專利名稱：一種具有較高生物學活性的gm-csf突變體及制法的制作方法
技術領域：
本發明涉及構建及表達一種GM-CSF突變體，這種突變體具有較高的生物學活性。
rhGM-CSF(recombinant human granulocyte-macrophagecolony stimulating factor，重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子)在臨床上已成功地用于癌癥患者化療后的白細胞減少癥等，臨床治療結果顯示了明顯的療效，但還有許多未盡人意之處，如重組GM-CSF比活性低、用于治療時用量大、循環半衰期短等缺點，近年來蛋白質工程方法、技術的進展使人們能夠按照一定的目的定向改造蛋白質分子，改變其不利的特性，增強蛋白質的生物學活性或使其獲得新的生物學特性。這種改造有賴于對蛋白質結構與功能透徹的了解，如改變IL-2第125位的半胱氨酸可以減少分子內二硫鍵的錯配，提高蛋白的穩定性及比活性，增加在體內的半衰期。對TNF的定點突變可以降低或缺失對人體的惡液質毒付作用，提高其抗腫瘤活性。
GM-CSF結構與功能研究證實，GM-CSF氨基端1-13位氨基酸對GM-CSF的生物學活性不是必需的，缺失這些氨基酸對GM-CSF生物學活性的發揮不僅沒有任何影響，相反認為1-13位氨基酸的存在對受體結合有空間上的位阻作用。GM-CSF分子的X-衍射結果表明，其結構特征為四α螺旋束緊密包裹在一起，N-端的部分氨基酸游離于GM-CSF的空間結構之外，可以解釋為什么缺失1-13位氨基酸的合成多肽其受體親合力反而有所提高。國外為獲得新的GM-CSF的突變體，作了大量的努力(granulocyte-macrophage colony-stimulating factorderivs.-lacking N-lined glycosylation or having only one N-linkedcarbohydrate chain，for higher specific activity，EP276846)。
本發明的目的是構建一種GM-CSF的突變體分子，具有高的比活性，受體親和力和較長的體內半衰期。
本發明的實施方案如下即GM-CSF(12-127)突變體的構建過程1.GM-CSF(12-127)突變體的克隆與鑒定聚合酶鏈式反應(PCR)擴增的引物序列為5′端Primer5′TA GAA TTC ATG CCA TGG GAA CA GTG 3′3′端Primer5′CT GGA TCC TTA TTC CTG GAC TGG CTC 3′5′端Primer從ATG之后即12位Pro開始的編碼區，引物內含EcoRI及BamHI的酶切位點。在引物設計上考慮以下一些原則在不改變氨基酸序列的前提下，盡量將C、G換成A，T，以降低5′端mRNA形成二級結構的可能性，并兼顧大腸桿菌對不同密碼子的喜好性。
克隆的PCR片段EcoRI、BamHI酶切后定向克隆于原核高效表達載體pBV220中，重組質粒pBV220/GM-CSF(12-127)經酶切鑒定證實(中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，DH5 α/pBV220GM-CSF12-127，編號CGMCC NO0254)。并回收GM-CSF(12-127)片段，插入到pGM3zf(+)克隆載體中，經藍白斑選擇，快提鑒定測序，確實在GM-CSF的N-端缺失了1-11位氨基酸的編碼序列。2.GM-CSF(12-127)突變體的表達與純化表達質粒pBV220/GM-CSF(12-127)經熱誘導表達后SDS-PAGE分析，與未突變的表達質粒pBV220/GM-CSF(26#)相比較，在同等表達條件下，突變后表達量比突變前GM-CSF有所提高。分析表達量提高的原因可能在于，刪除部分N-端后的基因避開了易于形成二級結構的序列。采用上述的純化路線，最終得到了純度達95％以上的GM-CSF(12-127)突變體蛋白。
表1 GM-CSF突變前后性狀比較突變前 突變后pBV220/GM-CSF pBV220/GM-CSF(12-127)菌體表達量 15％ 20％表達量(U/L菌液)8.9×1074.8×108比活性(U/mg蛋 6×1063×107白)抗原性 有 有受體親和性 - 提高實施例1PCR擴增基因的方法擴增GM-CSF(12-127)cDNA的PCR反應體系如下10×Buffer 10ul，4×dNTP 0.25mM，5′Primer 100pmol，3′Primer 100pmol，pCD/GM-CSF模板0.1ug，Tag酶2u，循環前加熱變性100℃ 5分鐘；PCR循環94℃，45秒；55℃，45秒；72℃，1分鐘；共28個循環。低融點瓊脂糖回收GM-CSF(12-127)片段，亞克隆入pBV220載體。
實施例2包涵體的純化表達菌體懸于20mM PBS，pH7.6的Buffer中，超聲裂解細菌，離心沉淀包涵體，以0.5M尿素、20mM PBS洗包涵體2-3次。將包涵體溶于3-4倍體積的7M鹽酸胍、100mM 2-巰基乙醇、50mM Tris.HCl、1mMEDTA、pH7.5的裂解緩沖液中，4℃放置過夜。17,000rpm離心15min，上清中加入75倍體積的20mM Tris HCl、1mM還原型谷胱甘肽、0.1mM氧化型谷胱甘肽、pH8.0中，使鹽酸胍濃度逐漸由7M→6M→4M→2M→0.1M，使復性液的蛋白終濃度在0.1mg/ml左右，4℃放置過夜。
實施例3目的蛋白的純化復性后的蛋白離心去除變性蛋白后將固體硫酸銨按10％(W/V)加入復性蛋白溶液，混勻后過Phenyl Sepharose FF柱，用1-2倍體積的50mM PB含10％(W/V)硫酸銨、pH6.9將蛋白峰洗至基線，2倍柱體積的20mM PB、pH7.0洗脫活性組分，活性組分過Q Sepharose FF層析柱，用1倍體積的20mMPB、pH6.5將蛋白吸收峰洗至基線，用2倍體積的20mMPB、0.15M NaCl、pH6.5洗脫活性組分，濃縮后過Superdex 75柱層析。
實施例4受體親和實驗TF-1細胞5×105細胞，懸浮于100μl BindingBuffer(DMEM含4ng/ml BSA，pH7.4)，加入1nM的125IGM-CSF；分別加入50μl不同濃度的未突變的GM-CSF和突變的GM-CSF(溶于Binding Buffer)，4℃作用120分鐘。離心沉淀重懸于冷的Binding Buffer中，離心通過0.7ml FCS，切除沉淀用γ計數器測定放射性(cpm值)。
實施例5質粒的提取方法單菌落接種與含氨芐青的LB中搖菌過夜，離心收集菌體，將細菌沉淀重懸于150ul溶液I中，5分鐘后加溶液II，置于冰上10分鐘；加200ul溶液III，置于冰上10分鐘；10000rpm離心10分鐘，去除沉淀，等體積酚/氯仿抽提。上清加2.5倍體積的乙醇，置于液氮中15分鐘，15000rpm離心15分鐘，抽干沉淀，用20ul TE緩沖液溶解。
實施例6目的蛋白的表達挑取單菌落于含氨芐青的LB中30℃搖菌過夜，次日1∶10接種于5ml LB中，30℃搖菌至OD值大約0.5-0.7左右，快速升溫至42℃，表達4小時左右，5000rpm離心5分鐘收集菌體。加蛋白電泳緩沖液，100℃煮5分鐘，10000rpm離心3分鐘，上清用SDS-PAGE分析蛋白表達。
實施例7蛋白質的活性檢測表達菌體用10倍體積的6M鹽酸胍溶解，室溫下放置1小時以上或4℃過夜，繼以PBS透析過夜。將TF-1細胞1×104細胞，反復用DMEM洗3-4遍，將不同比例稀釋的樣品加入TF-1細胞培養液中，采用MTT法計算樣品的活性單位數。
本發明的優點是1.GM-CSF突變體與未突變體相比其比活性高，受體親和力強，半衰期長；2.用本發明方法制備的GM-CSF突變體較為穩定，制備方法可靠、簡便。
權利要求
1.一種具有較高生物學活性的GM-CSF(12-127)突變體，其特征在于(1)PCR擴增的引物序列為5′端Primer5′TA GAA TTC ATG CCA TGG GAA CA GTG 3′3′端Primer5′CT GGA TCC TTA TTC CTG GAC TGG CTC 3′5′端Primer從ATG之后即12位Pro開始的編碼區，引物內含EcoRI及BamHI的酶切位點。(2)克隆的PCR片段EcoRI、BamHI酶切后定向克隆于原核高效表達載體pBV220中，重組質粒pBV220/GM-CSF(12-127)。
2.一種具有較高生物學活性的GM-CSF(12-127)突變體的制備方法，其特征在于(1)PCR反應體系(實施例1)；(2)包涵體的純化(實施例2)；(3)目的蛋白的純化(實施例3)；(4)質粒的提取(實施例5)；(5)蛋白的表達(實施例6)。
全文摘要
本發明是GM-CSF的一種突變體，刪除氨基端的1-11位的氨基酸，由此構建的突變體具有較高的生物學活性、較高的受體親和力、較長的體內半衰期。在以上幾個方面優于天然結構的GM-CSF。
文檔編號C12N15/63GK1135529SQ96101409
公開日1996年11月13日 申請日期1996年2月14日 優先權日1996年2月14日
發明者李福勝, 張智清, 侯云德, 顏子穎 申請人:中國預防醫學科學院病毒學研究所