一種淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT、其編碼的氨基酸序列以及克隆方法
【專利摘要】本發明涉及一種淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT、其編碼的氨基酸序列以及克隆方法。通過模板制備、引物設計、PCR擴增、公司測序等過程，獲得了該基因的完整cDNA序列，其核苷酸序列具有177bp，編碼的氨基酸序列具有58個氨基酸殘基。研究淡水小龍蝦的金屬硫蛋白基因有助于進一步了解無脊椎動物對抗重金屬離子脅迫的機制，以及解決目前水體環境重金屬污染帶來的養殖問題。
【專利說明】一種淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT、其編碼的氨基酸序列以及克隆方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT、其編碼的氨基酸序列以及克隆方法，屬于分子生物學【技術領域】。
【背景技術】
[0002]無脊椎動物的免疫系統與脊椎動物的獲得性免疫系統不同，被稱為先天免疫系統。因此，無脊椎動物防御病原微生物入侵的免疫系統，都是源于自身遺傳繼承的固定的免疫模式，主要包括物理屏障、細胞免疫和體液免疫。當病原微生物入侵的時候，無脊椎動物首先是通過自己的體表以及消化道來進行物理防御，通過一個天然的物理屏障來阻擋病原微生物的侵染，但是，當特異的病原微生物通過這層物理屏障之后，進入到宿主體內的時候，就會激發宿主自身的細胞免疫與體液免疫作用，而且，這兩種免疫形式幾乎是同時發揮功能的。如果入侵的病原微生物體積較小，那么，宿主會通過細胞免疫中的吞噬作用來將其吞噬，從而達到清除的目的。當入侵的病原微生物體積較小，但是，數目較多的情況下，宿主就會通過細胞免疫中結節的形成以及包囊作用，將其大規模清除。當入侵的病原微生物體積較大的時候，宿主就會啟動體液免疫相關的黑化作用，將其固定并且瓦解，從而達到清除的目的。此外，體液免疫還包括宿主細胞表面存在的模式受體介導的信號傳導途徑關聯的抗菌肽的產生。通過物理屏障、細胞免疫和體液免疫三種形式的免疫作用，無脊椎動物防范著病原微生物的入侵。
[0003]除了病原微生物的侵染是無脊椎動物生存環境中需要面對的強大危險源之外，水產類的無脊椎動物(以 十足目中的甲殼類動物為例)生存環境中的重金屬離子也是一個較為危險的刺激源。重金屬離子對于甲殼類動物的脅迫作用主要是通過重金屬離子在宿主體內的多個器官的積累，造成器官功能的喪失，從而使宿主死亡。同樣，在這樣的環境中生存的甲殼類動物體內也存在著一些可以對抗這樣的刺激的基因與蛋白質，研究表明金屬硫蛋白基因就是小龍蝦體內存在的一個可以對抗重金屬脅迫的免疫基因。金屬硫蛋白基因是一類結構較為保守的基因，廣泛存在于低等的無脊椎動物體內，其表達的產物是金屬硫蛋白分子，這一類蛋白質的顯著特點就是分子中富含半胱氨酸殘基，這樣就造成了對于金屬離子具有較為強烈的親和性，因此，金屬硫蛋白分子的作用就是可以結合宿主體內的金屬與重金屬離子，從而達到清除金屬與重金屬離子的作用。目前，相關的體外試驗研究結果顯示，金屬硫蛋白具有抗輻射、抗衰老、抗重金屬中毒、清除自由基、提高機體的免疫能力、提高機體的應急能力、調節機體微量元素平衡的作用。
[0004]淡水小龍蝦是我國主要的水產養殖品種之一，隨著工業現代化發展的加快，出現了水體環境被頻繁污染的情況，淡水小龍蝦體內積累超量的金屬離子甚至重金屬離子，一方面會造成淡水小龍蝦養殖業在經濟方面的損失，另一方面會給相關消費者帶了身體健康方面的隱患。因此，研究淡水小龍蝦的金屬硫蛋白基因有助于進一步了解無脊椎動物對抗重金屬離子脅迫的機制，以及解決目前水體環境重金屬污染帶來的養殖問題。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT的核苷酸序列，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1，具有177bp。
[0006]本發明的另一個目的在于提供一種淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT編碼的氨基酸序列，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2，具有58個氨基酸殘基。
[0007]同時，本發明還提供該淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT的克隆方法。 [0008]本發明所提供的金屬硫蛋白基因Pc-MT來源于淡水小龍奸(Procambarusclarkii)，命名為Pc-MT基因，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1，具有177bp。
[0009]上述金屬硫蛋白基因Pc-MT編碼的蛋白質來源于淡水小龍蟲下(Procambarusclarkii)，命名為Pc-MT蛋白質，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2，具有58個氨基酸殘基。
[0010]上述淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT的克隆方法，包括如下步驟:
[0011](I)選用淡水小龍蝦作為實驗材料，利用動物總RNA提取試劑盒提取各組織總RNA,獲得淡水小龍蝦各個組織的總RNA樣品；
[0012](2)以步驟(1)獲得的總RNA樣品作為模板，利用一步法RT-PCR擴增試劑盒進行cDNA的反轉錄合成，獲得淡水小龍蝦各個組織的cDNA樣品；
[0013](3)設計擴增淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT編碼區的前后引物Pc-MT-F和Pc-MT-R:
[0014]Pc-MT-F: 5' -TACTCAGAATTCATGCCGGGTCCCTGTTGTA-3'
[0015]Pc-MT-R: 5' ~TACTCACTCGAGCTAGGGACAGCACTTGCAG~3'
[0016]以步驟(2)中的淡水小龍蝦各個組織的cDNA樣品作為模板，進行PCR擴增反應，反應的程序為:94°C預變性3min，94°C變性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s，循環35圈，后延伸5min，獲得PCR反應產物；
[0017](4)將步驟(3)獲得的PCR反應產物進行回收、純化，之后進行EcoR I和Xho I核酸內切酶雙酶切，并且與經過EcoR I和Xho I核酸內切酶雙酶切處理的pET-28a載體連接，轉化大腸桿菌DH5 α克隆菌株感受態細胞之后，進行菌落PCR篩選，將篩選得到的陽性克隆子送測序公司進行序列測定，獲得淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT的基因序列。
[0018](5)將步驟(4)獲得的基因序列，利用分子生物學Expasy在線軟件(//au.expasy.0rg)進行氨基酸序列的翻譯,獲得對應蛋白質的氨基酸序列。
[0019]本發明的優點:
[0020]本發明涉及一種淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT、其編碼的氨基酸序列以及克隆方法。該基因在淡水小龍蝦體內過量表達可以提高淡水小龍蝦先天免疫系統中金屬硫蛋白的表達量，從而可以提高淡水小龍蝦對抗生存的水體環境中重金屬離子的能力，提高繁殖與生存能力。
【具體實施方式】
[0021]下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細的描述
[0022]實施例1淡水小龍蝦肝胰腺組織中金屬硫蛋白基因Pc-MT的克隆
[0023](I)選用淡水小龍蝦肝胰腺組織作為實驗材料，利用上海生工生物工程有限公司提供的Total RNA Extractor (Trizol)動物總RNA快速抽提試劑盒進行總RNA的提取，獲得淡水小龍蝦肝胰腺組織的總RNA樣品；
[0024](2)以步驟(1)獲得的淡水小龍蝦肝胰腺組織的總RNA樣品作為模板，利用上海生工生物工程有限公司提供的一步法RT-PCR擴增試劑盒進行cDNA的反轉錄合成，獲得淡水小龍蝦肝胰腺組織的cDNA樣品；
[0025](3)設計擴增淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT編碼區的前后引物Pc-MT-F和Pc-MT-R:
[0026]Pc-MT-F:5/ -TACTCAGAATTCATGCCGGGTCCCTGTTGTA-3;
[0027]Pc-MT-R: 5' -TACTCACTCGAGCTAGGGACAGCACTTGCAG-3'
[0028]以步驟(2)中的淡水小龍蝦肝胰腺組織的cDNA樣品作為模板，進行PCR擴增反應，反應的程序為:94°C預變性3min，94°C變性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s，循環35圈，后延伸5min，獲得PCR反應產物；
[0029](4)將步驟(3)獲得的PCR反應產物進行回收、純化，之后進行EcoR I和Xho I核酸內切酶雙酶切，并且與經過EcoR I和Xho I核酸內切酶雙酶切處理的pET-28a載體連接，轉化大腸桿菌DH5 α克隆菌株感受態細胞之后，進行菌落PCR篩選，將篩選得到的陽性克隆子送測序公司進行序列測定，獲得淡水小龍蝦肝胰腺組織中金屬硫蛋白基因Pc-MT的基因序列。
[0030](5)將步驟(4)獲得的基因序列，利用分子生物學Expasy在線軟件(//au.expasy.0rg)進行氨基酸序列的翻譯,獲得對應蛋白質的氨基酸序列。
[0031]實施例2淡水小龍蝦血淋巴組織中金屬硫蛋白基因Pc-MT的克隆
[0032]( I)選用淡水小龍蝦作為實驗材料，利用淡水小龍蝦血淋巴抗凝劑作為佐劑，使用醫用注射器從淡水小龍蝦腹節中部抽取血淋巴組織液，利用上海生工生物工程有限公司提供的Total RNA Extractor (Trizol)動物總RNA快速抽提試劑盒進行總RNA的提取，獲得淡水小龍蝦血淋巴組織的總RNA樣品；
[0033](2)以步驟(1)獲得的淡水小龍蝦血淋巴組織的總RNA樣品作為模板，利用上海生工生物工程有限公司提供的一步法RT-PCR擴增試劑盒進行cDNA的反轉錄合成，獲得淡水小龍蝦血淋巴組織的cDNA樣品；
[0034](3)設計擴增淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT編碼區的前后引物Pc-MT-F和Pc-MT-R:
[0035]Pc-MT-F:5/ -TACTCAGAATTCATGCCGGGTCCCTGTTGTA-3;
[0036]Pc-MT-R: 5' -TACTCACTCGAGCTAGGGACAGCACTTGCAG-3'
[0037]以步驟(2)中的淡水小龍蝦血淋巴組織的cDNA樣品作為模板，進行PCR擴增反應，反應的程序為:94°C預變性3min，94°C變性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s，循環35圈，后延伸5min，獲得PCR反應產物；
[0038](4)將步驟(3)獲得的PCR反應產物進行回收、純化，之后進行EcoR I核酸內切酶和Xho I核酸內切酶的雙酶切處理，并且與經過EcoR I核酸內切酶和Xho I核酸內切酶雙酶切處理的pET_28a載體連接，轉化大腸桿菌DH5 α克隆菌株感受態細胞之后，進行菌落PCR篩選，將篩選得到的陽性克隆子·送測序公司進行序列測定，獲得淡水小龍蝦血淋巴組織中金屬硫蛋白基因Pc-MT的基因序列。[0039](5)將步驟(4)獲得的基因序列，利用分子生物學Expasy在線軟件(//au.expasy.0rg)進行氨基酸序列的翻譯,獲得對應蛋白質的氨基酸序列。
[0040]實施例3淡水小龍蝦腮組織中金屬硫蛋白基因Pc-MT的克隆
[0041](I)選用淡水小龍蝦腮組織作為實驗材料，利用上海生工生物工程有限公司提供的Total RNA Extractor (Trizol)動物總RNA快速抽提試劑盒進行總RNA的提取，獲得淡水小龍蝦腮組織的總RNA樣品；
[0042](2)以步驟(1)獲得的淡水小龍蝦腮組織的總RNA樣品作為模板，利用上海生工生物工程有限公司提供的一步法RT-PCR擴增試劑盒進行cDNA的反轉錄合成，獲得淡水小龍蝦腮組織的cDNA樣品；
[0043](3)設計擴增淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT編碼區的前后引物Pc-MT-F和Pc-MT-R:
[0044]Pc-MT-F:5/ -TACTCAGAATTCATGCCGGGTCCCTGTTGTA-3;
[0045]Pc-MT-R: 5' -TACTCACTCGAGCTAGGGACAGCACTTGCAG-3'
[0046]以步驟(2)中的淡水小龍蝦腮組織的cDNA樣品作為模板，進行PCR擴增反應，反應的程序為:94°C預變性3min，94°C變性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s，循環35圈，后延伸5min，獲得PCR反應產物；
[0047](4)將步驟(3)獲得 的PCR反應產物進行回收、純化，之后進行EcoR I核酸內切酶和Xho I核酸內切酶的雙酶切處理，并且與經過EcoR I核酸內切酶和Xho I核酸內切酶雙酶切處理的pET_28a載體連接，轉化大腸桿菌DH5 α克隆菌株感受態細胞之后，進行菌落PCR篩選，將篩選得到的陽性克隆子送測序公司進行序列測定，獲得淡水小龍蝦腮組織中金屬硫蛋白基因Pc-MT的基因序列。
[0048](5)將步驟(4)獲得的基因序列，利用分子生物學Expasy在線軟件(//au.expasy.0rg)進行氨基酸序列的翻譯,獲得對應蛋白質的氨基酸序列。
[0049]序列表
[0050]SEQ ID N0.1
[0051]內蒙古科技大學
[0052]一種淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT、其編碼的氨基酸序列以及克隆方法
[0053]2013-10-22
[0054]2
[0055]I
[0056]177
[0057]cDNA
[0058]淡水小龍蝦
[0059]淡水小龍蟲下金屬硫蛋白基因
[0060](1)...(177)
[0061 ] atgccgggtccctgttgtaaagacaagtgcgagtgtgccgagggcgggtgcaagactggc 60
[0062]tgtgtgtgcacctcatgccgctgtgcacgctgcgacaagtgtacgtcgcggtgcaagtgt 120
[0063]ccatccagggaggagtgtgccgagacctgctccaagccctgcaagtgctgtccctag 177
[0064]SEQ ID N0.2[0065]2
[0066]58
[0067]PRT
[0068]淡水小龍蝦金屬硫蛋白
[0069](1)...(58)
[0070]MPGPCCKDVCECAEGGCKTQCVCTSCRCAP
[0071]0
[0072]CDKCTSGCKCPSKEECAKTCSKPCRCCP
[0073]358 。`
【權利要求】
1.一種淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT，其特征在于，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1。
2.根據權利要求1所述的一種淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT，其特征在于，淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT編碼的蛋白質對應的氨基酸序列為SEQ ID N0.2。
3.—種權利要求1所述的淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT的克隆方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)選用淡水小龍蝦作為實驗材料，利用動物總RNA提取試劑盒提取各組織總RNA，獲得淡水小龍蝦各個組織的總RNA樣品； (2)以步驟(1)獲得的總RNA樣品作為模板，利用一步法RT-PCR擴增試劑盒進行cDNA的反轉錄合成，獲得淡水小龍蝦各個組織的cDNA樣品； (3 )設計擴增淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT編碼區的前后引物Pc-MT-F和Pc-MT-R:
Pc-MT-F: 5' -TACTCAGAATTCATGCCGGGTCCCTGTTGTA-3'
Pc-MT-R: 5' -TACTCACTCGAGCTAGGGACAGCACTTGCAG-3' 以步驟(2)中的淡水小龍蝦各個組織的cDNA樣品作為模板，進行PCR擴增反應，反應的程序為:94°C預變性3min，94°C變性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s，循環35圈，后延伸5min，獲得PCR反應產 物； (4)將步驟(3)獲得的PCR反應產物進行回收、純化，之后進行EcoRI核酸內切酶和Xho I核酸內切酶的雙酶切處理，并且與經過EcoR I核酸內切酶和Xho I核酸內切酶雙酶切處理的pET_28a大腸桿菌質粒載體連接，轉化大腸桿菌DH5 α克隆菌株感受態細胞之后，進行菌落PCR篩選，將篩選得到的陽性克隆子送測序公司進行序列測定，獲得淡水小龍蟲下金屬硫蛋白基因Pc-MT基因序列。 (5)將步驟(4)獲得的基因序列，利用分子生物學Expasy在線軟件(//au.expasy.0rg)進行氨基酸序列的翻譯,獲得對應蛋白質的氨基酸序列。
【文檔編號】C12N15/10GK103667302SQ201310534813
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月4日 優先權日:2013年11月4日
【發明者】杜志強, 李新蒼, 任乾 申請人:內蒙古科技大學