專利名稱：一種利用天津短桿菌和植物乳桿菌混合發酵高產gaba的方法
技術領域：
一種利用安全高效的天津短桿菌和植物乳桿菌混合發酵高產GABA的方法，屬于發酵工程和酶工程領域。
背景技術：
Y-氨基丁酸(GABA)是天然存在于某些生物體的非蛋白質氨基酸，是哺乳動物中樞神經系統重要的抑制性神經遞質，在食品、飼料、醫藥等領域具有廣泛的應用。Y-氨基丁酸具有抗焦慮、降血壓、鎮定安神、增強記憶、調節激素分泌、促進生殖、利尿，鎮痛等生理功倉泛。Y-氨基丁酸的制備主要通過化學合成法和生物法。其中生物法又包括植物富集法和微生物發酵法。化學法主要是通過鄰苯二甲酞亞氨鉀和Y-氯丁氰在強烈條件下(180°c )反應，然后產物與濃硫酸水解得到；另一種方法是以吡咯烷酮作為原料，經氫氧化鈣、碳酸氫銨水解制得Y-氨基丁酸。總體而言，化學合成法雖然具有反應迅速的優點，但是反應條件苛刻、能耗大、成本高、得率低，反應條件劇烈，污染嚴重，存在著一定的安全隱患。植物富集主要是利用內源性谷氨酸脫羧酶(EC4.1.1.15)催化谷氨酸制備Y-氨基丁酸。這是植物組織對外界條件的應激反應。這些外界應激條件包括溫度、壓力、研磨、破碎、酸堿性以及鈣離子濃度和氧濃度等。植物富集Y-氨基丁酸雖然制備工藝簡單，環境副作用小，但是植物富集Y-氨基丁酸含量較低，不適于規模化生產Y-氨基丁酸。目前，Y-氨基丁酸的生產主要是微生物發酵法，通過微生物中的谷氨酸脫羧酶催化L-谷氨酸的α-羧 基脫羧來生產Y-氨基丁酸。谷氨酸脫羧酶是作用于這一過程的唯一酶，已經在細菌、古生菌和真菌微生物中發現了谷氨酸脫羧酶的存在。微生物發酵法是以谷氨酸或其鈉鹽或含谷氨酸的物質為原料，利用酵母菌、乳酸菌和曲霉菌等食品安全級微生物發酵制得，具有良好的開發前景。利用微生物將谷氨酸脫羧轉化成Y-氨基丁酸具有高度專一性，且發酵法反應條件溫和、反應速率快、設備簡單、公害少、安全、成本較低等優點。利用微生物轉化合成Y-氨基丁酸的研究并將其產業化具有現實需求性。傳統的微生物發酵需要添加外源的谷氨酸或谷氨酸鈉鹽作為底物，而谷氨酸也是需要以糖質為原料經微生物發酵，采用等電點提取加上離子交換樹脂分離的方法而制得。所以添加外源谷氨酸為底物在一定程度上增加了 Y-氨基丁酸的制備成本。天津短桿菌SW07-1是一株谷氨酸生產菌的變異株，保存于江南大學生物工程學院(《生物加工過程》，2009年第7卷第6期74-78頁)。該菌株缺少Y -氨基丁酸合成途徑，但能高效轉化葡萄糖為谷氨酸。另外，本研究室前期經誘變篩選獲得一株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)GB01-21(中國典型培養物保藏中心保藏，菌種保藏號:CCTCCM209102)，此菌株缺少谷氨酸合成途徑，但具有較高的谷氨酸脫羧酶活力，能高效催化Y-氨基丁酸的合成。在此基礎上，本發明建立了一個有效的轉化體系，前期利用天津短桿菌SW07-1進行谷氨酸發酵，再利用植物乳桿菌GB01-21將發酵液中的谷氨酸轉化為Y -氨基丁酸，減少底物谷氨酸的添加量，節約了 Y-氨基丁酸的制備成本。

發明內容
本發明的目的是利用相對廉價的葡萄糖為原料，通過兩步發酵連續發酵生產
Y-氨基丁酸，即第一步采用谷氨酸生產菌株將葡萄糖轉化為谷氨酸，第二步采用全細胞轉化的方法，將能產生谷氨酸脫羧酶的菌株添加到谷氨酸發酵液，建立穩定的轉化體系，催化谷氨酸脫羧形成Y-氨基丁酸，為微生物發酵法生產Y-氨基丁酸提供了一個新思路以及一個切實可行的新工藝，從而可以降低Y-氨基丁酸的生產成本。本發明的技術方案:本發明提供了一種利用天津短桿菌SW07-1和植物乳桿菌GB01-21混合發酵高產Y-氨基丁酸的方法。首先利用天津短桿菌SW07-1將葡萄糖轉化為谷氨酸，再通過植物乳桿菌GB01-21將上步發酵液中的谷氨酸轉化為Y-氨基丁酸。具體過程為先將第一步谷氨酸發酵所得發酵液的PH調到谷氨酸脫羧酶的最適pH，添加緩沖成分，構成穩定的轉化體系；再將第二步發酵液經過濾或者離心的方法得到谷氨酸脫羧酶生產菌株植物乳桿菌GB01-21的菌體，將其添加到谷氨酸發酵液轉化體系中進行全細胞轉化。實現本發明方法的步驟如下:(1)培養基的制備:培養基中必須具備微生物生長所需的營養成分，即碳源、氮源、無機鹽、生長因子等。碳源主要有葡萄糖、糖蜜、淀粉、淀粉水解物等；氮源主要有玉米漿、酵母膏、酵母粉、蛋白胨、酪蛋白水解物、其他含氮有機物尿素、氨基酸等以及含氮無機物氨水、硫酸銨和氯化銨等。以及磷酸鹽(磷源)和硫酸鹽(硫源)等。另外，培養基中除加入以上碳源和氮源等外，還需適量加入所使用微生物必須的金屬離子、維生素和氨基酸等。金屬離子等微量元素的含量大約在0.01mg/L-50mg/L的范圍內。以糖質為原料生產谷氨酸的棒桿菌一般都是生物素要求性的，所以為了大量積累谷氨酸就必須嚴格控制增值環境，把生物素限定在菌體生長的亞適量范圍內，培養基需要在115°C下滅菌15-20min方能使用。 (2)種子培養:種子培養在搖瓶中進行，將保存菌種分別接入各自的活化培養基，每種微生物在各自的最適培養條件下培養相應時間，再以2%的接種量接種至種子培養基，適宜條件下培養。(3)谷氨酸的發酵:在發酵罐中進行，以10%接種量接種至5L發酵罐。發酵罐中裝液量為2L-2.5L，通氣量1.5-2L/(min *L)，氨基酸的發酵可通過流加氨水來控制pH，根據溶氧需求調節轉速，培養溫度一般控制在30°C左右。谷氨酸的發酵對于通風量以及pH的控制要求是比較嚴格的。通風量的不足會大大降低溶氧，從而導致其他有機雜酸生成量增加。谷氨酸的發酵需要添加NH4+源(氨水)，若NH4+供給量不足會大量積累α-酮戊二酸、檸檬酸及琥珀酸等有機酸，而不合成谷氨酸。(4) Y-氨基丁酸生產菌株植物乳桿菌的培養及收集:植物乳桿菌屬于乳酸菌類，一般適宜的培養基為MRS培養基。因此可將保藏的植物乳桿菌經MRS培養基進行活化，再接種至菌株適合表達谷氨酸脫羧酶的培養基中進行培養。植物乳桿菌為厭氧細菌(兼性好氧)，培養時可靜置培養。培養后的菌體經離心收集備用。(5)谷氨酸發酵液直接轉化:尋找適宜谷氨酸脫羧酶作用的緩沖液，按照緩沖液的配制方法向谷氨酸發酵液中加入對應量緩沖物質，構成緩沖體系。同時，將前一步收集到的植物乳桿菌加入到緩沖體系中，作為轉化體系，在谷氨酸脫羧酶的最適溫度、pH等條件下進行轉化，定時檢測發酵液中殘留谷氨酸含量以間接估算Y-氨基丁酸的合成情況。(6)底物與產物的的定性與定量分析:葡萄糖和谷氨酸的實時檢測通過生物傳感器進行測定。Y-氨基丁酸通過氨基酸測定儀測定。利用氨基酸測定儀分別測定標準樣品
Y-氨基丁酸和轉化液各自的出峰時間和峰面積，即可以對轉化液中Y -氨基丁酸進行定性與定量檢測。本發明的有益效果:本發明提供了一種利用天津短桿菌和植物乳桿菌混合發酵高產Y-氨基丁酸的方法，建立了一種能夠直接將谷氨酸發酵液中的谷氨酸轉化Y-氨基丁酸的穩定的轉化體系。本發明可利用廉價的葡萄糖為原料，通過兩步連續發酵生產Y-氨基丁酸，即第一步采用谷氨酸生產菌株將葡萄糖轉化為谷氨酸，第二步采用全細胞轉化的方法，將能產生谷氨酸脫羧酶的菌株添加到谷氨酸發酵液，催化谷氨酸脫羧形成Y -氨基丁酸，為微生物發酵法生產Y-氨基丁酸提供了一個新思路以及一個切實可行的新工藝，從而可以降低Y-氨基丁酸的生產成本。同時，本發明可應用到味精廠等，充分利用谷氨酸發酵液，開拓新工藝，提高生產效益。此發明中使用的菌株均為食品安全菌株，提高了安全性。


圖1谷氨酸發酵液原有谷氨酸直接轉化過程中底物與產物含量變化曲線圖中實線為L-谷氨酸變化曲線，虛線為Y-氨基丁酸變化曲線。圖2氨基酸測定儀測定轉化液中底物與產物的含量圖譜具體實施方法

實施例1:培養基，分述如下:(I)天津短桿菌SW07-1①活化培養基:蛋白胨1，酵母膏0.5，NaCll，葡萄糖0.5，115°C滅菌15min種子培養基:葡萄糖30，玉米漿25，KH2PO4.3Η201.5，MgSO4.7Η200.4，尿素6 (分消)，PH7.0-7.2，115°C滅菌15min ;③發酵培養基(g/L):葡萄糖140，玉米漿3，尿素5.5 (分消)，KH2PO4.3Η201.5，MgSO4.7Η200.8，MnSO4.H2O0.02，FeSO4.7Η200.02，生物素 8Χ 10_5，L-組氨酸 5Χ 1θΛ ρΗ7.0-7.2，115°C滅菌 15min。(2) L.plantarum GBO1-21①活化培養基(g/L):MRS培養基。酪蛋白胨10，牛肉提取物10，酵母提取物5，葡萄糖5，乙酸鈉5，檸檬酸二胺0.2，吐溫0.1，磷酸氫二鉀0.2，硫酸鎂0.2，硫酸錳0.05，碳酸鈣20，pH6.5，115°C滅菌15min;②種子培養基(g/L):TYG液體培養基。胰蛋白胨5，酵母膏5，葡萄糖 10, 丁二酸鈉 5, pH6.5,115°C滅菌 15min。實施例2:天津短桿菌SW07-1的谷氨酸發酵及L.plantarum GBO1-21的收集谷氨酸生產菌株天津短桿菌SW07-1的培養:將保存菌種接入活化培養基，30°C，220r/min往復式搖床振蕩培養12h，再以2 %的接種量接種至種子培養基，30°C，220r/min往復式搖床培養12h。再以10%接種量接種至5L發酵罐。發酵罐中裝液量為2.5L，通氣量
3.5L/min，流加氨水控制pH7.0-7.2，根據溶氧需求調節轉速400_600r/min，30°C培養36h。通過流加適量葡萄糖，最終發酵液中谷氨酸含量約90g/L左右。
植物乳桿菌的收集:將保存菌種接入活化培養基MRS培養基，300C，靜置培養ld，再以12%的接種量接種至裝有3L無菌TYG液體培養基的5L發酵罐中，攪拌速度和通氣量分別為 300r/min、1.25L/min, 30°C培養 36h。4000r/min 離心 IOmin 收集菌體。實施例3:谷氨酸發酵液直接轉化按照醋酸緩沖液的配制方法向天津短桿菌SW07-1谷氨酸發酵液中加入對應量的無水乙酸鈉和冰醋酸，構成0.2mol/L, pH5.0的醋酸緩沖體系。同時，將前一步收集到的植物乳桿菌加入到緩沖體系中(添加的菌體量按照植物乳桿菌培養液體積:谷氨酸發酵液體積=3: 2來計算)，作為轉化體系，攪拌速度和通氣量分別為150r/min、0.5L/min，30°C進行轉化，定時檢測發酵液中殘留谷氨酸含量。如圖1所示為轉化過程中谷氨酸發酵液中原有谷氨酸含量變化曲線，曲線顯示，發酵液中原有谷氨酸在轉化20h時基本轉化完畢。轉化液中Y-氨基丁酸為59.2g/L,摩爾轉化率為93.6%。實施例4:添加外源谷氨酸繼續轉化

根據研究室先前對L.P lantarum GBO1-21轉化谷氨酸為Y _氨基丁酸的能力的研究，單單利用谷氨酸發酵液中原有的90g/L的谷氨酸作為底物還遠遠不夠。本發明繼續向轉化體系中加入60g/L的外源谷氨酸作為底物繼續轉化。最終轉化液中Y-氨基丁酸含量為96.5g/L，摩爾轉化率為91.8 %。轉化液用氨基酸測定儀測定Y-氨基丁酸含量，如圖2所示，轉化液中對應的出峰時間2.659min的物質為L-谷氨酸，對應的出峰時間10.119的物質為Y-氨基丁酸。
權利要求
1.一種利用天津短桿菌和植物乳桿菌混合發酵高產Y-氨基丁酸的方法，其特征是:利用廉價的葡萄糖為原料，通過兩步連續發酵生產Y -氨基丁酸，第一步采用谷氨酸生產菌株天津短桿菌SW07-1將葡萄糖轉化為谷氨酸，第二步采用全細胞轉化的方法，將能產生谷氨酸脫羧酶的菌株L.Plantarum GB01-21添加到谷氨酸發酵液,建立穩定的轉化體系,催化谷氨酸脫羧形成Y-氨基丁酸。
2.權利要求1中第一步用天津短桿菌SW07-1的發酵谷氨酸的方法，其特征是:將保存菌種接入活化培養基，30°C，220r/min往復式搖床振蕩培養12h，再以2%的接種量接種至種子培養基，30°C，220r/min往復式搖床培養12h，再以10%接種量接種至5L發酵罐，發酵罐中裝液量為2.5L，通氣量3.5L/min，流加氨水控制pH7.0-7.2，根據溶氧需求調節轉速400-600r/min，30°C培養36h ;最終發酵液中谷氨酸含量約90g/L左右。
3.權利要求1中第二步植物乳桿菌的培養與菌體收集方法，其特征是:將保存菌種接入活化培養基MRS培養基，30°C，靜置培養ld，再以12%的接種量接種至裝有3L無菌TYG液體培養基的5L發酵罐中，攪拌速度和通氣量分別為300r/min、1.25L/min, 30°C培養36h，4000r/min離心IOmin收集菌體。
4.權利要求1中第二步全細胞轉化方法，其特征是:按照醋酸緩沖液的配制方法向天津短桿菌谷氨酸發酵液中加入對應量的無水乙酸鈉和冰醋酸，構成0.2mol/L, pH5.0的醋酸緩沖體系，同時，將前一步收集到的植物乳桿菌加入到緩沖體系中(添加的菌體量按照植物乳桿菌培養液體積:谷氨酸發酵液體積=3: 2來計算)，作為轉化體系，攪拌速度和通氣量分別為150r/min、0.5L/min，30°C進行轉化20h，發酵液中原有谷氨酸轉化完畢，繼續向轉化體系中加入60g/L的外源谷氨酸作為底物，繼續轉化。
5.權利要求4中的底物與產物的定性與定量分析以及菌體生長情況的監測方法，其特征是發酵液中葡萄糖和 谷氨酸的實時檢測通過SBA-40B生物傳感分析儀測定；Y -氨基丁酸通過氨基酸測定儀測定；利用氨基酸測定儀分別測定標準樣品Y-氨基丁酸和轉化液各自的出峰時間和峰面積，即可以對轉化液中Y -氨基丁酸進行定性與定量檢測。
全文摘要
一種利用天津短桿菌和植物乳桿菌混合發酵高產γ-氨基丁酸的方法，屬于發酵工程和酶工程領域。本發明利用天津短桿菌SW07-1將葡萄糖轉化為谷氨酸，再經植物乳桿菌GB01-21將上步發酵液的谷氨酸轉化為γ-氨基丁酸。轉化前，谷氨酸發酵液調到谷氨酸脫羧酶最適pH，建立轉化體系，第二步發酵液經過濾或離心的方法得到植物乳桿菌GB01-21的菌體，將其添加到轉化體系進行全細胞轉化。發酵液原有谷氨酸轉化完畢時轉化液γ-氨基丁酸為59.2g/L，摩爾轉化率為93.6％。繼續添加外源谷氨酸轉化完畢后GABA含量為96.5g/L，摩爾轉化率為91.8％。
文檔編號C12P13/00GK103243128SQ20131019628
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月24日 優先權日2013年5月24日
發明者饒志明, 孫紅梅, 李秀鵬, 徐美娟 申請人:江南大學