一種通過溫度轉換發酵生產含γ-亞麻酸油脂的方法
【專利摘要】一種通過溫度轉換發酵生產含γ-亞麻酸油脂的方法。涉及生產γ-亞麻酸油脂的方法。將小克銀漢霉菌接種于PDA平板培養基中培養，再將菌塊接種于新PDA平板培養基中再培養，新PDA平板培養基上的菌塊接種于另一新的PDA平板培養基中培養；然后將另一新的PDA平板培養基上的菌塊接種于裝有種子培養基的搖瓶中，pH值調至5～7，培養后，得搖瓶種子；將所得搖瓶種子接種于裝有發酵培養基的搖瓶中，pH值調至5～7，先于30～40℃培養6～8d，轉速為100～250rpm，再于10～20℃培養4～6d，轉速為100～250rpm，得發酵液，抽濾，潤洗，得濕菌體，烘干、研磨、萃取，得到含γ-亞麻酸油脂。
【專利說明】一種通過溫度轉換發酵生產含Y-亞麻酸油脂的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程【技術領域】，涉及一種生產Y-亞麻酸油脂的方法，尤其是涉及一種通過溫度轉換發酵生產含Y-亞麻酸油脂的方法。
【背景技術】[0002]Y-亞麻酸，化學名稱:6，9，12-十八碳三烯酸，它是前列腺素前體，存在于月見草、玻璃苣、黑加侖的種子油中。已有研究者將其做成膠囊對濕疹、經前緊張、糖尿病、癌癥和許多其他疾病等有良好療效(Horrobin，D.F.1992)。已經有許多研究者嘗試通過微生物來生產GLA，然而，他們發現只有部分屬于毛霉目的低等真菌，尤其是被孢霉屬(Mortierella spp.) (Yokochi, Usita et al.1990;Hansson and Dostalekl988),毛霉屬(Mucor spp.) (Aggelis, G., Ratomahenina, R.et al.1988;Torlanova, Funtikovaet al.1992; Lindberg and Hanssonl991)和根霉屬(Rhizopus spp.) (Herbert andKeithl991; Kristofikova, Vlnova et al.1991)可以成為有發展前景的GLA生產菌株。目前，已有人分別用深黃被孢霉和爪哇毛霉發展了兩種大規模的生產工藝用于GLA的商業化生產(Ratledgel989)。
[0003]小克銀漢霉屬真菌作為生產GLA的潛在菌株(Chen and Changl996;Chen andLiul997; Gema, Kavadia et al2002; Kavadia, Komaitis et al2001)正越來越引起人們的關注。對于這種菌,Fakas (Fakas, Certik et al2008)等用番爺水解廢洛培養它，結果生物量達 17.6g/L, GLA 達 800mg/L。Gema (Gema, Kavadia et al2002)等在 C/N 比為 163 的培養基中培養霉菌，最高GLA產量為720mg/L。Fakas (Fakas, Certik et al2008)等人以木糖為碳源培養小克銀漢霉，油脂產量為6.7g/L，GLA量為1119mg/L。盡管在前人的研究基礎上GLA的產量已有所提高，但僅局限在培養基的優化上，幾乎沒有關注到溫度對小克銀漢霉油脂積累和GLA合成的影響，若要滿足工業化生產的需求，還需要進一步提高GLA的產量，降低生產成本。
[0004]申請號為201210167671.8的中國專利公開了一種Y -亞麻酸的制備方法，提供一種用于提高GLA產量的Y -亞麻酸的制備方法。以刺孢小克銀漢霉菌(Cunninghamellaechinulata ATCC7929)為出發菌株，以葡萄糖、蔗糖、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、檸檬酸三鈉、檸檬酸、玉米漿作為培養基的主要原料用于培養菌株，通過添加不同種類不同濃度維生素，發酵生產Y-亞麻酸，Y-亞麻酸較對照組提高近一倍。采用接種時添加不同濃度不同種類的維生素的方法，發酵生產Y-亞麻酸，Y-亞麻酸產量較傳統方法提高一倍以上，具有操作簡單、成本低、設備要求低，效果佳等優勢。但該專利申請是局限在培養基的優化上，幾乎沒有關注到溫度對小克銀漢霉油脂積累和GLA合成的影響。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于提供采用小克銀漢霉菌(Cunninghamella echinulataATCC7929)產Y-亞麻酸，可顯著提高Y-亞麻酸產量的一種通過溫度轉換發酵生產含亞麻酸油脂的方法。
[0006]本發明包括以下步驟:
[0007]1)菌種篩選:將冷藏貯存小克銀漢霉菌(匕6011111111^8 ^1007929)接種于？0八平板培養基中，于20~401培養1~4山再從？0八平板培養基中，將菌絲形態與長勢較優的菌塊接種于新？0八平板培養基中，于20~401再培養1~4山然后冷藏貯存備用；[0008]2)菌種活化培養:將冷藏貯存備用的新？0八平板培養基上的菌塊接種于另一新的 八平板培養基中，于20~401培養1~4山觀察菌落形態；
[0009]3)搖瓶種子培養:將步驟2)中所述另一新的？0八平板培養基上的菌塊接種于裝有種子培養基的搖瓶中，邱值調至5~7，于20~301，以100~250印111培養1~3山得搖瓶種子；
[0010]4)搖瓶發酵培養:將步驟3)所得搖瓶種子接種于裝有發酵培養基的搖瓶中，邱值調至5~7，先于30~401培養6~8山轉速為100~250卬111，再于10~201培養4~6(1，轉速為100~25011)111，得發酵液；
[0011]5)將步驟4)所得發酵液抽濾，以去離子水潤洗，得濕菌體，將濕菌體烘干、研磨、萃取，得到含亞麻酸油脂。
[0012]在步驟1)中，所述？0八平板培養基的組成為馬鈴薯浸提液2008/1，葡萄糖208/1，瓊脂15~208/1，自然邱值。
[0013]在步驟3)中，所述種子培養基的組成為葡萄糖808/1，尿素68凡，硫酸銨58凡，酵母粉1&/[，磷酸二氫鉀5^/匕硫酸鎂1&/[，生物素0.061118/1，滅菌前邱值為6。
[0014]在步驟4)中，所述發酵培養基的組成為葡糖糖1008/1，蛋白胨68凡，酵母粉58凡，硝酸鈉28/1，磷酸二氫鉀38/1，硫酸鎂0.5^/1,滅菌前邱值為6.5。
[0015]為了測量含V-亞麻酸油脂中的亞麻酸含量，可將含亞麻酸油脂甲酯化，再采用氣相色譜儀測定其中V-亞麻酸的含量。
[0016]與現有技術比較，本發明的有益效果如下:
[0017]本發明采用小克銀漢霉菌一吐丨皿匕仏八1(^7929)生產含V-亞麻酸油脂，最終V-亞麻酸產量可達1200~14001^/1。本發明通過發酵溫度轉化，在發酵前期升高發酵溫度以促進菌體生物量的積累，先于30~401培養6~8山轉速為100~250印111，發酵后期降低發酵溫度，再于10~201培養4~6山轉速為100~250印！11，以促進不飽和脂肪酸和亞麻酸合成。該發酵工藝生產含V-亞麻酸油脂，可以有效提高不飽和脂肪酸和
V-亞麻酸的產量，能夠在較短發酵周期內實現、-亞麻酸的高產量積累，生產成本低，生產工藝簡單，具有很大的應用前景，有利于工業化應用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為本發明實施例1小克銀漢霉菌((:.在前期發酵培養溫度371，后期發酵培養溫度141的條件下，生產含亞麻酸油脂的過程曲線圖。在圖1中，橫坐標為時間111116 00，左縱坐標為殘糖量0681(11^1 811^8 (標記為籲)，第一右縱坐標為菌體生物量8101112188(標記為圖)，第二右縱坐標為油脂產量[11)1(1(標記為女)，第三右縱坐標為
V~亞麻酸產量(標記為,)。【具體實施方式】
[0019]實施例1
[0020]1)菌種篩選:將貯存于41冰箱中的菌絲形態有所差異的小克銀漢霉菌(0.6011111111^8八1(^7929)取出，分別用接種鏟割取1(31112的菌塊接種到？0八平板上，于281培養4(1，從？0八平板中割取1(31112的菌塊接種到新的？0八平板上，于281培養2山于代冰箱中貯存備用。？0八平板培養基組成為馬鈴薯浸提液2008/1，葡萄糖208/1，瓊脂15~20^/[，自然邱。
[0021]2)菌種活化培養:將步驟1)中的？0八平板，用接種鏟割取1挪2的菌塊接種于新的？0八平板上，于281培養2山觀察菌落形態。
[0022]3)搖瓶種子培養:將步驟2)中的？0八平板，用接種鏟割取4個1挪2的菌塊接種于裝有501111種子培養基的2501111搖瓶中，邱值調至6.0，于281，以15011)111^^2(1。種子培養基組成為葡萄糖808/1，尿素68/1，硫酸銨58/1，酵母粉18凡，磷酸二氫鉀58凡，硫酸鎂1^/[，生物素0.061118/1，滅菌前邱值6，得搖瓶種子。[0023]4)搖瓶發酵培養:將步驟3)中得到的搖瓶種子，以10%的接種量接種于裝有10001發酵培養基的50001搖瓶中，邱值調至6.5，前期發酵溫度為371，以150印111培養7山然后繼續發酵，后期發酵溫度為141，以150印！11培養5(1 ；發酵培養基組成為葡萄糖1008凡，蛋白胨叱/1，酵母粉如/1，硝酸鈉28/1，磷酸二氫鉀38/1，硫酸鎂0.58凡，滅菌前邱值6.5。
[0024]5)將步驟4)所得發酵液抽濾，以去離子水潤洗，得濕菌體，將濕菌體烘干、研磨、萃取，得到含亞麻酸油脂。
[0025]為了測量含V-亞麻酸油脂中的亞麻酸含量，可將含亞麻酸油脂甲酯化，再采用氣相色譜儀測定其中V-亞麻酸的含量。
[0026]檢測條件 161^78904 氣相色譜儀，!25臟。程序升溫:初始溫度1401^，保持5111111 ；然后4。0 /111111升溫，升到2401^，保持10111111。載氣:氮氣，2001/8。檢測器溫度:2601。進樣口溫度:2601。進樣量:1^匕分流比為100: 1。
[0027]經氣相色譜儀測定，無脂生物量可達24.68/1，含V -亞麻酸油脂中V -亞麻酸含量可達1322.8^/1 (發酵過程曲線如圖0。采用本發明所述含V-亞麻酸油脂制備方法，所得的V-亞麻酸產量可顯著提高。
[0028]實施例2
[0029]與實施例1類似，區別僅在于，步驟4)中所述前期發酵溫度為301，后期發酵溫度為101，所得的含亞麻酸油脂中V-亞麻酸的含量為1409.01^/1。
[0030]實施例3
[0031]與實施例1類似，區別僅在于，步驟4)中所述前期發酵溫度為401，后期發酵溫度為201，所得的含亞麻酸油脂中V-亞麻酸的含量為1207』呢凡。
[0032]實施例4
[0033]與實施例1類似，區別僅在于，步驟4)中所述前期發酵溫度為401，后期發酵溫度為101，所得的含亞麻酸油脂中V-亞麻酸的含量為1508』呢凡。
[0034]實施例5
[0035]與實施例1類似，區別僅在于，步驟4)中所述前期發酵溫度為301，后期發酵溫度為201，所得的含亞麻酸油脂中V-亞麻酸的含量為1085』呢凡。[0036]有關小克銀漢霉菌(C.echinulata ATCC7929)參見:
[0037]//www.atcc.0rg/Search_Results.aspx?dsNav=Ntk:PrimarySearch%7cCunninghamella+echinulata+ATCC+7929%7c3%7c，Ny:True, Ro:10，N:1000552&searchTerms=Cunninghamella+echinulata+ATCC+7929&redir=l 或 //www.atcc.0rg/en/Products/All/7929, aspxo
【權利要求】
1.一種通過溫度轉換發酵生產含V-亞麻酸油脂的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)菌種篩選:將冷藏貯存小克銀漢霉菌(匕6011111111^8^1007929)接種于？0八平板培養基中，于20~401培養1~4山再從？0八平板培養基中，將菌絲形態與長勢較優的菌塊接種于新？0八平板培養基中，于20~401再培養1~4山然后冷藏貯存備用； 2)菌種活化培養:將冷藏貯存備用的新？0八平板培養基上的菌塊接種于另一新的？0八平板培養基中，于20~401培養1~4山觀察菌落形態； 3)搖瓶種子培養:將步驟2)中所述另一新的？0八平板培養基上的菌塊接種于裝有種子培養基的搖瓶中，邱值調至5~7，于20~301，以100~250印111培養1~3山得搖瓶種子； 4)搖瓶發酵培養:將步驟3)所得搖瓶種子接種于裝有發酵培養基的搖瓶中，值調至5~7，先于30~401培養6~8山轉速為100~250^,，再于10~201培養4~6山轉速為100~250印111，得發酵液； 5)將步驟4)所得發酵液抽濾，以去離子水潤洗，得濕菌體，將濕菌體烘干、研磨、萃取，得到含亞麻酸油脂。
2.如權利要求1所述一種通過溫度轉換發酵生產含V-亞麻酸油脂的方法，其特征在于，在步驟1)中，所述？0八平板培養基的組成為馬鈴薯浸提液2008/1，葡萄糖208/1，瓊脂15~208/1，自然邱值。
3.如權利要求1所述一種通過溫度轉換發酵生產含V-亞麻酸油脂的方法，其特征在于，在步驟3)中，所述種子培養基的組成為葡萄糖808/1，尿素68/1，硫酸銨58/1，酵母粉1^/[，磷酸二氫鉀5^/匕硫酸鎂1&/[，生物素0.061118/1，滅菌前邱值為6。
4.如權利要求1所述一種通過溫度轉換發酵生產含V-亞麻酸油脂的方法，其特征在于，在步驟4)中，所述發酵培養基的組成為葡糖糖1008/1，蛋白胨叱/1，酵母粉如/1，硝酸鈉28/1，磷酸二氫鉀38/1，硫酸鎂0.58/1，滅菌前邱值為6.5。
【文檔編號】C12R1/645GK103834698SQ201410113472
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月25日 優先權日:2014年3月25日
【發明者】敬科舉, 胡超群, 吳意珣, 盧英華 申請人:廈門大學