應用rpa技術對轉基因水稻華恢1號品系特異性鑒定的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種適用于重組酶聚合酶等溫擴增技術（RecombinasePloymeraseAmplification,RPA）鑒定含有轉基因抗蟲水稻華恢1號（TT51-1）的引物及探針組合，其正向引物序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示，探針序列如SEQIDNo.3所示。同時，本發明還公開了一種鑒定含有轉基因抗蟲水稻TT51-1的方法：提取待測樣品的DNA作為模板，利用所述的引物進行RPA快速擴增及實時熒光檢測，如果得到明顯的擴增曲線，則證明所檢樣品中含有轉基因抗蟲水稻TT51-1的成分。本發明首次提供轉基因抗蟲水稻TT51-1品系特異性的RPA檢測方法。
【專利說明】應用RPA技術對轉基因水稻華恢1號品系特異性鑒定
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】,涉及應用重組酶聚合酶等溫擴增技術(RecombinasePloymerase Amplification, RPA)技術鑒定轉基因抗蟲水稻華恢I號(TT51-1)的品系特異性方法。
【背景技術】
[0002]目前DNA擴增是核酸檢測的主要方法，常用的PCR檢測需要精密的儀器以及繁瑣的試驗程序，難以滿足非實驗室環境下現場檢測的要求。近年來，核酸恒溫擴增技術得到了長足的發展，與傳統PCR相比核酸恒溫擴增技術不需要昂貴的PCR儀，可在短時間內快速擴增出目的片段，具有簡便，快速，靈敏等優點。RPA技術是模擬生物體內DNA復制、基于重組酶聚合酶介導的擴增原理發展而來，利用重組酶和引物形成微絲在模板DNA上搜索到與之完全互補的序列時，在單鏈DNA結合蛋白的幫助下，使模板DNA解鏈，引物與模板DNA開始配對形成復制所需自由的3’羥基末端，在DNA聚合酶的作用下進行復制延伸，形成新的DNA互補鏈反應產物也是以指數級增長。與常規PCR反應不同，RPA反應所需引物長度通常為30-35nt。引物設計時為了避免形成引物內部及之間的二級結構，其長度的增加也使引物設計及選擇難度增加，引物序列的設計與選擇對RPA的結果至關重要。在RPA擴增體系中加入一個熒光標記的探針便可實現模板擴增的實時監測，該探針中部兩個T堿基上各標記一個熒光集團(FAM和BHQ1)，在兩個集團之間有一個脫堿基位點(dSpacer)，該位點可被一種來自大腸桿菌的核酸外切酶識別，該酶具有3’ -5’外切酶活性，可以使兩個熒光集團分離，從而使熒光信號與擴增產物的累積相同步。結合一個便攜式的熒光擴增檢測儀便可在10-20分鐘內檢測到 熒光曲線。RPA技術極大地縮短了檢測時間，簡化了反應程序，與DNA快速提取技術相結合使野外檢測成為可能，具有廣泛的應用前景。
[0003]PCR技術對轉基因產品檢測的方法有篩選檢測，基因特異性檢測，構建特異性檢測和轉化體特異性檢測。由于外源基因在受體基因組插入位點的唯一性特征，因此根據外源插入DNA序列與水稻基因組的連接區域設計RPA引物進行檢測具有很高的特異性，可特異性地檢測該轉化體及其衍生品系。
[0004]2009年8月農業部發放了轉基因抗蟲水稻TT51-1在湖北省的安全證書，引起公眾對其安全性的廣泛關注。目前我國尚未批準TT51-1的商業化種植，但其擴散情況時有發生，迫切需要建立快速簡便檢測方法，用于市場監管和例行監測。
[0005]目前，已報道的轉基因植物檢測方法中，主要是利用PCR儀在實驗室中進行常規的檢測，該方法還不能進一步滿足轉基因產品的快速檢測。國內外目前還沒有利用RPA技術對轉基因水稻華恢I號(TT51-1)做品系特異性鑒定。

【發明內容】

[0006]針對上述領域的空白，本發明提供了準確、快速、簡便檢測轉基因水稻華恢I號(TT51-1)品系特異性的RPA檢測方法。[0007]本發明提供的技術方案是:一種用于通過重組酶聚合酶等溫擴增技術鑒定含有轉基因抗蟲水稻華恢I號(TT51-1)的引物，其正向引物序列如SEQ ID N0.1所示，反向引物序列如SEQ ID N0.2所示,探針序列如SEQ ID N0.3所示。
[0008]本發明還提供一種通過重組酶聚合酶等溫擴增技術鑒定含有轉基因抗蟲水稻華恢I號的試劑盒，該試劑盒包含上述的引物和探針。
[0009]本發明還提供一種通過重組酶聚合酶等溫擴增技術鑒定含有轉基因抗蟲水稻TT51-1的方法:提取待測樣品的DNA作為模板，利用權利要求1所述的引物進行熒光快速檢測，如果得到明顯的擴增曲線，則證明所檢樣品為轉基因抗蟲水稻華恢I號。實施步驟為:向RPA擴增試劑盒推薦反應的50mL擴增體系中加入引物各2mL(10mmol/L)，探針0.5mL(lOmmol/L)，模板DNA 50ng。RPA擴增檢測儀(或熒光定量PCR儀)39攝氏度反應15分鐘。
[0010]本發明方法是根據外源插入DNA序列與水稻基因組的連接區域設計大量RPA特異性引物，從中篩選出一套可快速有效檢測出轉基因水稻華恢I號(TT51-1)成分的引物及探針組合。利用該對引物進行熒光快速檢測，以轉基因水稻華恢I號(TT51-1)基因組DNA為模板可以得到 明顯的擴增曲線，而非轉基因水稻明恢63和其他轉基因水稻品系科豐6號等3種水稻材料的基因組DNA為模板擴增均沒有擴增曲線。將模板用水稀釋至2000，400, 200, 100, 20個拷貝，結果都有擴增曲線，該方法具有較高的靈敏度，本發明首次提供轉基因抗蟲水稻華恢I號(TT51-1)品系特異性的RPA檢測方法。該方法使生物技術產品在準確、快速檢測方面的能力得到提高。
[0011]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為TT51-1特異性檢測圖，其中，1:轉基因水稻TT51-1 ；2:轉基因水稻科豐6號；3:轉基因水稻克螟稻I ;4:非轉基因水稻明恢63 ；5:水
圖2為靈敏度試驗圖，從I到6模板拷貝數依次為2000 ；400 ；200 ；100 ；20 ；0
【具體實施方式】
[0013]下面通過【具體實施方式】的詳細描述來進一步闡明本發明，但并不是對本發明的限制，僅僅作示例說明。
[0014]下面實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等的《分子克隆:實驗室手冊》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中所述條件，或按照儀器或試劑制造廠商所建議的條件。
[0015]首先，設計引物:根據TT51-1轉化體特異序列(GenBank N0.EU880444)設計引物，和探針。RPA對引物長度要求為30-35nt，這就容易導致在恒溫條件下產生大量的引物二聚體從而影響實驗效果，RPA實驗需要從靶標序列兩端設計多對引物進行優化，篩選，個別堿基的替換或增減都會對實驗結果產生重要影響。本實驗中設計了大量的引物，并從中篩選出了一對靈敏度高且特異性好的引物用于RPA熒光檢測，引物和探針序列見SEQ IDN0.1，SEQ ID N0.2 和 SEQ ID N0.3 (表 I)。
【權利要求】
1.一種用于通過重組酶聚合酶等溫擴增技術鑒定含有轉基因抗蟲水稻華恢I號的引物和探針組合，其特征在于:其正向引物序列如SEQ ID N0.1所示，反向引物序列如SEQ IDN0.2所示,探針序列如SEQ ID N0.3所示。
2.一種鑒定含有轉基因抗蟲水稻華恢I號的試劑盒，其特征在于:該試劑盒包含權利要求I所述的引物和探針組合。
3.—種通過重組酶聚合酶等溫擴增技術鑒定含有轉基因抗蟲水稻華恢I號的方法，其特征在于:提取待測樣品的DNA作為模板，利用權利要求1所述的引物及探針組合進行快速擴增及實時熒光檢測，如果得到明顯的擴增曲線，則證明所檢樣品含有轉基因抗蟲水稻華恢I號成分。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于: 向RPA擴增試劑盒推薦反應的50mL擴增體系中加入10mmol/L的引物各2mL, IOmmol/L的探針0.5mL,模板 DNA 50ng ； 擴增程序為:RPA擴增檢測儀或熒光定量PCR儀于39攝氏度反應15分鐘。
【文檔編號】C12N15/11GK103451292SQ201310391525
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月2日 優先權日:2013年9月2日
【發明者】金蕪軍, 宛煜嵩, 徐潮, 苗朝華, 張秀杰, 黃衛紅 申請人:中國農業科學院生物技術研究所