鏈霉菌菌株及其防治辣椒立枯病聯合應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了鏈霉菌菌株及其防治辣椒立枯病聯合應用，涉及微生物【技術領域】，本發明所述的放線菌是從浙江杭州西溪濕地采集的10~15cm深層土樣中采用放線菌分離技術分離獲得的，經微生物分類學鑒定，命名為白色鏈霉菌（ Streptomyces albus ）2013和弗氏鏈霉菌（ Streptomyces fradiae ）M931， S.albus 2013已于2013年6月19日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：CCTCC NO:M2013269； S.fradiae M931已于2013年12月25日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：CCTCC NO:M2013712。兩菌株均能發酵產生對辣椒立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kuhn)具有較強拮抗作用的活性物質，可用于防治辣椒立枯病等植物病害。當兩菌株的發酵產物按重量百分比為3:2混合制成混合制劑時，防治辣椒立枯病的效果較兩種代謝產物分別作為單一制劑使用時更為顯著。
CCTCC NO: M 2013269
2013.06.19

CCTCC NO: M 2013712
2013.12.25
【專利說明】鏈霉菌菌株及其防治辣椒立枯病聯合應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物【技術領域】，涉及兩株生防放線菌一白色鏈霉菌2013和弗氏鏈 霉菌M931代謝產物在防治辣椒立枯病中的應用。 技術背景
[0002] 辣椒（Capsicum annuum L.)是人們喜愛的蔬菜和調味品之一，在蔬菜生產中占 有重要地位。由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani)引起的辣椒立枯病是辣椒育苗前期引起 死苗倒苗的重要病害，多在辣椒子葉期發生，引起幼苗靠地面處莖基腐爛縊縮、猝倒死亡， 苗床土壤濕度大時，病害發展迅速，可致大量幼苗死近年來辣椒立枯病的發生逐年加重，給 辣椒生產造成嚴重威脅。多年來，以化學防治為主的措施不但未能遏制病害上升的趨勢，而 且還抑制了土壤中的有益微生物，導致病原菌產生抗藥性和再猖獗，同時造成有害物質殘 留。因此，尋找生防菌資源，探索控制辣椒病害的生物防治途徑，對農業可持續發展具有重 大意義。
[0003] 因此，生物防治引起人們的重視。目前有研究表明植物提取物中的活性成分對有 一定的抑制作用，但植物有效成分提取操作步驟多，效率低；已報道采用哈茨木霉、沙雷氏 菌等。放線菌因其易產生抗病原菌成分等活性物質，已成為生物防治的主要資源和生物農 藥開發的主要來源。土壤是放線菌棲居的重要場所，從土壤中獲得具有高效抗菌活性的放 線菌是目前世界范圍內研制開發新醫藥和新農藥必不可少的基礎工作。國內外在生物防治 辣椒立枯病方面已報道有抑制作用的大多為真菌和細菌，如哈茨木霉和沙雷氏菌，從土壤 中篩選拮抗放線菌對辣椒立枯病原真菌的生物防治報道還并不多見。


【發明內容】

[0004] 為了克服現有技術的不足，本發明的第一個目的在于通過篩選提供對辣椒立枯病 原菌具有較強拮抗作用的兩株生防菌一白色鏈霉菌2013和弗氏鏈霉菌M931。
[0005] 本發明的第二個目的是通過不同的比例混合兩株生防鏈霉菌的發酵產物，提供上 述白色鏈霉菌和弗氏鏈霉菌在辣椒立枯病防治中的聯合應用。
[0006] 本發明的目的是通過以下技術手段得以實現： 本發明首先以在浙江西溪濕地植物根際采集的土樣為研究對象，經分離、發酵培養、 發酵液提取以及對植物病原真菌抑制活性檢測等步驟獲得兩株對辣椒立枯病原菌具有較 強抑菌活性的鏈霉菌；其中一株經微生物分類學鑒定并命名為白色鏈霉菌 <^/?5)2013。該菌已于2013年6月19日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為： CCTCC NO: M 2013269;另一株經微生物分類學鑒定并命名為弗氏鏈霉菌(泣 /rat/ia￡〇M931，該菌已于2013年12月25日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為 CCTCC NO: M 2013712。中國典型培養物保藏中心地址：武漢市武昌珞珈山，郵編：430072。
[0007] 本發明所述的白色鏈霉菌2013在PDA固體培養基上培養 時氣絲白色，基絲地衣狀，乳脂色。顯微觀察發現a/Zws 2013孢子絲螺旋形， 孢子球形至卵圓形，表面光滑。本發明所述的aWws 2013,發酵液經提取濃 縮后可對辣椒立枯病原菌具有較強的抑制作用。
[0008] 本發明所述的弗氏鏈霉菌/hat/iae) M931在PDA固體培養基上培 養時氣絲白色，基絲淺黃色。顯微觀察發現/hat/iae M931孢子絲柔曲，孢 子橢圓形，表面光滑。本發明所述的/rat/iae M931，發酵液經提取濃縮后可 對辣椒立枯病原菌具有較強的抑制作用。
[0009] 所述的辣椒立枯病原菌拮抗放線菌的篩選和抑菌活性檢測過程如下所述： (1) 從野外(浙江省西溪濕地植物根際）采集土樣，并進行晾干處理； (2) 從土樣中分離放線菌，并利用辣椒立枯病原菌作為指示菌篩選具有拮抗作用的放 線菌； (3) 將長出的放線菌分別點種于混有辣椒立枯病原菌孢子懸液（IXlO6 cfu ^mr1)的 PDA平板上，通過觀察抑菌圈大小，挑選抑菌圈較明顯的菌株進入復篩； (4) 將選取的菌株進行發酵培養，發酵結束后離心收集發酵液，用乙酸乙酯萃取，真空 減壓濃縮后制備浸膏，用于辣椒立枯病的防效檢測，由此篩選出防治效果較好的兩株拮抗 微生物一白色鏈霉菌2013和弗氏鏈霉菌M931。
[0010] 本發明的有益效果： 本發明從土壤中分離篩選出對辣椒立枯病原菌具有較強抑制作用的兩株拮抗鏈霉菌 a/tos 2013 和/hat/iae M931，兩株菌株的發酵產物按重量百 分比為3:2制成的混合制劑可用于辣椒立枯病病害的防治，為生物農藥的開發提供了新的 途徑。

【具體實施方式】
[0011] 實施例 I : a/tos 2013 和 /hat/iae M931 的分離與 篩選） 按以下步驟進行： (1) 材料及培養基：用于分離白色鏈霉菌2013和弗氏鏈霉菌M931的材料為采自浙江 西溪濕地植物根際的土樣，用于放線菌分離所用的培養基為含重鉻酸鉀的PDA培養基(配 方為：稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加蒸餾水IL煮沸半小時，紗布過濾，再加20g葡 糖糖和20g瓊脂，充分溶解后趁熱紗布過濾，分裝至錐形瓶或玻璃試管中，121°C，高壓滅菌 20min;使用時添加重鉻酸鉀20iig ? ml/1;以下試驗中放線菌常規培養所用培養基均以蒸 餾水配置）； (2) 分離純化：將上述新鮮采集的土樣裝于采樣袋中，帶回實驗室后分裝晾干一周左 右；瞭干后的土樣每份稱取5g，分別加入含有45ml無菌水的錐形瓶中，錐形瓶中加入3-5 粒無菌的玻璃珠，28°C搖床培養2h，使土樣中的微生物充分進入水中；吸取培養后的樣品 以10倍梯度稀釋，分別取10' 10' KT4濃度稀釋液200 ii L，涂布于含20 ii g ? ml/1重鉻酸 鉀的PDA固體平板上，28°C培養72h ;將平板上長出的放線菌分別挑取單菌落，接種于含重 鉻酸鉀的新鮮PDA平板上，28°C ± 1°C條件下純化培養72h，獲得純化后的放線菌； (3) 初篩和復篩：將分離得到的放線菌分別點種于混有辣椒立枯病原菌孢子懸液 (I X IO6Cfu ^171)的PDA固體平板上，通過觀察抑菌圈大小，挑選抑菌圈較明顯的菌株進行 復篩； 復篩采用平板對峙法對初篩的放線菌進行抑菌活性測定，具體方法為：在PDA固體平 板上分別對稱放置一個直徑4mm的放線菌菌餅和一個辣椒立枯病原菌菌餅，置培養箱中 28°C ±1°C條件下培養72h，以無菌水處理作為對照，重復3次；采用十字交叉法測定菌落直 徑。抑菌率通過以下公式計算： 抑菌率（%) = (1-處理菌落生長半徑/對照菌落生長半徑）X 100 根據結果獲得抑菌活性較好的兩株放線菌，對辣椒立枯病原菌的抑菌率均在70%以 上。綜合16S rDNA序列的比對結果、形態特征、培養特征和生理生化特性，其中一株菌株鑒 定為白色鏈霉菌，命名為白色鏈霉菌2013 (泣WZw1S 2013);另一株菌株鑒定 為弗氏鏈霉菌，命名為弗氏鏈霉菌M931 (泣/rat/iae M931);保存。
[0012] (4) 2013 和 /hat/iae M931 抑菌活性測定： 將利用馬鈴薯葡萄糖液體培養基培養好的a/tos 2013和Stre/? (OffiiFce1S /rat/iae M931按5% (v/v)分別接入發酵培養基中，28°C ±1°C條件下，180 r/min，搖床培 養120h后，7800 r/min離心7 min,用濾紙過濾得發酵濾液。取經0. 22 iim膜過濾的發酵 上清液ImL于無菌培養皿內，與9mL冷卻至50°C的PDA培養基迅速混勻，冷卻后在每個培養 基平面中央分別放1個直徑為4mm的辣椒立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kuhn)菌餅， 置培養箱中28°C培養72h，以無菌水處理作為對照，重復3次；待對照菌落直徑長至平板直 徑的2/3左右時統計結果，采用十字交叉法測定菌落直徑，以下列公式計算抑制率： 菌絲生長抑制率（％)=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑）/(對照菌落直徑-4)] X 100 測定結果表明 a/tos 2013 和 /hat/iae M931 代謝產物 對辣椒立枯病菌生長抑制率分別為72. 9%和70. 5%。
[0013] 實施例 2 : 2013 和 /hat/iae M931 發酵代謝 產物的制備方法） 按以下步驟進行： (1) 菌種的活化培養：將保存的 a/tos 2013 和 /hat/iae 1931孢子懸液（1父108(^11，111171)接入馬鈴薯葡萄糖液體培養基，在281：±11：條件下培 養4?供發酵使用； (2) 發酵培養：發酵培養基每I L中含有黃豆餅粉10g，玉米粉4g，可溶性淀粉20g， 葡萄糖5g，蛋白胨5g，CoCl2 0. 02g，牛肉膏5g，CaCO3 5g，酵母膏5g，每300mL三角瓶裝 發酵培養液50mL ;配制后121°C滅菌20min，將利用馬鈴薯葡萄糖液體培養基培養好的 a/tos 2013 和 /hat/iae M931 按 5% (v/v)分別接入發酵培養 基中，在28°C ±1°C條件下，搖床轉速180 r/min，發酵培養84 h; (3) 發酵物提取：發酵完畢，離心，棄菌體，收集發酵液于分液漏斗中，將加入等體積的 乙酸乙酯萃取，充分混勻，待分層后，取上層液相至圓底燒瓶，利用旋轉蒸發儀濃縮后獲得 萃取物浸膏，用于測定抑菌活性。
[0014] 以下實施例 3 和試驗例中所述的 Stre/? (OffiiFce1S a/tos 2013 和 Stre/? (OffiiFce1S /rat/iae M931代謝產物均為實施例2所制產品；所述產品的百分含量均為質量/體積百分 比。
[0015] 實施例 3 : 2013 和 /hat/iae M931 代謝產物 對辣椒立枯病菌的抑制作用） (1)分別準確稱取Str印a/tos 2013 和/hat/iae M931 代謝產 物0. lg，并加入IOmL體積的無菌水，超聲波震蕩充分溶解，分別配置終濃度為10 g/L的母 液； (2)抑菌活性測定：取上述母液分別稀釋成濃度為lg/L和0. 5g/L的溶液，取各濃度溶 液ImL于無菌培養皿內，與9mL冷卻至50°C的PDA培養基迅速混勻a/Zws 2013和泣re/7te聊cm /rat/iae M931代謝產物終濃度分別均為0. lg/L和0. 05g/L)，冷卻后 在每個培養基平面分別放1個直徑為4mm的辣椒立枯病菌菌餅，菌餅接于培養皿中央（培 養皿直徑為9cm)，置培養箱中28°C培養36h，以常規化學藥劑和無菌水處理作為對照，重復 3次；采用十字交叉法測定菌落直徑，以下列公式計算抑制率： 菌絲生長抑制率（％)=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑）/(對照菌落直徑-4)] XlOO 試驗例：(本發明產品與常規農藥防治效果對比試驗） 試驗結果見表 1。從表 1 看出，Str印a/tos 2013 和 Stre/?/hat/iae M931代謝產物抑制辣椒立枯病菌效果較常規化學藥劑相差無幾，當兩菌株的發酵產物按重 量百分比為3:2混合制成混合制劑使用時，防治辣椒立枯病的效果較兩種代謝產物分別作 為單一制劑使用時更為顯著。
[0016]表 I a/tos 2013 和 /hat/iae M931 代謝產物對供試 的辣椒立枯病原菌的抑制效果及比較

【權利要求】
1. 一種鏈霉菌菌株，其特征在于：菌株2013分類命名為白色鏈霉菌(5?/·--/7?ο?_7----5· W/ws) 2013,保藏單位：中國典型培養物保藏中心，保藏日：2013年6月19日，保藏登記號 為CCTCC NO: Μ 2013269;另一種鏈霉菌菌株M931，其特征在于：菌株M931分類命名為弗氏 鏈霉菌(泣?ο聊cm /rat/iae ) Μ931，保藏單位：中國典型培養物保藏中心，保藏日：2013 年12月25日，保藏登記號為CCTCC NO: Μ 2013712。
2. -種如權利要求1所述的鏈霉菌菌株的應用，其特征在于：所述的白色鏈霉菌2013 和弗氏鏈霉菌Μ931均能發酵產生對辣椒立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kuhn)具有較 強拮抗作用的活性物質，可防治辣椒立枯病病害，龜裂鏈霉菌2013和M931兩者的代謝產物 重量百分比為3:2時，效果顯著。
3. 權利要求2所述的應用，其特征在于：所述的白色鏈霉菌2013和弗氏鏈霉菌M931 代謝產物的制備方法如下： (1) 將分離得到的白色鏈霉菌2013和弗氏鏈霉菌M931涂布于甘露醇黃豆餅粉制成的 MS平板上，收集孢子接種于發酵培養基； (2) 發酵培養基為每1 L中含有黃豆餅粉10g，玉米粉4g，可溶性淀粉20g，葡萄糖5g，蛋 白胨5g，C〇Cl2 0· 02g，牛肉膏5g，CaC03 5g，酵母膏5g，每300mL三角瓶裝發酵培養液50mL ; 配制后121°C滅菌20min，將利用馬鈴薯葡萄糖液體培養基培養好的a/Zws 2013和5^/'<9/7(〇?/^<951/>，<3￡// <3(9]\1931分別按5%(>八)接入發酵培養基中，在28°〇±1°(1|條 件下，搖床轉速180 r/min，發酵培養84 h ; (3) 發酵結束后離心收集發酵液，加入等體積的乙酸乙酯，充分震蕩混勻，取上層，在真 空條件下濃縮至浸膏； (4) 混合制劑配制：將5^/'<9/7(〇?/^<915<3從^/512013和5^/'(9/7(〇?/^(9 >5/>'<3￡//<3(9]\1931代謝 產物用水溶解，混合，配成終濃度為〇. 〇6g/L aWws 2013代謝產物和0. 04g/ L 5?/·<9/7?ο?_7--(95· /rat/iae M931 代謝產物混合配方制劑。
【文檔編號】C12R1/54GK104293710SQ201410509421
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月29日 優先權日:2014年9月29日
【發明者】馬正, 俞曉平, 羅帥, 路丹丹, 邊亞琳, 許益鵬, 王正亮, 申屠旭萍 申請人:中國計量學院