專利名稱：漿果赤霉素的制備方法
技術領域：
本發明涉及通過選擇性地將相應的10-脫乙酰化合物乙酰化而制備漿果赤霉素或漿果赤霉素衍生物的方法、催化該乙酰化反應的分離酶和制備該酶的方法。
紫杉醇是一種有前途的癌癥治療劑，它具有抗白血病活性和腫瘤抑制活性(參見，例如M．Suffnes等，“生物堿，化學和藥理學”，A．Brossi編輯，Academic Press出版，Orlando，FL，1985年，第ⅩⅩⅤ卷，第1章)。最初，紫杉醇是從某些紫杉樹(Taxus taxaceae)的樹皮中得到的。但是，從樹皮中分離紫杉醇困難而昂貴，并且所需紫杉醇只能以非常低的產率(40-165mg／kg)從樹皮中得到(參見，例如R．W．Miller等，《有機化學雜志》46(1981)1469-1474；V．Senilh等，《J．Nat．Procl．》47(1984)131-137；N．Magri等，《有機化學雜志》51(1986)797-802)。另外，使用樹皮會導致生長恢復非常緩慢的紫杉樹死亡，因此起始原料的供給非常有限。
自從發現了紫杉醇的性能，表明它可用作癌癥化療劑之后，人們已作出了無數努力，試圖通過合成或半合成方法來制備該化合物。因此，曾經嘗試通過有機合成制備紫杉醇結構(參見，例如W．F．Berkowitz等，《有機化學雜志》52(1987)1119-1124)。然而，由于紫杉醇分子非常復雜，至今還不可能通過全有機合成以事實上有用的量制得紫杉醇。
用于得到紫杉醇的另一種途徑是從可容易地大量獲得的前體開始進行部分合成。這些途徑之一是從10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ開始合成，所述10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ可以容易地從歐紫杉L(Taxus baccata L)的樹葉中大量提取獲得(G．Chauviere等，Seances Acad．Sci．，Ser．2，1981年，293，501-503)。此時，有可能從每公斤樹葉分離得到大約1g 10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ，并且這些樹葉會迅速恢復生長。因此，有可能毫無任何問題地得到大量前體-10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ。
所需的活性化合物紫杉醇可以用這種從生物學原料獲得的前體通過部分合成制備。但是，現已發現，盡管10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ和紫杉醇的結構可能類似，這種部分合成仍存在嚴重的問題，大部分合成只有通過使用特定的保護基才可能成功地進行，并且只能以較低的產率得到所需產物紫杉醇。
Denis等(《美國化學會雜志》110(1988)，5917-5919)描述了從10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ以兩個步驟合成得到紫杉醇。在第一步中，將10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ的10位化學乙酰化。第二步，將漿果赤霉素轉化為紫杉醇。然而，第一步不是區域特異的，10-脫乙酰漿果赤霉素的其他部位也發生乙酰化，特別是在7位。鑒于此，必需通過使用保護基封閉該位置上的羥基發生乙酰化。只有使用保護基才能僅在10位發生乙酰化。但是，使用保護基需要多出兩步加工步驟(引入和去除保護基)，一方面，這么做是昂貴的，另一方面，這大大降低了所得產物的收率。使用保護基的另一個缺點在于隨后必須進行復雜的純化和分析操作以確保該產物中不再存有仍攜帶保護基的分子，特別是當該產物用作治療活性化合物時更是如此。
Zocher等(《生物化學與生物物理學研究通訊》229(1996)，16-20)描述了紫杉醇的生物合成。此時，在一個中間步驟中，借助于歐紫杉樹根的植物粗提物將10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ乙酰化得到漿果赤霉素Ⅲ。然而，不可能分離或描述影響該乙酰化作用的物質的特征。使用粗提物的缺點是，該粗提物中存在的物質也可能引發或影響其他大量反應，特別是在其他部位的乙酰化反應。另外，植物粗提物沒有明確和可再現的組成，因此使用粗提物會導致無法控制且多變的反應和產率。
因此本發明的一個目的是提供一種制備漿果赤霉素和漿果赤霉素樣漿果赤霉素衍生物的方法，是通過將相應的10-脫乙酰化合物的10位選擇性乙酰化而實現的。本發明的另一個目的是提供一種特異性催化該反應的分離物質。
按照本發明，這些目的是利用制備漿果赤霉素或漿果赤霉素衍生物的方法實現的，該方法的特征在于10-脫乙酰漿果赤霉素或10-脫乙酰漿果赤霉素衍生物在有分離酶和乙酰基供體的存在下發生反應，所用的酶是用SDS-PAGE測定分子量為70-72kD的乙酰轉移酶，該乙酰轉移酶可以從紅豆杉(Taxus chinensis)的細胞培養物得到。我們已發現，可從懸浮的紅豆杉細胞培養物獲得的分離酶可催化10位上的區域選擇性乙酰化反應。現已令人驚奇地發現，使用該分離和純化的酶，有可能使10位上的乙酰化反應達到高區域特異性。該特異性優選大于80％，更優選大于90％，首選大于95％。現已發現，利用根據本發明所使用的酶有可能使特異性達到99％以上。在這里，特異性大于80％意味著在10位發生的乙酰化反應已達到80％以上，而在該起始物的其他位置上發生的乙酰化反應占20％以下。所以，該起始物中存在的其他羥基不必非用保護基封閉不可，因為當使用本發明的酶時，這些其他羥基僅發生非常有限的乙酰化反應(如果有的話)。
現已令人驚奇地發現，按照本發明所用的酶具有高底物特異性。因此，只有在C10位或其附近具有類似10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ構型的10-脫乙酰漿果赤霉素或10-脫乙酰漿果赤霉素衍生物發生轉化。特別是，因龐大的取代基導致10位不能靠近的漿果赤霉素衍生物，諸如象10-脫乙酰紫杉醇和10-脫乙酰頭孢馬啉(10-deacetylcephalomannin)，不發生乙酰化。因此，漿果赤霉素衍生物被本發明的酶識別為底物的前提是，具有紫杉烷(taxane)環結構的這些衍生物在7、8、9、10、11、12和13位基本上與10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ一致，即，它們在這些位置上沒有攜帶任何其他取代基，或者僅帶有小體積的取代基。該方法優選適用于與10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ的7至13位帶有相同取代基的漿果赤霉素衍生物，或者帶有至少一些比10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ的取代基體積小的取代基、尤其是氫的漿果赤霉素衍生物。其他位置上的龐大取代基不會妨礙該反應。該方法特別優選用于將10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ乙酰化。另外，該方法特別優選用于將14-羥基-10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ的10位選擇性乙酰化。
與此相比，7位上的羥基被龐大的保護基(諸如象7-TES-10-DAB Ⅲ或7-BOC-10-DAB Ⅲ)封閉的10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ衍生物不會被本發明的酶識別為底物。不過，這種封閉是不需要的，因為即使在其他位置上存在其他羥基，也會發生10位的區域選擇性乙酰化。
利用本發明的方法可以將紫杉烷衍生物的10位選擇性乙酰化，所述紫杉烷衍生物的7至13位具有與10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ相同、更少或更小的龐大取代基。其中有存在于10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ中的取代基(即，7位上的OH，8位上的CH3，9位上的=O，10位上的OH，12位上的CH3和13位上的OH)存在或者被更小或具有相同體積的基團代替的這類紫杉烷衍生物，也包括在本文所用的術語“10-脫乙酰漿果赤霉素衍生物”的范圍內，并且如果它們的10位上有羥基的話，同樣可被區域特異地乙酰化。這類衍生物的實例是10-脫乙酰云南紅豆杉素(taxuyunnanin)C，10，14-脫乙酰云南紅豆杉素C，2，10，14-脫乙酰云南紅豆杉素C，5，10，14-脫乙酰云南紅豆杉素C和2，5，10，14-脫乙酰云南紅豆杉素C。
本發明的方法是在乙酰基供體的存在下進行的。合適的乙酰基供體原則上是能在10-脫乙酰起始物的催化轉化中提供乙酰基的任何物質。該反應優選在乙酰基供體乙酰輔酶A的存在下進行。
從技術的觀點出發，按照本發明使用分離酶有許多優點，特別是在轉化率和再現性方面，如果使用分離酶就可容易地控制該反應。
所用的酶優選等電點為pH5．4-5．8，更好是5．5-5．7，最好是pH5．6。另外已發現，按照本發明所用的酶對乙酰輔酶A的米氏常數KM為55-65μm，優選為59-63μM，首選為61μM。
本發明還提供了一種分離酶，其特征在于a)它在乙酰基供體特別是乙酰輔酶A的存在下，選擇性乙酰化10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ的10位，b)用SDS-PAGE測定的分子量為70-72kD，和c)可以從紅豆杉細胞培養物獲得。
本發明的酶優選以大于50％的純度存在，特別是大于80％，更優選大于90％，首選大于95％。本發明的酶的區別特征在于它在乙酰基供體特別是乙酰輔酶A的存在下，選擇性乙酰化10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ的10位。這意味著事實上不會觀察到10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ的1、7和13位上的其他羥基發生乙酰化。特別地，該乙酰化反應對10位的選擇性大于50％，優選大于80％，更優選大于90％，首選大于95％。
該分離酶的另一個特征是用SDS-PAGE測定的分子量為70-72kD。為了測定分子量，0．3μg均質蛋白質用變性的10％強度SDS凝膠進行色譜分析，用已知分子量的標志蛋白質(Rainbow Marker)平行對照。用銀染色法顯示蛋白質，并通過比較校準蛋白質和本發明的酶的Rf值來確定分子量。利用SDS凝膠電泳確定的分子量再使用合適的凝膠過濾柱利用凝膠過濾加以證實。凝膠過濾使用biosilect-SEC 250-5柱(Biorad)在FPLC設備(Biologic Workstation，Biorad)中進行，該柱已用50mMTris，pH8．5，20mM 2-巰基乙醇平衡，流速為0．2ml／分鐘。開始時該柱先用已知分子量的蛋白質進行校準。然后在相同的條件下，讓50μg本發明的蛋白質通過該分析柱。收集洗脫液的250μl級分，并如下所述測定洗脫液的活性。將洗脫時間與已知標準物進行比較，從而確定分子量。
本發明的酶可以從紅豆杉的細胞培養物中分離。其等電點為pH5．4-5．8，優選為5．5-5．7，特別是pH5．6。另外，所用酶對乙酰輔酶A的米-曼常數KM為55-65μM，優選為59-63μM，特別是61μM。
本發明的酶是一種乙酰轉移酶，特別是乙酰輔酶A10-羥基紫杉烷-O-乙酰轉移酶。
本發明還提供了上述酶的制備方法，其特征在于使用已知純化方法從含有酶的來源分離得到酶，每次純化后，其中存在酶的級分通過加入10-脫乙酰漿果赤霉素或10-脫乙酰漿果赤霉素衍生物和乙酰基供體進行測定，并檢測所形成的乙酰化產物。
例如，所用的含有酶的來源可以是植物提取物。所用的含有酶的來源優選細胞培養物，特別是懸浮細胞培養物。使用細胞培養物的優點在于能得到大量起始物。與使用粗提物作為含有酶的來源相比，當使用細胞培養物時，因為有大量的起始物，所以可以將該酶純化到較高的純度。特別優選使用來源于紅豆杉的起始物，例如紅豆杉細胞培養物。
為了從起始物純化酶，可以采用用于分離酶或蛋白質的已知提純方法。優選使用的方法包括從粗提物開始進行硫酸銨沉淀，還包括色譜提純方法，諸如象使用交聯葡聚糖Sephadex G-25柱，陰離子交換色譜，例如通過DEAE-Sephacel柱，凝膠過濾法，例如通過Ultrogel AcA 44，陰離子交換色譜，例如通過HighQ柱，通過羥基磷灰石柱的色譜法，染料親和色譜，例如通過High Trap Blue，疏水作用色譜，例如通過苯基瓊脂糖，和／或染料親和色譜，例如通過Mimetic Green 1A6XL。純化中優選包括有至少一個步驟使用通過HighQ的陰離子交換色譜。HighQ色譜柱是一種帶有-N+(CH3)3基團作為配體的陰離子交換劑。現已發現，特別是在此純化步驟中，可除去催化10位以外的其他位置發生乙酰化的物質。
在本發明的方法中，在每個提純步驟后都要測定級分的酶活性，以確定含有酶的級分。為此，將該級分或該級分的等分試樣與10-脫乙酰漿果赤霉素或上文所定義的10-脫乙酰漿果赤霉素衍生物以及乙酰基供體混合。在存在所需酶的級分中，可以檢測到10位發生乙酰化的產物。該測試中優選使用10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ或10-脫乙酰云南紅豆杉素C。所形成的乙酰化產物可以通過使用起始物中的適宜標志基團來檢測。優選使用標記的乙酰基供體。這類標記的乙酰基供體包含之后可用于測定已在10位乙酰化的產物的標記乙酰基。優選使用放射性標記的乙酰基供體。此時，合適的放射性標記基團是13C和14C。所用的乙酰基供體特別優選乙酰輔酶A，尤其是[2-14C]-乙酰輔酶A。
也可以使用重同位素標記來進行檢測。在這種情況下，反應產物可以用質譜測定。
采用本發明的酶、利用本發明的方法來制備漿果赤霉素或漿果赤霉素衍生物，可以制得已在10位特異性乙酰化的漿果赤霉素或紫杉烷化合物。這類化合物非常有價值，特別是可作為用于紫杉醇部分合成的起始物。因此，本發明還提供了一種制備紫杉醇和／或紫杉醇衍生物的方法，該方法的特征在于將利用上述方法制備的漿果赤霉素或漿果赤霉素衍生物通過已知方法反應得到紫杉醇或紫杉醇衍生物。現有技術中已記載了將漿果赤霉素或漿果赤霉素衍生物部分轉化得到紫杉醇或紫杉醇衍生物的方法，該方法實質上需要在漿果赤霉素衍生物13位上的羥基上引入適宜的取代基。所以，適用于此目的的漿果赤霉素衍生物至少在13位帶有游離羥基。
從漿果赤霉素衍生物得到紫杉醇或紫杉醇衍生物的反應尤其是在用適宜的酸將該漿果赤霉素衍生物13位上的羥基酯化的情況下進行的。文獻中詳細描述了這類方法，例如在下列文獻中Colin等的美國專利第4，814，470號，Denis等的美國專利Re．34，277號，EP 0，400，971 A2，Denis等的美國專利4，924，011號，Bourzat等的美國專利第4，476，954號，以及Denis等，《美國化學會雜志》110(1988)，5917-5919。
本發明將利用下列實施例進行更詳細的說明。
ZnSO4·7H2O3Na2MoO4·2H2O 0．25CuSO4·5H2O0．25CoCl2·6H2O0．25煙酸 1二氯硫胺(thiaminium dichloride) 10鹽酸吡哆醇 1內消旋肌醇 1000D-(+)-蔗糖 20，000pH5．6NZ胺 1000在高壓蒸氣滅菌和冷卻后，在無菌條件下將NZ胺以無菌儲備溶液(10g／l)形式加入培養基中。
在該培養后的第三天，加入30μM茉莉酮酸甲酯(購自Serva)，讓該培養物再生長4天(Gundlach，H．，Muller，M．J．，Kutchan，T．M．，Zenk，M．H．，1992年，《美國國家科學院院報》89，2389-2393頁)。然后通過真空過濾從該培養基中分離出細胞，這些細胞用液氮迅速冷凍后，用于酶浸解。不過，也可以將這些細胞在-20℃下儲存長達1個月，之后，所需酶的活性會顯著下降。
用移液管將足量的要進行測試的酶溶液轉移到微量離心管中的50μlTris緩沖液(0．8M，pH8．5)中。然后加入30μl純化的乙酰輔酶A(5nmol未標記的乙酰輔酶A和0．02μCi-[2-14C]乙酰輔酶A)和15nmol用DMSO溶解的10-脫乙酰云南紅豆杉素C的3mM儲備溶液(對于對照組，僅加入相應量的DMSO代替該紫杉烷)。該混合物在35℃下溫育30分鐘，然后用20μl 12％H2SO4酸化，所形成的云南紅豆杉素C用600μl叔丁基甲基醚萃取(10分鐘，在塔頂搖動器中)后，將該混合物離心(在微量離心機中以14，000rpm的速度離心4分鐘)。仍存在的未反應的[2-14C]乙酰輔酶A保留在水相中。將500μl有機相在空氣流中蒸發至干，這同時除去了由于早期的酸化而作為酸存在的任何[2-14C]乙酸，它們在這時也都揮發了。使用閃爍計數儀(多功能閃爍計數儀LS 6500，購自Beckmann)或薄層放射掃描儀(自動TLC線性分析儀，購自Berthold)測定所形成產物的類型和量。前一種儀器用于測定轉化情況，并利用計算出的cpm值確定酶活性。借助于薄層色譜(TLC)(流動相氯仿∶乙腈7∶3)和隨后的用放射掃描儀進行的評估，可以檢查利用閃爍計數儀測得的放射性是否確實對應于預期產物的Rf值區域中的峰值。
將冰冷的上清液與已懸浮于標準緩沖液A(100mM硼酸／NaOH，pH8．5，20％甘油，20mM 2-巰基乙醇)中的50ml磷酸鈣凝膠混合。體積量是在2500rpm下離心10分鐘后得到的凝膠的量，相當于1．9g Ca3(PO4)2(干重)。讓該混合物在冰浴中放置10分鐘，偶爾進行攪拌。在這段時間里，異物，諸如象大量存在的鞣劑，應該被吸附到凝膠上。乙酰轉移酶保留在溶液中，并通過隨后的離心(6000×g，5分鐘，GSA轉子)而與凝膠物質分離。
隨后將凝膠沉淀再次懸浮于75ml標準緩沖液A中，用玻璃棒攪拌5分鐘，再在6000rpm(GSA轉子)下離心5分鐘，這么做是因為有一些乙酰轉移酶吸附到了凝膠上，通過這種后處理，就可使它們釋放到上清液中。如果不使用磷酸鈣凝膠，主要的困難會在進一步的純化過程中遇到，因為在這種情況下，仍存在的異物會迅速阻塞混合室的隔膜，將后來所用的柱子的顏色變為深棕色，它們的結合力迅速降低。
隨著緩慢攪拌，將合并后的冰冷的上清液每次與少量硫酸銨混合，直到達到70％飽和，再繼續緩慢攪拌30分鐘。加入完成后，沉淀出的蛋白質隨后可在15，000rpm下離心成團(10分鐘，SS34轉子)。將該沉淀仔細地再懸浮于30ml標準緩沖液B(50mM Tris／HCl，pH8．5，20％甘油，20mM 2-巰基乙醇)中，該溶液用此緩沖液和交聯葡聚糖G25柱(Pharmacia2．7cmφ×7cm)脫鹽，同時，除掉60％外源蛋白質。[G25洗脫液82ml，78mg蛋白質]3．2．通過DEAE Sephacel的陰離子交換色譜DEAE Sephacel是一種改性纖維素，其上附著有帶正電荷的二乙氨基乙基。如果溶解蛋白質的等電點比所用的緩沖液更呈酸性，它們將作為陰離子存在，并因此可結合到帶正電荷的柱材料上。加入更強的陰離子，諸如象Cl-或SO42-，可降低所吸附的蛋白質和DEAE基團的靜電相互作用。結果，蛋白質陰離子被無機陰離子交換，酶由此被洗脫出來。
在該純化步驟中，除去了24．4％的外源蛋白質，特別是還除去了異物，尤其是含有酚的鞣劑。即使在首次使用過程中，柱材料的顏色也會變為深棕色，但可以使用1M NaOH將其實質凈化。此步驟大大減少了在以后的純化過程中所用的柱子的污垢。
DEAE柱(2．5cmφ×5cm)的起始流通液，包括用于洗滌柱子的30ml標準緩沖液B(50mM Tris／HCl， pH8．5，20％甘油，20mM 2-巰基乙醇)，在混合室(Amicon，400ml，膜PM10)中通過加壓過濾濃縮至5ml體積。[DEAE洗脫液110ml，59mg蛋白質]3．3．通過Ultrogel AcA 44的凝膠過濾凝膠過濾的原理是基于大分子，諸如象蛋白質，將根據它們的大小和形狀而在具有確定孔徑的基質(體積排除)和周圍的液體之間分布。太大以致于不能滲透到凝膠孔中的分子通過這些顆粒，結果就比一開始被凝膠孔延遲但并未滲透到孔中的中等大小的蛋白質更快的洗脫出來。而更小的分子，尤其是鹽離子，一開始就進入到凝膠孔中，它們只在某段停留時間后才離開凝膠孔，所以它們在柱中停留的時間最長。
這種技術是非常溫和的，因為在材料和蛋白質之間確實沒有相互作用，也不需要使用特殊緩沖液。
另外，洗脫液會被完全脫鹽，因為較小的離子，在這種情況下是硫酸鹽離子，在柱中的停留時間比活性蛋白質長得多。
所用的凝膠是聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠，它適于10-130kD的分級范圍(Ultrogel AcA 44，購自Serva)。
濃縮蛋白質溶液用柱子(2．8cmφ×100cm)以流速20ml／小時分離過夜，該柱已用標準緩沖液B平衡。檢測60個級分(各6．5ml)的蛋白質含量和乙酰轉移酶活性。將顯示主要活性的級分合并并進一步純化。
使用該洗脫液可以測量乙酰轉移酶的比活性。除了在低Rf值下的不同峰值以外，薄層色譜還顯示了在云南紅豆杉素C的Rf值高度下的峰值。[AcA洗脫液53ml，25．7mg，總活性724pcat看作是100％]。利用該凝膠過濾，除掉了57％的外源蛋白質。
3．4．通過HighQ的陰離子交換色譜與DEAE柱一樣，帶有-N+(CH3)3基團作為配體的HighQ柱也是一種陰離子交換劑，但與前者-一種強陰離子交換劑相比有所不同，即其電離狀態在較寬的pH范圍內都不會改變。弱交換劑的離解度和由此產生的交換容量在不同的pH值下有相當大的不同。由于HighQ柱材料由密集填塞的大小約10μm的樹脂顆粒組成，因此它們具有高反壓力，使得該柱必須使用FPLC設備(購自Biorad)進行操作。
將無鹽的AcA洗脫液(53ml)泵入到HighQ 5ml現成柱上，該柱已用標準緩沖液B(50mM Tris／HCl，pH8．5，20％甘油，20mM 2-巰基乙醇)平衡，流速為2ml／分鐘，用相同的緩沖液洗滌該柱。無色的起始流通液已含有部分無活性的蛋白質，利用存在于標準緩沖液B(50mM Tris／HCl，pH8．5，20％甘油，20mM 2-巰基乙醇)中的0．07M KCl除去其他外源蛋白質和黃色異物。在下一個步驟中，用存在于標準緩沖液B(50mM Tris／HCl，pH8．5，20％甘油，20mM 2-巰基乙醇)中的0．14M KCl梯度洗脫活性蛋白質和其他黃色異物。使用存在于標準緩沖液B(50mM Tris／HCl，pH8．5，20％甘油，20mM 2-巰基乙醇)中的1M KCl得到的洗脫液也是黃色的，并且含有加載蛋白質的1／3，但是沒有乙酰轉移酶活性。經過這最后一個步驟，柱同時再生。
該純化步驟的最大優點在于，大體積的AcA洗脫液迅速而溫和地濃縮至4ml(4個級分，每個1ml)。
梯度時間(分鐘)存在于標準緩沖液B中的1M KCl(％)0 03503574574570100[HighQ洗脫液4ml，8．8mg蛋白質，796pcat]與AcA洗脫液相比，該純化步驟達到了富集因子為121％，并且除去了66％的外源蛋白質。3．5羥基磷灰石所用的柱是CHT Ⅱ柱(購自Biorad)，該柱填充有球形的羥基磷灰石[Ca5(PO4)3OH]2顆粒。在低分子磷酸鹽緩沖液的存在下，一開始，帶負電荷的蛋白質可結合到Ca2+陽離子上，然后被洗脫緩沖液中的更高濃度的磷酸鹽置換。
具有高pI的堿性蛋白質與具有相對低pI的蛋白質相比，其對柱材料的親和力相對更高。在正電荷中心有Ca2+離子、在負電荷中心有PO43-的羥基磷灰石結構導致了混合離子交換分離。以0．5ml／分鐘的流速將HighQ洗脫液泵入到CHT Ⅱ柱(5ml)上，該柱已用磷酸鹽緩沖液(10mMNa2HPO4／NaH2PO4，pH6．8，，20％甘油，20mM 2-巰基乙醇)平衡，然后該柱用12ml此緩沖液洗滌。活性蛋白質在160mM磷酸鹽緩沖液(20％甘油，20mM 2-巰基乙醇)的濃度下洗脫出來。即使磷酸鹽的濃度升高至400mM，也不可能再洗脫出更多的蛋白質。
梯度時間(分鐘)160mM磷酸鹽緩沖液(％)0 04004010070100檢測已收集的0．5ml級分中的蛋白質和乙酰轉移酶活性。與HighQ洗脫液相比，該純化步驟達到了富集因子為8．7，同時除去了92％的外源蛋白質，導致活性損失27％。3．6．通過High Trap Blue的染料親和色譜HiTrapBlue 1ml(購自Pharmacia)含有偶聯到瓊脂糖基質上的合成多環染料Cibacron Blue F3 G-A。這些配體顯示出與天然產分子諸如輔因子NAD+和NADP+有某種結構類似性，這使得它們能與蛋白質，尤其是需要含有腺苷酸的物質的酶強烈而特異地結合。因此該柱材料也稱作“基團特異的”。不過，特異性受到下列事實的限制，即，迄今已編入目錄中的酶有大約三分之一需要含有核苷酸成分的輔酶。另外，由于靜電和／或疏水作用，蛋白質也可以非特異性地結合芳香族配體。
可以用合適的輔因子特異性洗脫，或用鹽溶液非特異性洗脫。
可結合含有磷酸腺苷二磷酸的乙酰輔酶A的乙酰轉移酶被吸附到藍色柱材料上，利用線性梯度的KCl進行非特異性洗脫。出于此目的，將CHT Ⅱ洗脫液在FPLC設備(購自Biorad)中以0．5ml／分鐘的流速上樣到High Trap Blue柱上，該柱已用標準緩沖液B平衡，然后該柱用此緩沖液洗滌。結合到柱子上的蛋白質利用存在于標準緩沖液B(50mMTris／HCl，pH8．5，20％甘油，20mM 2-巰基乙醇)中的0-1M KCl線性梯度鹽以0．5ml／分鐘的速率洗脫30分鐘。梯度時間(分鐘)存在于標準緩沖液B中的1M KCl(％)0 030060100級分體積為0．5ml。將含有活性的級分合并，用于進一步的純化。與CHT Ⅱ柱相比，在該純化步驟中富集因子達到4．2。除去了93％的外源蛋白質，并且總活性損失71％。3．7．在苯基瓊脂糖上的疏水作用色譜如果將某些中性鹽，諸如象(NH4)2SO4或KCl，加入到溶解于含水介質的蛋白質中，該溶液的離子強度會升高。在這些條件下，蛋白質表面上的疏水區域發生締合。它們也以相同方式被吸附到具有疏水配體的柱材料上，結果發生疏水作用(HIC=疏水作用色譜)。這些相互作用隨后可通過使用具有低鹽濃度的洗脫緩沖液再次降低。
為了進行這種純化，需要將High Trap Blue洗脫液的濃度調節至0．5M硫酸銨。這可以通過非常緩慢地、少量多次地加入適宜量的冰冷的存在于標準緩沖液B(50mM Tris／HCl，pH8．5，20％甘油，20mM 2-巰基乙醇)中的1M硫酸銨溶液達到。隨后將蛋白質溶液上樣到微型柱(1cmφ×1．3cm)上，該柱已用存在于標準緩沖液B中的0．5M(NH4)2SO4平衡。當蛋白質溶液已滲透到凝膠床(苯基瓊脂糖，購自Pharmacia)中以后，該柱用7ml存在于標準緩沖液B(50mM Tris／HCl，pH8．5，20％甘油，20mM 2-巰基乙醇)中的0．5M(NH4)2SO4洗滌。為了洗脫出結合蛋白質，使用存在于標準緩沖液B(50mM Tris／HCl，pH8．5，20％甘油，20mM 2-巰基乙醇)中的0．1M(NH4)2SO4。以每級分0．5ml收集洗脫液，并測定相對蛋白質濃度和酶活性。將最具活性的級分合并，并檢測活性和蛋白質含量。[苯基瓊脂糖洗脫液2．5ml，0．001mg，6．3pcat]與HiTrapBlue洗脫液相比，富集因子計算為1．9，同時活性損失了96％，98％的外源蛋白質被除去。
3．8在Mimetic Green 1A-6 XL上的染料親和色譜正如已對High Trap Blue柱所討論過的那樣，在酶的輔因子結合位點與該材料的染料配體之間也有相互作用。用輔因子，照目前這個情況是乙酰輔酶A，可以僅洗脫下依賴于該輔因子的結合酶。非特異性吸附的蛋白質仍保留在柱上。
在苯基瓊脂糖洗脫液可以轉移到Mimetic Green柱(1cmφ×1．2cm，Affinity Chromatography Ltd．公司，Freeport，Ballasalla，Isle ofMan)上之前，它必須進行脫鹽，這可使用PD10柱(購自Pharmacia)進行。為此，將2．5ml苯基瓊脂糖洗脫液加入到PD10柱上，并使其滲透到柱中。利用標準緩沖液B(50mM Tris／HCl，pH8．5，20％甘油，20mM 2-巰基乙醇)進行洗脫，將開始0．5ml洗脫液丟棄，收集接下來的2．5ml洗脫液，其中含有活性蛋白質。
將該酶溶液轉移到Mimetic Green柱(1cmφ×1．2cm)上，該柱已用標準緩沖液B(50mM Tris／HCl，pH8．5，20％甘油，20mM 2-巰基乙醇)洗滌。當溶液已滲透到凝膠床中以后，依次使用下列溶液不用泵進行洗脫3ml標準緩沖液B(50mM Tris／HCl，pH8．5，20％甘油，20mM 2-巰基乙醇)，3ml存在于標準緩沖液B中的0．5mM乙酰輔酶A，2ml標準緩沖液B，3ml存在于標準緩沖液B中的1M KCl。收集各1ml的級分并檢測蛋白質含量和乙酰輔酶A活性。
乙酰輔酶A洗脫液是唯一含有乙酰轉移酶活性的級分。無論是開始的流通液還是KCl洗脫液都不含任何活性。
在測定乙酰輔酶A洗脫液的活性之前，必須除去該溶液中的輔因子。大量未標記的乙酰輔酶A可能會稀釋少量14C標記的乙酰輔酶A，使得事實上沒有放射性底物會被轉換。
如上所述，使用PD10柱能將乙酰輔酶A幾乎完全除去。對以這種方式獲得的洗脫液進行通常的活性測試。不過，由于PD10洗脫液仍含有極少量來自洗脫緩沖液的乙酰輔酶A，即未達到完全去除，因此在活性測試中14C標記的輔酶A被稀釋，使其活性和純化因子值非常低。[Green洗脫液2．5ml，0．0001mg蛋白質，0．7pcat]在該純化步驟中，剩余的外源蛋白質被除去，純化因子為1.1,活性損失81％。3．9對純化和均一性的總結。
利用上述過程，通過70％強度的硫酸銨沉淀和8個柱色譜步驟，從粗提物得到了所需的乙酰轉移酶。用這種方法得到的乙酰轉移酶制劑，其比活性是AcA洗脫液的280倍，總產率為0．1％。盡管僅在一天內對AcA洗脫液進行了處理，純化過程中活性的大量損失可以解釋為該酶的極不穩定性和其在pH8以下對pH值和對鹽離子的敏感性，特別是對硫酸銨的敏感性所致。
為了檢查該酶制劑的純度，在SDS的存在下使用變性圓盤電泳。使用SDS-PAGE將模擬綠色柱的濃縮洗脫液分離，隨后進行銀染，顯示出僅有1個條帶。
為了確定最佳pH范圍，在從pH5-pH11的不同pH值下測量乙酰輔酶A向10-脫乙酰云南紅豆杉素C的轉移。為此，在下列混合物中使用5．6pcat(1．7μg，50μl)的120倍富集的乙酰轉移酶(High Trap Blue洗脫液)混合物50μl 0．8M Tris，pH8．5；50μl乙酰轉移酶(5．6pcat，1．7μg，120倍富集)；30μl乙酰輔酶A(5nmol，包括0．02μCi[2-14C]乙酰輔酶A)；5μl 3mM 10-脫乙酰云南紅豆杉素C(15nmol)；50μl Millipore水。溫育在35℃下溫育25分鐘。該混合物在沒有乙酰輔酶A的情況下預溫育5分鐘，然后加入輔因子使反應開始。在35℃下溫育25分鐘后，通過酸化使反應停止，并用叔丁基甲基醚萃取。利用閃爍計數儀評估醚萃取液中存在的放射性。
在相對窄的pH范圍(pH8．5-9)內，乙酰轉移酶活性較大，最佳pH值為pH9。半最大轉化率是在pH6．8和pH10．8。
在pH8．5下進行純化，因為在這種情況下，親和柱的起始流通液中的活性蛋白質比pH9時的要少。4．2最佳溫度除了pH對酶活性有相當大的影響以外，酶活性也非常依賴于溫育溫度。開始時，酶活性隨著溫度的升高而升高，但之后從某個溫度點開始迅速下降，這對于每種酶來說是特異的。在高溫度下，酶發生變性和失活。為了確定乙酰轉移酶的最佳溫度，將1．7μg(5．6pcat)120倍純化的酶在0℃至50℃的溫度下溫育，開始10分鐘時沒有乙酰輔酶A，之后加入輔因子，再溫育25分鐘。加入20μl 12％H2SO4使反應終止。所形成的云南紅豆杉素C用600μl醚萃取。然后利用閃爍計數儀評估所形成的產物的量。
混合物50μl 0．8M Tris，pH8．5；50μl乙酰轉移酶(5．6pcat，1．7μg，120倍富集)；30μl乙酰輔酶A(5nmol，包括0．02μCi[2-14C]乙酰輔酶A)；5μl 3mM 10-脫乙酰云南紅豆杉素C(15nmol)；50μl Millipore水。
溫育在各種溫度下溫育25分鐘。
乙酰轉移酶的最佳溫度是35℃。4．3等電點利用色譜聚焦確定等電點。將一種特異的陰離子交換劑，例如Mono PHR 5／20(購自Pharmacia)用于此目的，并在使其作為陰離子存在的pH值下向該陰離子交換劑上加載所需酶。在這些起始條件下，酶結合到柱材料上，隨后可用含有兩性電解質的緩沖液混合物(Polybuffer 94，購自Pharmacia)洗脫下來，所述緩沖液混合物通過柱時形成pH梯度。然后，就在pH值降低到使酶從陰離子態變為形式上不帶電荷的狀態的這一值，酶自己與陰離子交換劑脫離。這一pH就相當于等電點(IEP)。
對于乙酰轉移酶來說，IEP使用帶有Mono P HR 5／20柱(0．5cm φ×20cm，購自Pharmacia)的BioLogic FPLC工作站(購自Biorad)以流速為0．7ml／分鐘來測定。該色譜柱用25mM咪唑／HCl pH7．4平衡，并加載HighQ洗脫液。為此，用Centriprep濃縮器(30kD)將1ml HighQ洗脫液濃縮至100μl，再用上述咪唑緩沖液稀釋至6ml。在這里使用這種純度的蛋白質是因為該HighQ洗脫液含有最高活性(pcat／ml)，而色譜聚焦預期會導致活性大量損失。該色譜柱用10ml起始緩沖液洗滌，用40mlPolybuffer 74(用Millipore水稀釋1∶8倍，pH4)從柱上洗脫出蛋白質。收集1ml級分，為維持低pH值下的活性，從開始，每隔一個級分加入100μl 0．8M Tris pH8．5。測量中間級分的pH值。
為了確定活性級分，每隔一個級分取等分試樣與下述混合物溫育30分鐘混合物200μl酶溶液(緩沖至pH8．5)；30μl乙酰輔酶A(5nmol，含有0．02μCi[2-14C]乙酰輔酶A)；5μl 3mM 10-脫乙酰云南紅豆杉素C(15nmol)。
溫育在35℃下溫育30分鐘。
用叔丁基甲基醚萃取后，利用閃爍計數儀進行評估。
主要活性在pH5．7-5．47范圍內洗脫出來，所以乙酰轉移酶的等電點確定為pH5．6。4．4分子量的確定采用兩種不同的方法確定乙酰轉移酶的分子量，一種是使用校準過的凝膠過濾柱的凝膠過濾法，一種是SDS凝膠電泳法。
前者以0．2ml／分鐘的流速使用FPLC設備(BioLogic工作站，Biorad)和Biosilect-SEC 250-5柱(購自Biorad)進行，該柱已用50mM Tris，pH8．5，10mM 2-巰基乙醇平衡。首先，該柱用已知分子量的蛋白質進行校正。然后，在相同的條件下，通過柱洗脫已用Centriprep濃縮器(2ml，膜10kD)濃縮至100μl的1．5ml High Trap Blue洗脫液(3360pcat，50μg蛋白質)。級分大小為250μl，通過用下述混合物(總體積為185μl)溫育來確定洗脫液的活性混合物50μl 0．8M Tris，pH8．5；100μl洗脫液；30μl乙酰輔酶A(5nmol，還含有0．02μCi[2-14C]乙酰輔酶A)；5μl 3mM 10-脫乙酰云南紅豆杉素C(15nmol)。
溫育在35℃下溫育30分鐘。
用叔丁基甲基醚萃取后，利用閃爍計數儀進行評估。
使用該方法計算出乙酰轉移酶的分子量為72kD。
使用變性SDS凝膠電泳檢驗該值的正確性。為此，對0．3μg均質蛋白質用10％強度的SDS凝膠進行色譜分析，用具有已知分子量的標志蛋白質(Rainbow marker)作為平行對照。用銀染色法使蛋白質顯現，于是可以將校準蛋白質的Rf值和乙酰轉移酶的Rf值進行對比，測得后者的分子量為70．8kD。4．5KM值測定測定10-脫乙酰云南紅豆杉素C的KM值為了獲得有關乙酰轉移酶對10-脫乙酰云南紅豆杉素C的親和力的信息，測定苯基瓊脂糖洗脫液的KM值。
混合物50μl 0．8M Tris，pH8．5；100μl乙酰轉移酶(0．25pcat，40ng蛋白質，225倍富集)；30μl乙酰輔酶A(5nmol，還含有0．02μCi[2-14C]乙酰輔酶A)；10μl 10-脫乙酰云南紅豆杉素C(終濃度為0．1／0．3／1／3／5710／30／50／100／200／300／500μM)。
溫育在35℃下溫育30分鐘，用叔丁基甲基醚萃取后，利用閃爍計數儀評估放射性。
測量結果按照Lineweaver和Burk的方法以雙倒數方式作圖，從圖示測得10-脫乙酰云南紅豆杉素C的KM值為23μM。4．6乙酰輔酶A的KM值的測定乙酰轉移酶對乙酰輔酶A的親和力可以用KM值來描述，所述KM值可使用苯基瓊脂糖洗脫液來測定。
混合物50μl 0．8M Tris，pH8．5；100μl乙酰轉移酶(0．25pcat，40ng蛋白質，225倍富集)；30μl乙酰輔酶A和水(終濃度為2．1／2．3／3／5／12／32／52／102／152／202／302／502μM，各含有2μM(40，000cpm)[2-14C]乙酰輔酶A)；5μl 3mM 10-脫乙酰云南紅豆杉素C(15nmol)。
溫育在35℃下溫育30分鐘，用叔丁基甲基醚萃取后，利用閃爍計數儀進行評估。測量結果按照Lineweaver和Burk的方法以雙倒數方式作圖，從而測得乙酰輔酶A的KM值為61μM。4．7轉換數Kcat轉換數通過說明每秒鐘內一分子酶轉化多少分子的底物而描述酶反應的反應速率。
使用苯基瓊脂糖洗脫液來測定轉換數。通過利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳將洗脫液分離，再用銀染色法而測得其中所含的乙酰轉移酶的濃度。將已知量的牛血清白蛋白作為對照濃度加入到凝膠的相鄰槽中。使用相當于18ng乙酰轉移酶的300μl酶溶液、10-脫乙酰云南紅豆杉素C和乙酰輔酶A，在5至30分鐘的范圍內所記錄的轉換動力學是線性的。混合物50μl 0．8M Tris，pH8．5；300μl乙酰轉移酶(18ng乙酰轉移酶，0．76pcat)；30μl乙酰輔酶A(5nmol，含有0．02μCi[2-14C]乙酰輔酶A)；5μl 3mM 10-脫乙酰云南紅豆杉素C(15nmol)。溫育在35℃下溫育30分鐘。
溫育混合物用叔丁基甲基醚萃取，并利用閃爍計數儀進行評估。從測量值計算轉換數(pmol)。用酶的量(18ng)除以分子量(72kD)得到每批的酶濃度為0．25pmol。
通過測定每單位時間(秒)的轉換來計算酶活性。酶活性(0．05pmol／sec)和濃度(0．25pmol)的商得到乙酰轉移酶的轉換值為0．2cat／mol均質酶(mol／sec／mol酶)。
轉換=轉換數Kcat0．05pmol／sec0．25μmol=0．2cat／mol。
這相當于在35℃、pH8．5和最佳量的底物(60mol 10-脫乙酰云南紅豆杉素C，20mol乙酰輔酶A)條件下，每摩爾酶(72kg)每秒轉換0．2mol底物。4．8最佳動力學在生理學條件下，與酶的濃度相比底物的濃度非常小。只有少量的酶活性中心被占據，因此，未被底物占據的酶的量[E]大致相當于酶總量[E0]。
如果底物的濃度[S]大大低于KM(起始反應速率為半最大速率時的濃度)，則酶反應進行得比轉換數Kcat說明的要慢得多。
使用商Kcat／KM來描述酶在這些條件下的特征。用該值乘以底物濃度[S]和酶的總量[E0]就可得到反應速率。
v=(Kcat／KM)[S][E0]
必須考慮到溶解在含水介質中的分子的擴散速率最多可達到108-109，因此，即使是非常快的酶，其反應速率也是有限的，因為底物不可能更迅速地接觸到酶。
所計算出的對乙酰轉移酶的最佳動力學如下KM(10-脫乙酰云南紅豆杉素C)=23μM，Kcat=0．2cat／molKcat／KM=0．2mol s-1mol-1／23·10-3[M]=8．7 s-1M-1
-10-脫乙酰云南紅豆杉素C-14-脫乙酰云南紅豆杉素C-10，14-脫乙酰云南紅豆杉素C-2，10，14-脫乙酰云南紅豆杉素C-5，10，14-脫乙酰云南紅豆杉素C-2，5，10，14-脫乙酰云南紅豆杉素C-2，14-脫乙酰云南紅豆杉素C-5，14-脫乙酰云南紅豆杉素C-2，5-脫乙酰-10，14-脫乙酰云南紅豆杉素C-10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ(=10-DAB Ⅲ)-10-脫乙酰紫杉醇-10-脫乙酰頭孢馬啉-10-epi-10-DAB Ⅲ-19-羥基-10-DAB Ⅲ-14-羥基-10-DAB Ⅲ-7-TES-10-DAB Ⅲ-7-BOC-10-DAB Ⅲ我們發現，在所用的底物中，只有在C10位具有羥基的紫杉烷可被轉化。具有乙酰化C10位并且在其他碳原子上具有游離羥基的紫杉烷衍生物也不被純化的乙酰轉移酶接受為底物。不過，如果C10位被龐大的取代基封閉而不能接近，如10-脫乙酰紫杉醇和10-脫乙酰頭孢馬啉的情況，則也不發生乙酰化。
當基于10-脫乙酰云南紅豆杉素C的轉化速率計算轉化速率時，我們發現，具有游離羥基的所有云南紅豆杉素C衍生物被轉化到相同程度。與10-脫乙酰云南紅豆杉素C轉化到漿果赤霉素Ⅲ相比，10-DAB的轉化速率為85％。
下表中顯示了基于脫乙酰云南紅豆杉素C轉化的各種底物的轉化情況。
基于10-脫乙酰云南紅豆杉素C轉化的各種底物的轉化10-脫乙酰云南紅豆杉素C酶苯基瓊脂糖洗脫液(225倍純化)
權利要求
1.制備漿果赤霉素和／或漿果赤霉素衍生物的方法，其特征在于使10-脫乙酰漿果赤霉素或10-脫乙酰漿果赤霉素衍生物在一種分離酶和乙酰基供體的存在下發生反應，所述酶是用SDS-PAGE測定分子量為70-72kD的乙酰轉移酶，其等電點為pH5．4-5．8，對乙酰輔酶A的米-曼常數KM為55-65μM，該乙酰轉移酶可從紅豆杉細胞培養物中獲得。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于從10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ制備漿果赤霉素Ⅲ。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于從14-羥基-10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ制備14-羥基漿果赤霉素Ⅲ。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于從10-脫乙酰云南紅豆杉素C制備云南紅豆杉素C。
5.如上述權利要求任一項所述的方法，其特征在于反應是在有作為乙酰基供體的乙酰輔酶A存在下進行的。
6.一種酶，其特征在于a)它在乙酰基供體特別是乙酰輔酶A的存在下，選擇性乙酰化10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ的10位，b)用SDS-PAGE測定的分子量為70-72kD，c)等電點為pH5．4-5．8，d)對乙酰輔酶A的米-曼常數KM為55-65μM，e)是一種10-羥基紫杉烷基-O-乙酰轉移酶，f)可以從紅豆杉細胞培養物獲得。
7.如權利要求7所述的酶，其特征在于它以大于50％的純度存在。
8.如權利要求7所述的酶，其特征在于它以大于90％的純度存在。
9.制備權利要求6-8任一項所述的酶的方法，其特征在于使用已知純化方法從含有酶的來源分離得到酶，每次純化后，通過加入10-脫乙酰漿果赤霉素或10-脫乙酰漿果赤霉素衍生物和乙酰基供體測定各級分中酶的存在，并檢測所形成的乙酰化產物。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于所述純化方法包括使用HighQ柱。
11.如權利要求9或10所述的方法，其特征在于用10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ或10-脫乙酰云南紅豆杉素C來檢測含有酶的級分。
12.如權利要求9-11任一項所述的方法，其特征在于所用的乙酰基供體是乙酰輔酶A。
13.如權利要求9-12任一項所述的方法，其特征在于所形成的乙酰化產物利用放射性標記來檢測。
14.如權利要求9-12任一項所述的方法，其特征在于所形成的乙酰化產物利用重同位素標記來檢測。
15.制備紫杉醇和／或紫杉醇衍生物的方法，其特征在于首先制備權利要求1-7任一項所述的漿果赤霉素或漿果赤霉素衍生物，然后利用已知方法反應得到紫杉醇或紫杉醇衍生物。
全文摘要
本發明公開了一種漿果赤霉素和/或漿果赤霉素衍生物的制備方法,其中,10－脫乙酰漿果赤霉素或10－脫乙酰漿果赤霉素衍生物在有一種分離酶和乙酰基供體存在下發生反應,所用的酶是用SDS－PAGE測定分子量為70－72kD的乙酰轉移酶,該乙酰轉移酶可以從紅豆杉的細胞培養物得到。
文檔編號C12Q1/48GK1290305SQ99802705
公開日2001年4月4日 申請日期1999年1月29日 優先權日1998年2月6日
發明者E·伯姆巴德里, B·門哈德, M·H·茨克 申請人:因迪納有限公司