一種仿刺參種質鑒定方法
【專利摘要】本發明是一種仿刺參種質鑒定方法，所述的鑒定方法步驟如下：（1）樣本提取：將疑似仿刺參樣本，隨機取樣，加液氮在研砵中研成粉末，分裝到2mLEP管中；提取DNA；（2）PCR鑒定；（3）鑒定標準：產物8%聚丙烯酰胺凝膠電泳2.5h，銀染顯色后掃描儀成像；引物Aja2-111的結果為111bp的一條帶；引物Aja13-144的結果為144bp的一條帶；引物Aja15-185的結果為185bp和384bp的2條帶；（4）結果判定：用引物擴增出如步驟（3）所述的條帶時，判定樣本是仿刺參。本發明方法設計合理，操作方便快捷，準確度高，有效地克服現有經驗性鑒定和利用刺參分類專家才可鑒定的缺陷。
【專利說明】一種仿刺參種質鑒定方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及種質鑒定方法，特別是一種仿刺參種質鑒定方法。

【背景技術】
[0002] 海參為海產棘皮動物門海參綱動物的總稱，全世界有900多種，可供食用的約40 多種，而我國有101種，可供食用的有21種。根據海參背面是否有圓錐肉刺狀的疣足分為 "有刺參"和"光皮參"兩大類。其中"有刺參"主要是"刺參科"的種類，"光皮參"主要是 "海參科""瓜參科"和"芋參科"的種類。通常見到的市售海參主要是海參科、刺參科、瓜參 科、和宇海參科的一些海參種類。
[0003] 在海參家族中，仿刺參（Apostichopus japonicus)是我國經濟價值最高的一種 海參。仿刺參隸屬于楣手目、刺參科、仿刺參屬。體呈圓筒狀，長度一般在20cm左右，直徑 在4cm左右。刺身的背部均勻分布著許多大小不等的肉刺，腹面平坦，受外界刺激后會蜷 縮身體并使身體變得僵硬。國內仿刺參一般在遼寧，河北，山東，江蘇等地的沿海地區很常 見。國外北太平洋區列如俄羅斯的薩哈林，海參崴；日本的北海道，橫濱，九州；朝鮮半島沿 岸等地區以及其他地區均有刺參的分布。仿刺參之所以是一種名貴的海產品，是在于它本 身具有很高的營養價值，而且還可以入藥，在醫學上也有很大的貢獻。隨著對仿刺參養殖的 深入研究以及技術的不斷改良，導致仿刺參養殖業開始迅速的發展，苗種的生產能力在不 斷地提高，養殖面積也在進一步的擴大，產量也在急速增長，養殖收益愈發可觀，成為我國 沿海漁業經濟中的重要支柱，是繼海帶、對蝦、扇貝、海水魚4次養殖浪潮后第5次海水養殖 浪潮的主體。
[0004] 由于仿刺參具有極高的營養價值，市場售價也較高，一些不法商販常用一些低價 的海參來充斥仿刺參市場，特別是經過加工后的海參制品更是難以鑒定其來源。因此，開發 一種仿刺參特有的鑒定方法，對于仿刺參種質鑒定、食源性檢測鑒定具有十分重要的作用。 當前，人們在鑒定仿刺參的方法上仍依賴傳統的經驗，以形態學鑒定生物種，但仿刺參經過 加工成半成品或食品原料時，或保健品時，其原有的形態則滅失，無法從外觀上加以鑒定。 而且，與仿刺參外觀相似的刺參種類也較多，需經非常專業的分類專家才可以鑒定，對生產 實際造成了很大的障礙。因此，開發一種相對簡單、一般檢測人員就可以鑒定的技術方案具 有很強的實用性和應用價值。


【發明內容】

[0005] 本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種新的、快捷方便的 仿刺參種質鑒定方法，該方法可以克服現有經驗性鑒定和利用刺參分類專家才可鑒定的缺 陷。
[0006] 本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明是一種仿刺 參種質鑒定方法，其特點是，所述的鑒定方法步驟如下：
[0007] (1)樣本提取：將疑似仿刺參樣本，隨機取樣5g，加液氮在研砵中研成粉末，取 〇.〇5g分裝到2mL EP管中，取樣至少3支；在不能即時提取DNA時，則-20°C保存備用；按常 規的酚氯仿法提取DNA，或者用深加工食品DNA提取試劑盒按操作指南提取DNA ;
[0008] (2) PCR 鑒定：
[0009] 反應條件：
[0010]

【權利要求】
1. 一種仿刺參種質鑒定方法，其特征在于，所述的鑒定方法步驟如下： (1) 樣本提取：將疑似仿刺參樣本，隨機取樣5g，加液氮在研砵中研成粉末，取0.05g分 裝到2mLEP管中，取樣至少3支；在不能即時提取DNA時，則-20°C保存備用；按常規的酚 氯仿法提取DNA，或者用深加工食品DNA提取試劑盒按操作指南提取DNA; (2)PCR鑒定： 反應條件： 15u1體系： 模板 0. 2ii1 2XTaqPCRMasterMix7. 5u1 弓丨物 1. 1,上下游引物均為2. 5iimol/L ddH20 6. 1u1 PCR反應程序：
引物序列：
(3) 鑒定標準：產物8 %聚丙烯酰胺凝膠電泳2. 5h，銀染顯色后掃描儀成像；引物 Aja2-lll的結果為lllbp的一條帶；引物Ajal3-144的結果為144bp的一條帶；引物 Ajal5-185的結果為185bp和384bp的2條帶； (4) 結果判定：用步驟（2)所述的3對引物擴增出如步驟（3)所述的條帶時，判定樣本 是仿刺參。
2.根據權利要求1所述的仿刺參種質鑒定方法，其特征在于，步驟⑵中：所述引物的 設計合成方法如下： (1)將測序得到的引物序列用Seqman程序，進行對比拼接，去除冗余，再將得到的每一 個DNA序列輸入到SSR軟件中，找出每DNA序列的重復序列，以及其重復次數；運用Primer Premierf軟件對所有微衛星序列進行引物設計，設計出上游引物和下游引物共23對，將所 得到的引物序列進行合成；所設計的引物序列如下表：

(2)仿刺參合成引物的鑒定PCR擴增： 建立一個15ill的擴增體系：
上下游引物是根據引物合成單上的ODs值與nmoles per 0D中的n值向合成引物干粉 中添加TE buffer制成引物原液，再將引物原液與TE以1:39的比例稀釋40倍后用于擴增 體系，濃度為2.5 iimol/L,;而模板是4地理群體（采自遼寧大連，河北北戴河，山東東營， 江蘇連云港的天然水域）24個較好的仿刺參組DNA經過滅菌雙蒸水稀釋5倍后的稀釋液， 濃度約為l〇ng/yl ;將這它們用移液槍按要求量移入管中，用過離心將它們混合在一起然 后放入PCR擴增儀中進行擴增； PCR擴增程序 蓋頂溫度：99°C
PCR產物的檢測 擴增出來的PCR產物使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測：將混合液擴增產物進行檢 測，配制好的1. 0%的瓊脂糖膠液倒入插好梳子的電泳槽中凝固成型，然后拔掉梳子，加入 電泳液，沒過膠板0. 5-lcm，然后用移液槍將5ill的PCR產物和2ill的溴酚藍指示劑混合 均勻后點入瓊脂糖凝膠的點樣孔中；按下開關后，將電壓設置成120V，電流60m然后電泳約 30min;電泳結束后營造一個較暗的環境，用手提式紫外線照射儀查看條帶電泳情況，是否 跑出條帶，條帶亮度大小；觀察之后再將膠板拿到紫外線凝膠呈像系統觀察，并拍照記錄； 將電泳條帶較亮的引物篩選出來，作為下一步實驗用引物；23對引物中，12對引物的條帶 亮度較好，較為清晰；最終選定權利要求1所述的3對擴增穩定的引物。
3. 根據權利要求1所述的仿刺參種質鑒定方法，其特征在于，步驟⑶中：聚丙烯酰胺 凝膠電泳步驟如下： (1) 待聚丙烯酰胺凝膠凝固之后，將梳子輕輕拔出，夾子和膠條取下，將膠板耳板向里 固定在電泳槽中，兩邊各用兩個夾子夾緊； (2) 向電泳槽中加入1XTBE，下面加到槽壁的2/3處，上面加到沒過耳板lcm左右的地 方； ⑶接通電源，電泳槽上為負極，下為正極；以250V電壓，70mA電流，預電泳30min; (4) 預電泳結束后，關掉電源；用移液槍向第一個點樣孔中加入一個2ill的MarkerD 作為參照物，然后依次往后加入2yl的PCR產物；Mix沒有顏色的話PCR產物還要與溴酚 藍指示劑混合后再點入點樣孔； (5) 點好樣后，接通電源，250V，70mA正式電泳約2小時；意觀察條帶跑到距離底部約 lcm處停止電泳。
4. 根據權利要求1或2或3所述的仿刺參種質鑒定方法，其特征在于，步驟⑶中：聚 丙烯酰胺凝膠電泳后膠板的銀染顯色方法如下：電泳結束后，將膠板取下，用小刀沿膠板的 一角輕輕撬開，然后用去離子水輕輕的沖洗膠面，沖洗好后將膠板膠面朝上放入配好的銀 染液當中，避光染色；染色過程中每隔兩三分鐘要輕輕的晃動銀染液，使銀染液與膠體充分 接觸，染色均勻；染色10 - 15min后取出膠板；用去離子水再次將染色后的膠體沖洗干凈， 然后放入染色液中輕輕晃動進行染色；當出現清晰的條帶后立即取出膠板，用去離子水輕 輕沖洗一下膠板，再用衛生紙把膠板背面擦拭干凈，拿到掃描儀中掃描并拍照。
【文檔編號】C12Q1/68GK104404166SQ201410826860
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月25日 優先權日:2014年12月25日
【發明者】陳百堯, 伏光輝, 薛學坤, 安健, 張慶起, 張立祥, 董志國, 孫苗苗 申請人:連云港市海洋與水產科學研究所, 連云港贛榆佳信水產開發有限公司, 連云港帥森海水養殖專業合作社, 淮海工學院