正常預期目的對其施用這些除草劑的任何植物。優選農業上重要的作物，如棉花、大豆、油籽油菜、甜菜、玉米、稻、小麥、大麥、燕麥、黑麥、高粱、谷子、草皮、草料、草坪草等。A．增強的野生型4788表達通過增強表達實現改變的4788活性，在植物細胞中產生足以克服除草劑引起的生長抑制的水平的4788。所表達的酶的水平通常至少2倍于，優選地至少5倍于，更優選地至少10倍于天然表達的量。增強的表達可能是由于植物細胞中的多拷貝的野生型4788基因、基因中編碼序列的成倍發生(即基因擴增)或內源基因的非編碼調節序列中的突變。具有這種改變的基因活性的植物能用本領域周知的方法通過直接植物篩選而獲得(見，例如美國專利號5,162,602和美國專利號4,761,373和此處引用的參考文獻)。這些植物也可通過本領域周知的遺傳工程技術獲得。除草劑敏感4788基因的增強表達也能通過用重組或嵌合DNA分子轉化植物細胞實現，該DNA分子包含一種能引導有關結構基因在植物細胞中表達的啟動子，該啟動子與編碼4788蛋白的同源或異源結構基因有效連接。優選地，這種轉化是穩定的，從而提供可遺傳的轉基因性狀。B．改變的除草劑耐性4788蛋白的表達根據該實施方案，用一種重組DNA分子穩定轉化植物、植物組織、植物種子或植物細胞，該DNA分子包含一種與編碼除草劑耐受形式的4788的編碼序列有效連接的在植物中有功能的適當啟動子。除草劑耐受形式的酶至少具有一種氨基酸置換、添加或缺失，其提供對可抑制未改變的、天然存在形式的酶的除草劑的耐受性。然后用常規篩選技術篩選這樣產生的轉基因植物、植物組織、植物種子或植物細胞，由此分離、表征并培育除草劑耐性系。以下描述了獲得編碼除草劑耐受形式的4788的基因的方法一種普通的策略包括對微生物的直接或間接誘變方法。例如，可用誘變劑如紫外線或甲磺酸乙酯或甲酯體內隨機誘變可遺傳操作的微生物如大腸桿菌或釀酒酵母(S.cerevisiae)。例如，Miller，《分子遺傳學實驗》，冷泉港實驗室，冷泉港，NY(1972)；Davis等人，《高級細菌遺傳學》，冷泉港實驗室，冷泉港，NY(1980)；Sherman等人，《酵母遺傳學方法》，冷泉港實驗室，冷泉港，NY(1983)；和美國專利號4,975,374中描述了誘變方法。為誘變所選擇的微生物含有一種正常的、抑制劑敏感的4788基因，并依賴于該基因所提供的活性。突變細胞在可抑制未改變基因的濃度的抑制劑存在下生長。選擇在抑制劑存在下生長好于未誘變微生物(即顯示對該抑制劑的抗性)的誘變微生物菌落進一步分析。通過克隆或PCR擴增分離來源于這些菌落的4788基因，并闡明其序列。然后將編碼改變的基因產物的序列克隆回微生物中以證實其提供抑制劑耐受性的能力。
一種獲得植物4788基因的突變除草劑耐性等位基因的方法包括直接植物篩選。例如，通過將用公認方法滅菌的種子接種于含有漸增濃度的抑制劑的簡單基本鹽培養基平板上，測定誘變4788基因對植物如擬南芥、大豆或玉米生長抑制的作用。抑制劑濃度為百萬分之0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、110、300、1000和3000(ppm)。對隨后的實驗使用能重復檢測到明顯生長抑制的最低劑量。最低劑量的確定在本領域中為常規。
用植物材料的誘變提高抗性等位基因在所選群體中出現的頻率。誘變的種子物質來自多種來源，包括種子的化學或物理誘變，或花粉的化學或物理誘變(Neuffer，《用于生物學研究的玉米》，Sheridan編，Univ.Press,Grand Forks,ND.,61-64頁(1982))，然后用其使植物受精，并收集產生的M1突變種子。對于擬南芥，一般將M2種子(Lehle Seeds,Tucson,AZ)-由用化學品如甲磺酸乙酯或用物理因素如γ射線或快中子誘變的種子長成的植物的子代種子-以可達10000個種子/平板(10cm直徑)的密度接種于含有適當濃度抑制劑的基本鹽培養基上，以根據耐受性選擇。將在接種7-21天后仍持續生長并保持綠色的幼苗移植到土壤中，生長成熟，并結種。檢測這些種子的后代對除草劑的耐受性。如果耐受性狀是顯性的，則種子抗性∶敏感性以3∶1分離的植物被認為在M2代時對于抗性而言是雜合的。而認為全部產生抗性種子的植物在M2代時對于抗性而言是純合的。對完整種子的這種誘變和對其M2代種子的篩選也能對其他物種如大豆進行(見，例如美國專利號5,084,082)。另外，通過用化學或物理方法誘變的花粉授精，獲得對除草劑耐受性篩選的突變種子。
如以下舉例說明的確定了除草劑耐受性的遺傳學基礎是4788基因。首先，使用基于SEQ ID NO:2所示擬南芥cDNA編碼序列的引物，或更優選地，使用基于用于產生耐受等位基因的植物的未改變4788基因序列的引物，經PCR從顯示對抑制劑的抗性的植物中分離4788基因的等位基因。對該等位基因測序確定編碼序列中存在突變后，檢測等位基因對已轉化推斷的提供耐受性等位基因的植物賦予抑制劑耐受性的能力。這些植物可以是擬南芥屬植物或其生長對4788抑制劑敏感的其他任何植物。其次，插入的4788基因對已知限制片段長度多態性(RFLP)(見，例如，Chang等人，美國國家科學院院刊85:6856-6860(1988)；Nam等人，植物細胞1:699-705(1989))、酶切擴增多態序列(CAPS)(Konieczny和Ausubel(1993)植物雜志，4(2):403-410)或SSLP(Bell和Ecker(1994)基因組學(Genomics)19:137-144)作圖。用相同的標記對4788抑制劑耐受性狀獨立作圖。當耐受性是由于4788基因的突變時，將耐受性狀對不能與4788基因位點區分的位點作圖。
另一種獲得4788基因的除草劑耐性等位基因的方法是通過植物細胞培養物的篩選。目的植物的植物組織的外植體，例如胚、葉盤等，或活躍生長的愈傷組織或懸浮培養物在漸增濃度的抑制性除草劑(或適用于實驗室環境的類似抑制劑)存在下在培養基上生長。記錄不同培養物中不同程度的生長。在某些培養物中，出現快速生長的變體菌落，其甚至在正常抑制濃度的抑制劑存在下仍持續生長。在組織或細胞接觸抑制劑之前，用化學或物理誘變劑處理能提高發生這種較快生長變體的頻率。如前段所述分離并檢測4788基因的推斷的耐受性提供等位基因。然后可為了最佳表達改造這些確定可提供除草劑耐受性的等位基因，并轉化植物。另外，能由含有這些等位基因的組織或細胞培養物再生為植物。
再另一種方法包括野生型、除草劑敏感的植物4788基因在細菌或酵母中的誘變，隨后在含有抑制濃度的抑制劑的培養基上培養該微生物，然后選擇那些在該抑制劑存在下生長的菌落。更具體而言，將植物cDNA(如編碼4788的擬南芥cDNA)克隆到一種本來缺乏所選基因活性的微生物中。然后用本領域周知的幾種化學或酶學方法中的任一種，例如亞硫酸氫鈉(Shortle等人，酶學方法(Methods Enzymol.)100:457-468(1983))、甲氧胺(Kadonaga等人，核酸研究13:1733-1745(1985))、寡核苷酸指導的飽和誘變(Hutchinson等人，美國國家科學院院刊83:710-714(1986))或多種聚合酶錯摻策略(見，例如，Shortle等人，美國國家科學院院刊，79:1588-1592(1982)；Shiraishi等人，基因64:313-319(1988)；和Leung等人，技術(Technique)1:11-15(1989))，體內誘變或體外誘變轉化的微生物。挑取在正常抑制濃度的抑制劑存在下生長的菌落，并通過重復劃線純化。純化其質粒，并通過再轉化缺乏4788基因活性的微生物檢測其提供對該抑制劑耐受性的能力。然后測定通過該測試的質粒的cDNA插入片段的DNA序列。
用包括體外重組的方法，也稱為DNA改組，也可獲得除草劑抗性4788蛋白。通過DNA改組向4788基因中引入突變，優選地隨機突變。DNA改組也導致4788基因內序列的重組和重排，或兩種或多種不同4788基因之間序列的重組和交換。這些方法可產生上百萬個突變的4788基因。根據希望的性質，例如提高的除草劑耐受性并根據提供對不同種類化學抑制劑的廣譜耐受性的突變，篩選突變基因或改組基因。這種篩選為本領域技術人員所熟知。
在一個優選的實施方案中，由至少一種模板4788基因形成突變的4788基因，其中該模板4788基因被切割為希望大小的雙鏈隨機片段，該方法包括下列步驟向產生的雙鏈隨機片段群中加入一種或多種單鏈或雙鏈寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含與雙鏈隨機片段的一個同源區和一個異源區；變性得到的雙鏈隨機片段的混合物與單鏈片段中寡核苷酸；將得到的單鏈片段群與聚合酶在可導致該單鏈片段在同源區退火形成退火片段對的條件下溫育，對片段對的一員來說該同源區足以引發另一個的復制，從而形成突變的雙鏈多核苷酸；再重復第二步和第三步至少兩個循環，其中再一循環第二步產生的混合物包含前一循環第三步的突變雙鏈多核苷酸，而再一循環形成另一種突變的雙鏈多核苷酸，其中該誘變核苷酸是一種對可抑制天然存在的4788活性的除草劑有提高的耐受性的突變4788基因。在一個優選的實施方案中，雙鏈隨機片段群中一種雙鏈隨機片段的濃度低于總DNA重量的1％。在一個更優選的實施方案中，模板雙鏈多核苷酸至少包含約100種多核苷酸。在一個更優選的實施方案中，雙鏈隨機片段的大小約為5bp～5kb。在另一個優選實施方案中，該方法的第四步包括重復第二步與第三步至少10個循環。例如，Stemmer等人(1994)自然370:389-391、美國專利5,605,793和Crameri等人(1998)自然391:288-291、Cherry等人(1999)自然生物技術17:379-384及WO 97/200078描述了該方法，這些參考文獻在此引用作為參考。
在另一個優選實施方案中，如Zhao等人(1998)自然生物技術16:258-261所述，通過交錯延伸法(StEP)體外誘變兩種或多種不同4788基因的任意組合。這兩種或多種4788基因用作PCR擴增的模板，PCR反應的延伸循環優選地在比聚合酶最適聚合溫度更低的溫度下進行。例如，當使用最適溫度約為72℃的熱穩定聚合酶時，延伸反應的溫度希望地低于72℃，更希望地低于65℃，優選地低于60℃，更優選地延伸反應的溫度為55℃。另外，PCR循環延伸反應的持續時間希望地短于本領域通常進行的持續時間，更希望地少于30秒，優選地少于15秒，更優選地延伸反應的持續時間為5秒。在每一延伸反應中只有短DNA片段聚合，這使得在每一循環的變性和退火后起始DNA分子之間延伸產物模板轉變，從而產生延伸產物的多樣性。PCR反應的最佳循環數取決于待誘變的4788編碼區的長度，但希望地超過40個循環，更希望地超過60個循環，優選地超過80個循環。4788基因每一組合的最佳延伸條件和最佳PCR循環數如述用本領域眾所周知的方法確定。PCR反應的其他參數與本領域常用的基本相同。擴增反應的引物優選地設計為與位于4788基因編碼序列外側的DNA序列退火，如與包含4788基因的載體的DNA序列退火，因此PCR反應中使用的不同4788基因優選地包含于分開的載體中。引物希望地與距4788編碼序列不到500bp處，優選地距4788編碼序列不到200bp處，更優選地距4788編碼序列不到120bp處的序列退火。優選地，4788編碼序列由限制酶切位點包圍，這些位點包含于在PCR反應中擴增的DNA序列中，從而便于擴增產物向適當載體中的克隆。
在另一個優選實施方案中，如WO 98/05765所述產生具有粘端的4788基因片段。粘端的產生方法是，將對應于4788基因一部分的第一種寡核苷酸與第二種寡核苷酸連接，此第二種寡核苷酸在基因中不存在，或對應于不與對應于第一種寡核苷酸的基因部分鄰接的基因部分，其至少含有一種核糖核苷酸。用第一種寡核苷酸作為模板并用第二種寡核苷酸作為引物產生雙鏈DNA。酶切并去除核糖核苷酸。也去除位于該核糖核苷酸5’的核苷酸，產生具有粘端的雙鏈片段。經連接隨機重裝配這些片段，獲得基因序列的新組合。
用包括靶基因原位修飾的方法也可獲得除草劑抗性蛋白質。能使用一種體內導向并突變基因的技術，其基于自體互補的嵌合寡核苷酸。該方法是為了以位點特異方式和可遺傳方式修飾內源基因而發展的(Beetham等人(1999)美國國家科學院院刊96:8774-8778；美國專利號5,756,325；美國專利號5,871,984；美國專利號5,731,181)，這些參考文獻在此引用作為參考。另外也描述了產生表現農業希望的性狀，在植物細胞中含有原位突變或修飾基因的植物的方法(WO 98/54330)，該參考文獻在此引用作為參考。這種修飾能通過定向誘變技術如同源重組進行，并根據產生的除草劑抗性表型篩選(見，例如，Pazkowski等人，EMBO J.7:4021-4026(1988)和美國專利號5,487,992，特別是18-19欄和實施例8)，這些參考文獻在此引用作為參考。
在本發明中使用任何4788基因或4788基因的任意組合進行體外重組，例如，來源于植物如擬南芥的4788基因，例如，SEQ ID NO:1或SEQID NO:2所示的4788基因，來源于細菌如熱溶芽孢桿菌(Bacilluscaldolyticus)(Ghim和Neuhard(1994)細菌學雜志176:3698-3707)或大腸桿菌(Andersen等人(1995)細菌學雜志177:2008-2013)的4788基因，來源于玉蜀黍(Zea mays)的4788基因(Schultes等人(1996)植物細胞8:463-475)，所有文獻均在此引用作為參考。在本發明中使用完整的4788基因或其部分。將用上述方法獲得的突變4788基因的文庫克隆到適當表達載體中，用得到的載體轉化適當的宿主，例如藻類如衣藻(Chlamydomonas)、酵母或細菌。適當的宿主優選地是一種本來缺乏4788活性的宿主，例如大腸桿菌uraA突變體(Andersen等人(1995)細菌學雜志177:2008-2013)。在含有抑制濃度的抑制劑的培養基上培養用含突變4788基因文庫的載體轉化的宿主細胞，選擇在該抑制劑存在下生長的菌落。挑取在正常抑制濃度的抑制劑存在下生長的菌落，經重復劃線純化。純化其質粒，然后測定通過該檢測的質粒的cDNA插入片段的DNA序列。
一種鑒定耐受抑制劑的修飾4788基因的試驗能以與鑒定4788活性抑制劑的試驗(抑制試驗，見上)相同的方式進行，其中有如下改變第一，在反應混合物之一中用突變4788替換抑制試驗的野生型4788。第二，在兩種反應混合物中均存在野生型酶的抑制劑。第三，比較突變活性(在抑制劑和突變酶存在下的活性)與未突變活性(在抑制劑和野生型酶存在下的活性)，以確定與未突變活性相比在突變活性中是否觀察到酶活性的明顯提高。在適當底物和抑制劑的存在下，突變活性是突變酶活性的量度。在適當底物和抑制劑的存在下，未突變活性是野生型酶活性的量度。明顯提高可解釋為在測定技術中高于固有誤差限度的酶活性的提高，優選地是在抑制劑存在下比野生型酶活性高至少2倍或更多倍的提高，更優選地是至少5倍或更多倍的提高，最優選地是至少10倍或更多倍的提高。
除了用來產生除草劑耐受性植物外，編碼除草劑耐受性4788的基因也能在植物細胞轉化方法中用作選擇性標記。例如，用一種轉基因轉化的植物、植物組織、植物種子或植物細胞也能用編碼一種能由植物表達的改變的4788的基因轉化。將轉化細胞轉移到含有一種酶抑制劑的培養基中，該抑制劑的量足以抑制不表達該修飾基因的植物細胞的存活，其中只有轉化細胞能夠存活。該方法適用于能用修飾4788編碼基因轉化的任何植物細胞，并能與任何目的轉基因一同使用。轉基因和修飾基因的表達能由在植物細胞中有功能的同一啟動子引導，或由不同的啟動子引導。Ⅵ．植物轉化技術利用常規重組DNA技術能將野生型或除草劑耐受形式的4788基因摻入植物或細菌細胞中。通常包括，利用本領域周知的標準克隆方法將編碼4788的DNA分子插入一種該DNA分子與之異源(即，正常不存在)的表達系統中。該載體含有插入的蛋白質編碼序列在含有該載體的宿主細胞中轉錄和翻譯所必需的元件。能使用本領域所知的多種載體系統，如質粒、噬菌體、病毒及其他修飾病毒。也可修飾表達系統的成分以增強表達。例如，可使用截短序列、核苷酸置換或其他修飾。本領域所知的表達系統可用來在適當條件下實際轉化任何作物植物細胞。包含野生型或除草劑耐受形式的4788基因的轉基因優選地穩定轉化并整合于宿主細胞基因組中。在另一個優選實施方案中，包含野生型或除草劑耐受形式的4788基因的轉基因位于一種自主復制載體中。自主復制載體的實例是病毒，特別是雙生病毒。轉化細胞能再生為整個植物，使得所選形式的4788基因在轉基因植物中提供除草劑耐受性。A．構建植物表達盒的要求首先將準備在轉基因植物中表達的基因序列裝配于表達盒中可在植物內表達的適當啟動子之后。這些表達盒也可包含轉基因表達所需或為其選擇的其他任何序列。這些序列包括但不限于，轉錄終止子、增強表達的外部序列如內含子、關鍵序列，和用于將基因產物導向特定細胞器和細胞區室的序列。然后可將這些表達盒容易地轉移至以下所述的植物轉化載體中。下面是典型表達盒的不同成分的描述。1．啟動子在表達盒中使用的啟動子的選擇將決定轉基因在轉基因植物中的空間和時間表達模式。選擇的啟動子將在特定細胞型(如葉表皮細胞、葉肉細胞、根皮細胞)或在特定組織或器官(如根、葉或花)中表達轉基因，此選擇將反映希望的基因產物積累的位置。另外，所選的啟動子可在不同誘導條件下引導基因表達。啟動子在其強度即促進轉錄的能力方面不同。根據所用的宿主細胞系統，能使用本領域所知的大量適當啟動子中的任一種。例如，組成型表達可使用CaMV 35S啟動子、稻肌動蛋白啟動子或遍在蛋白啟動子。調節型表達可使用來源于煙草或擬南芥的化學誘導型PR-1啟動子(見，例如，美國專利號5,689,044)。2．轉錄終止子多種轉錄終止子適于在表達盒中使用。它們負責轉基因之外的轉錄終止及其正確的聚腺苷酸化。適當的轉錄終止子是那些已知在植物中起作用的轉錄終止子，包括CaMV 35S終止子、tml終止子、胭脂氨酸合酶終止子和豌豆rbcS E9終止子。它們可用于單子葉及雙子葉植物。3．增強或調節表達的序列已發現許多序列能增強轉錄單位內的基因表達，這些序列可與本發明的基因結合使用而增強其在轉基因植物中的表達。例如，多種內含子序列如玉米Adh1基因的內含子，顯示能增強表達，尤其是在單子葉植物細胞中。另外，已知來源于病毒的多種非翻譯前導序列也能增強表達，且其在雙子葉植物細胞中特別有效。4．編碼序列優化為了在目的作物種中最佳表達，可通過改變編碼序列來遺傳改造所選基因的編碼序列。修飾編碼序列以實現在特定作物種中最佳表達的方法眾所周知(見，例如，Perlak等人，美國國家科學院院報88:3324(1991)；和Koziel等人，生物技術(Bio/technol.)11:194(1993))。5．細胞內基因產物的導向已知植物中存在多種導向基因產物的機制，并且較詳細地表征了控制這些機制作用的序列。例如，基因產物向葉綠體的導向受在多種蛋白質氨基端發現的信號序列控制，該信號序列在葉綠體輸出過程中被切下，產生成熟蛋白質(例如，Comai等人，生物化學雜志263:15104-15109(1988))。其他基因產物位于其他細胞器如線粒體和過氧化物酶體中(例如，Unger等人，植物分子生物學(Plant Molec.Biol.)13:411-418(1989))。也可操作編碼這些產物的cDNA，以實現異源基因產物向這些細胞器的導向。另外，已表征了使基因產物導向其他細胞區室的序列。氨基端序列負責向ER、質外體的導向，和由糊粉細胞的胞外分泌(Koehler和Ho，植物細胞2:769-783(1990))。另外，氨基端序列與羧基端序列一起負責基因產物的液泡導向(Shinshi等人，植物分子生物學14:357-368(1990))。通過將上述適當的導向序列與目的轉基因序列融合，能將轉基因產物引導至任何細胞器或細胞區室中。B．植物轉化載體的構建可用于植物轉化的多種轉化載體為植物轉化領域的技術人員所公知，與本發明有關的基因可與任何這些載體結合使用。載體的選擇取決于優選的轉化技術和用于轉化的靶物種。對于某些靶物種，可優選不同的抗生素或除草劑選擇性標記。轉化中常規使用的選擇性標記包括賦予卡那霉素及相關抗生素抗性的nptⅡ基因(Messing和Vierra，基因19:259-268(1982)；Benvan等人，自然304:184-187(1983))、賦予除草劑膦絲菌素抗性的bar基因(White等人，核酸研究18:1062(1990)，Spencer等人，理論與應用遺傳學(Theor.Appl.Genet.)79:625-631(1990))、賦予抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger和Diggelmann，分子細胞生物學4:2929-2931)、賦予氨甲喋呤抗性的dhfr基因(Bourouis等人，EMBO J.2(7):1099-1104(1983))和賦予草甘膦抗性的EPSPS基因(美國專利號4,940,935和5,188,642)。
1．適用于農桿菌(Agrobacterium)轉化的載體許多載體可用于應用根瘤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的轉化。它們一般攜帶至少一種T-DNA邊界序列，并且包括如pBIN19(Bevan，核酸研究(1984))和pXYZ的載體。適用于農桿菌轉化的典型載體包括二元載體pCIB200和pCIB2001，以及二元載體pCIB10及其潮霉素選擇衍生物。(見，例如，美國專利號5,639,949)。
2．適用于非農桿菌轉化的載體不使用根瘤農桿菌的轉化避免了對所選轉化載體中T-DNA序列的需要，所以除上述包含T-DNA序列的載體外，也可使用缺少這些序列的載體。不依賴于農桿菌的轉化技術包括通過粒子轟擊、原生質體攝取(如PEG和電穿孔)和顯微注射的轉化。載體的選擇主要取決于待轉化的物種的優選。適用于非農桿菌轉化的典型載體包括pCIB3064、pSOG19和pSOG35(見，例如，美國專利號5,639,949)。C．轉化技術待目的編碼序列被克隆到表達系統中后，即轉化植物細胞。植物轉化和再生的方法在本領域中眾所周知。例如，Ti質粒載體已用于外源DNA的遞送，以及直接DNA攝取、脂質體、電穿孔、顯微注射和微粒轟擊。另外，也能用農桿菌屬的細菌轉化植物細胞。
雙子葉植物的轉化技術在本領域中眾所周知，包括基于農桿菌的技術和不需要農桿菌的技術。非農桿菌的技術包括原生質體或細胞對外源遺傳物質的直接攝取。這可通過PEG或電穿孔介導的攝取、粒子轟擊介導的送遞或顯微注射來實現。在所有情況中，都用本領域公知的標準技術使被轉化的細胞再生為整個植物。大多數單子葉植物種的轉化現也已成為常規。優選的技術包括使用PEG或電穿孔技術向原生質體中直接轉移基因，對愈傷組織的粒子轟擊，及農桿菌介導的轉化。Ⅶ．培育本發明的野生型或改變形式的4788基因能用于對包括裸子植物、單子葉植物和雙子葉植物細胞在內的多種植物細胞提供除草劑耐受性。盡管該基因能插入屬于這些種類的任何植物細胞中，但其在如下作物植物細胞中特別有用，如稻、小麥、大麥、黑麥、玉米、馬鈴薯、胡蘿卜、甘薯、甜菜、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、洋白菜、花椰菜、硬花球花椰菜、蘿卜、紅蘿卜、菠菜、蘆筍、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜(squash)、南瓜(pumpkin)、夏季南瓜、黃瓜、蘋果、梨、溫柏、甜瓜、李子、櫻桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、菠蘿、鱷梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、煙草、番茄、高粱和甘蔗。野生型4788基因的高水平表達和/或在植物中提供除草劑耐受性的除草劑耐受形式的4788基因的表達，與對產量和質量至關重要的其他特征一起，能通過本領域周知的培育方法和技術引入植物系中。
通過在作物植物或能再生為作物植物的植物細胞培養物中直接選擇獲得除草劑耐受性4788等位基因，利用傳統培育技術將其轉移到商業品種中，產生除草劑耐性作物，而不需要遺傳改造該等位基因和用其轉化植物。
將參照下列詳細實施例進一步描述本發明。這些實施例只是為了說明，除非另外指明而不意在限制。
在對核苷酸序列數據庫的NCBI WWW blastn搜索中使用從上述克隆中獲得的序列(Altschul等人(1990)分子生物學雜志215:403-410；Altschul等人(1997)核酸研究25:3389-3402)。搜索結果表明，回收的序列與擬南芥染色體Ⅱ BAC T9J22(Genbank Acc.AC002505(2739376))的基因組DNA相同。發生插入事件的基因組DNA區域注釋為編碼一種推定的通透酶(保藏#2739376)。然后針對預測mRNA的5’和3’端設計引物，用來源于擬南芥cDNA文庫的DNA作為模板進行PCR。TA連接并克隆(Original TA Cloning試劑盒，Invitrogen)產生的PCR產物，測序。該cDNA序列與Genbank注釋中預測的序列相同，從而第一次證實了假定的開放閱讀框注釋。實施例2重組4788蛋白在大腸桿菌中的表達將對應于該cDNA克隆的推定成熟蛋白的編碼區亞克隆到前述表達載體中，并使用廠商的條件轉化大腸桿菌。具體實例包括質粒如pBluescript(Stratagene,La Jolla,CA)、pFLAG(InternationalBiotechnologies,Inc.,New Haven,CT)和pTrcHis(Invitrogen,La Jolla,CA)。實施例3通過DNA改組對4788基因的體外重組PCR擴增編碼4788蛋白的擬南芥4788基因。基本如述(Stemmer等人(1994)美國國家科學院院刊91:10747-10751)經DNaseI處理消化產生的DNA片段，并從反應混合物中去除PCR引物。不用引物進行PCR反應，隨后用引物進行PCR反應，均如述進行(Stemmer等人(1994)美國國家科學院院刊91:10747-10751)。將產生的DNA片段克隆到pTRC99a(Pharmacia，目錄號27-5007-01)中，并用Biorad基因脈沖發生器和廠商條件經電穿孔轉化大腸桿菌uraA株(Andersen等人(1995)細菌學雜志177(8):2008-2013)。被轉化的細菌在含有抑制濃度的抑制劑的培養基上生長，選擇那些在抑制劑存在下生長的菌落。挑取在正常抑制濃度的抑制劑存在下生長的菌落，經重復劃線純化。純化其質粒，然后測定通過該檢測的質粒的cDNA插入片段的DNA序列。在相似的反應中，體外重組包含編碼該蛋白質的擬南芥4788基因的PCR擴增DNA片段和包含大腸桿菌uraA基因的PCR擴增DNA片段，如上所述回收得到的對抑制劑有提高的耐受性的變體。實施例4通過交錯延伸法對4788基因的體外重組將編碼4788蛋白的擬南芥4788基因和大腸桿菌uraA基因均克隆到pBluescript載體的多接頭中。基本如述(Zhao等人(1998)自然生物技術16:258-261)用“反向引物”和“M13-20引物”(Stratagene目錄)進行PCR反應。用適當的限制酶消化擴增的PCR片段，將其克隆到pTRC99a中，如實施例3所述篩選突變的4788基因。實施例5體外結合試驗例如，根據實施例2獲得重組4788蛋白。將該蛋白質固定于適于配體結合試驗的芯片上。根據本領域眾所周知的方法使該芯片上固定的蛋白質接觸溶液中的樣品化合物。在樣品化合物接觸固定的蛋白質時，進行能檢測蛋白質-配體相互作用的測定。這些測定的實例是如上所述的SELDI、biacore和FCS。以這種方式易于發現可結合該蛋白質的化合物，并例如根據以下的實施例6進一步表征。實施例6尿嘧啶通透酶活性的測定發展了一種簡單的試驗來篩選可影響4788活性正常作用的化合物。這些化合物有希望在體外檢測體內除草活性。該試驗包括在最低抑制濃度的5-氟尿嘧啶存在下在基本培養基中培養攜帶并功能表達4788基因的大腸桿菌uraA。這以96孔板形式實現，以進行自動高通量篩選。在阻斷4788蛋白功能方面有效的化合物能抑制細胞攝取5-FU的能力，和細菌生長結果。這種生長用簡單的濁度測定法測定。更具體而言，本發明涉及一種鑒定通透酶活性抑制劑的方法，其包括a)將SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2，或與之基本類似的核苷酸序列導入一種通透酶缺陷的宿主細胞如大腸桿菌uraA中，使得該序列可功能性表達；b)將含有該核苷酸序列的宿主細胞與最低抑制濃度的5-氟尿嘧啶，和一種待測定其抑制該通透酶活性的能力的化合物，在有利于這種抑制的條件下相結合；c)在步驟(b)的條件下測定宿主細胞的生長；和d)選擇在步驟(c)中抑制宿主細胞生長的化合物，和任選地e)將步驟(d)中鑒定的化合物施用于一種植物，檢測其除草活性，和f)選擇步驟(e)中具有除草活性的化合物。
以上公開的實施方案是說明性的。本發明的公開內容將使本領域技術人員理解本發明的許多變化。所有這些明顯的和可預知的變化均包括于附加的權利要求書中。
序列表<110>Novartis AG<120>除草劑靶基因及方法<130>PB/5-30638/CGC 2031<140><141><150>Application No.09/153,278<151>1998-09-15<160>4<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>3710<212>DNA<213>擬南芥<400>1tcaaacaagt gactttttat atttatctta ttaattctgt agtctcgaga ttcgcttttt 60ctcctgctta cttcttttta tcatcttctc tttgtcggtt tgatttggaa aaactttctg 120caaaaaaaag agagattctt aaacttttta tctcaagatc ctttcaaaaa atctgaaaag 180agaagatttt taataaaaaa gaatggttga aactggtcac catcatcaac atccaccggc 240accggctgca gccggtcatc cgccggttcc atccatggcg atggcgcgta acatgggaac 300cacttggcct ccggcggagc aacttcatca tcttcaatat tgcatccact ctaacccttc 360ttggcgttag tctctctctt tctgcttata ctactttctt tatttttgtt tcagatgtaa 420aaaataaaaa ttataatctt ttcagtcaaa agttgtatta gttcagttct gtctctctct 480ctctttatct gctttatgtt gtgtcttaat ttgtttacca aaagattagt ttagatctca 540gtatctgatt cgattcttta tatttttcct ctgtgttgac tatattttag cttgtgttgg 600ggactaatta gctttaaatc taatgataaa tgttgtataa ttgttcttga gacacactaa 660ttgattaaga ttaaaataaa ctgtttcgtt attacttgtt tatgtagttg gtgaatccaa 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權利要求
1．一種基本類似于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
2．權利要求1的核苷酸序列，其中該序列編碼一種基本類似于SEQID NO:3的氨基酸序列。
3．根據權利要求1的核苷酸序列，其中該核苷酸序列是一種植物核苷酸序列。
4．權利要求1的核苷酸序列，其中所述蛋白質具有通透酶活性。
5．權利要求4的核苷酸序列，其中所述蛋白質具有嘌呤或嘧啶通透酶活性。
6．一種氨基酸序列，其包含由基本類似于SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。
7．一種氨基酸序列，其包含基本類似于SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
8．權利要求6的氨基酸序列，其中所述蛋白質具有通透酶活性。
9．權利要求8的氨基酸序列，其中所述蛋白質具有嘌呤或嘧啶通透酶活性。
10．一種氨基酸序列，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2編碼的氨基酸序列的至少20個連續氨基酸殘基。
11．一種氨基酸序列，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的至少20個連續氨基酸殘基。
12．一種嵌合基因，其包含與根據權利要求1-5任一項的核苷酸序列有效連接的啟動子。
13．一種包含根據權利要求12的嵌合基因的重組載體，其中該載體能被穩定地轉化到宿主細胞中。
14．一種含有根據權利要求13的載體的宿主細胞，其中所述核苷酸序列可在該細胞中表達。
15．根據權利要求14的宿主細胞，其中該宿主細胞是一種真核細胞。
16．根據權利要求15的宿主細胞，其中該宿主細胞選自昆蟲細胞、酵母細胞和植物細胞。
17．根據權利要求15的宿主細胞，其中該宿主細胞是一種原核細胞。
18．一種包含權利要求16的植物細胞的植物或種子。
19．權利要求18的植物，其中該植物耐受通透酶活性抑制劑。
20．一種方法，用于制備編碼具有改變的通透酶活性的基因產物的核苷酸序列，包括，a)改組一種權利要求1的核苷酸序列，b)表達得到的改組核苷酸序列，和c)篩選與未改變的核苷酸序列的基因產物的通透酶活性相比改變的通透酶活性。
21．權利要求20的方法，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。
22．權利要求20的方法，其中所述通透酶活性是嘌呤或嘧啶通透酶活性。
23．一種可通過權利要求20的方法獲得的改組DNA分子。
24．一種通過權利要求20的方法獲得的改組DNA分子，其中該改組DNA分子編碼一種對通透酶活性抑制劑有增強的耐受性的基因產物。
25．一種嵌合基因，其包含與根據權利要求23-24任一項的核苷酸序列有效連接的啟動子。
26．一種包含根據權利要求25的嵌合基因的重組載體，其中該載體能被穩定地轉化到一種宿主細胞中。
27．一種含有根據權利要求26的載體的宿主細胞，其中所述核苷酸序列可在該細胞中表達。
28．根據權利要求27的宿主細胞，其中該宿主細胞是一種真核細胞。
29．根據權利要求27的宿主細胞，其中該宿主細胞選自昆蟲細胞、酵母細胞和植物細胞。
30．根據權利要求27的宿主細胞，其中該宿主細胞是一種原核細胞。
31．一種包含權利要求29的植物細胞的植物或種子。
32．權利要求31的植物，其中該植物耐受通透酶活性抑制劑。
33．一種鑒定具有除草活性的化合物的方法，其包括a)在有利于結合的條件下，將一種權利要求6的蛋白質與一種待測定其結合該蛋白質的能力的化合物結合，b)選擇步驟(a)中鑒定的一種能結合該蛋白質的化合物，c)將步驟(b)中鑒定的化合物施用于一種植物，檢測其除草活性，和d)選擇具有除草活性的化合物。
34．一種可按照權利要求33的方法鑒定的具有除草活性的化合物。
35．一種鑒定具有除草活性的通透酶活性抑制劑的方法，其包括a)將一種通透酶與一種待測定其抑制該通透酶活性的能力的化合物，在有利于這種抑制的條件下結合，b)選擇步驟(a)中鑒定的一種能抑制該通透酶活性的化合物，c)將步驟(b)中鑒定的化合物施用于一種植物，檢測其除草活性，和d)選擇具有除草活性的化合物。
36．權利要求35的方法，其中該通透酶是一種嘌呤或嘧啶通透酶。
37．一種可按照權利要求35的方法鑒定的具有除草活性的化合物。
38．一種鑒定通透酶活性抑制劑的方法，其包括a)將SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2，或與之基本類似的核苷酸序列導入一種通透酶缺陷的宿主細胞如大腸桿菌uraA中，使得該序列可功能性地表達；b)將含有該核苷酸序列的宿主細胞與最低抑制濃度的5-氟尿嘧啶，和一種待測定其抑制該通透酶活性的能力的化合物，在有利于這種抑制的條件下結合；c)在步驟(b)的條件下測定宿主細胞的生長；和d)選擇在步驟(c)中抑制宿主細胞生長的化合物。
39．一種可按照權利要求38的方法鑒定的具有除草活性的化合物。
40．一種抑制植物生長的方法，包括以足以抑制該植物生長的量向該植物施用一種抑制權利要求6的氨基酸序列的活性的化合物。
41．權利要求40的方法，其中該化合物選自權利要求37的化合物和權利要求39的化合物。
42．一種改進作物的方法，包括，以可抑制不希望的植被生長但不明顯抑制除草劑耐受性植物或種子生長的量，向選自權利要求19的植物或種子和權利要求32的植物或種子的除草劑耐受性植物或種子，施用一種具有除草活性的化合物，所述化合物選自權利要求34的化合物、權利要求37的化合物和權利要求39的化合物。
全文摘要
本發明涉及一種從擬南芥中分離的編碼幼苗生長所需蛋白質的基因。本發明也包括利用該蛋白質發現新除草劑的方法，這是基于該基因對于正常生長和發育的重要性。本發明也能在篩選試驗中用來鑒定是可能的除草劑的抑制劑。本發明也可用于除草劑耐受性植物、植物組織、植物種子和植物細胞的開發。
文檔編號C12N1/21GK1318106SQ99810964
公開日2001年10月17日 申請日期1999年9月13日 優先權日1998年9月15日
發明者J·Z·萊文, S·L·波特, G·J·巴茲瑟維斯克, E·R·沃德, P·波納斯寇尼 申請人:辛根塔參與股份公司