專利名稱：基于高通量測序技術進行核酸定性定量檢測的方法
技術領域：
本發明屬于基因測序技術領域，具體涉及ー種基于高通量測序技術進行核酸定性定量檢測的方法。
背景技術：
高通量測序技術是對傳統測序(Sanger測序)一次革命性的改變。傳統測序技術一次只能測單ー的基因片段，在1990年-2003年首次完成的ー個人的全基+因組測序使用的就是傳統的Sanger法，花費了十幾年的時間，耗費了巨大的資金，動員了多個國家的數百科學家。而高通量測序可一次對幾十萬到幾百萬條甚至幾千萬條DNA分子片段進行序列測定，完成ー個人的基因組測序目前達到只需要幾天的時間，成本降到幾千美元。高通量測序一般稱為下一代測序技木。高通量測序技術包括目前的Roche公司的454技術、Illumina公司的Solexa技術和HiSeq技術、ABI公司的SOLiD技術、Life technologies 公司的 Ion torrent 測序技術、Helicos HeliscopeTM 和 PacificBiosciences推出的單分子測序技術，及將要出現的其它高通量測序技木。高通量測序技術應用前景很廣，已經應用到各物種基因組全測序、表觀基因組學、宏基因組學及功能基因組學研究的許多方面。雖然這些應用極大地増加了發現與人類疾病息息相關的各種基因突變、短片段插入/缺失、基因組水平異常的機會，但目前還主要停留在研究階段，還沒有作為臨床診斷和檢測手段，更沒有對各種環境下的微生物種群及其比例關系進行鑒定。造成這種現狀的主要原因一是現有高通量技術使用成本高，ニ是還沒有一種基于高通量測序的定性定量方法。目前常用的核酸定性方法是做ー個PCR擴增，有產物產生就斷定是某種DNA。這種方法雖然簡單，但一次只能鑒定ー種DNA;又由于PCR非常靈敏，極易被污染造成假陽性結果。研究核酸定量的方法目前是real-time Q-PCR(熒光實時定量PCR)方法。所謂real-time Q-PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團或者熒光探針，利用熒光信號產生時的擴增循環位點(Ct值)與樣品中靶標的量有對數關系，實時監測整個PCR進程中熒光信號的累積過程，最后通過與樣品中另ー參照物或標準曲線進行比對的定量分析方法。因此，靶標定量有兩種策略相對定量和絕對定量。相對定量指的是在樣本中靶標量相對于另ー參照物的量。絕對定量指的是用已知量的標準曲線來推算靶標的未知量。在ー份核酸混合物樣品中利用real-time Q-PCR技術定量分析各成分，除每次主要只能分析ー個成分外，無論是相對定量還是標準曲線定量方法仍存在ー些PCR定量方法均有的問題有待解決。在標準曲線定量中，標準品的制備是ー個必不可少的過程。目前由于無統ー標準，各個實驗室所用的生成標準曲線的樣品各不相同，致使實驗結果缺乏可比性。此外，用real-time Q-PCR來研究mRNA時，受到不同RNA樣本存在不同的逆轉錄(RT)效率的限制。在相對定量中，其前提是假設內源控制物(參照物)不受實驗條件的影響，合理地選擇合適的不受實驗條件影響的內源控制物也是實驗結果可靠與否的關鍵，實驗證明要做到這一點是很難的。另外，與傳統的PCR技術相比，Real-time Q-PCR的不足之處是(I)由于運用了封閉的檢測，減少了擴增后電泳的檢測步驟，因此也就不能監測擴增產物的大小；(2)因為熒光素種類以及檢測光源的局限性，從而相對地限制了 real-time Q-PCR的復合式(multiplex)檢測的應用能力；(3)目前real-time Q-PCR實驗成本比較高,技術操作難度大，從而也限制了其廣泛的應用。

發明內容
本發明目的在于提供一種基于高通量測序技術進行核酸定性定量檢測的方法，解決了現有技術中熒光實時定量PCR方法進行核酸定性和定量檢測中的種種不足之處。為了解決現有技術中的這些問題，本發明提供的技術方案是一種基于高通量測序技術進行核酸定性定量檢測的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(I)將待捕獲的基因組隨機打斷后采用第一引物進行第一次PCR擴增；所述第一引物一端與標記有生物素的第一接頭DNA片段相連，并與待捕獲的目的基因區域序列互補結合的寡核苷酸單鏈序列；(2)使用捕獲組分對進行第一次單向PCR擴增后的目的基因區域序列進行捕獲；所述捕獲組分包括親和素和與親和素結合的固相載體；所述親和素與所述第一次單向PCR擴增后的目的基因區域序列上的生物素相結合；(3)使用第二引物對親和素結合后的目的基因區域序列進行第二次單向PCR擴增；所述第二引物一端與第二接頭DNA片段相連，并與所述目的基因區域序列互補結合，且與第一引物進行PCR擴增的方向相反；(4)將第二次單向PCR擴增后的目的基因區域序列除去親和素生物素復合物，獲得兩端帶有相同或不同DNA接頭的單鏈DNA文庫；(5)采用高通量測序技術對獲得的單鏈DNA文庫進行測序，然后對測序結果進行核酸的定性分析和定量分析，獲得核酸定性定量檢測結果。優選的，所述方法中固相載體為微球。優選的,所述方法中固相載體為磁性微球。優選的，所述方法中所述親和素選自卵白親合素、鏈親合素、卵黃親合素及類親合素。優選的，所述方法中所述第一接頭DNA片段具有SEQ No 1的連續核苷酸序列，且5’端通過生物素進行標記；第ニ接頭DNA片段具有SEQ No 2的連續核苷酸序列。優選的，所述方法中所述第一引物由第一接頭DNA片段、ACTG堿基組和用于特異性擴增目的基因靶向序列，含有目的基因的至少15個連續的核苷酸序列的特異性引物連接而成；所述第二引物由第二接頭DNA片段、ACTG堿基組和用于特異性擴增目的基因靶向序列，含有目的基因的至少15個連續的核苷酸序列的特異性引物連接而成。優選的，所述方法中所述第一引物進行第一次PCR擴增的第一 PCR反應體系包括PCR緩沖液、dNTPs、MgCl2, TaqDNA聚合酶、待捕獲的目的基因區域序列作為模板DNA，所述第一 PCR反應體系終濃度組成為PCR緩沖液終濃度I IOX ; dNTPsO. 01 I. 5mM ；
引物序列終濃度為O. 01 2 μ M ;模板DNAO. 01 IOng/ μ L ；TaqDNA 聚合酶 O. 01 I. OU/ μ L ;MgCl2終濃度為 O. 5 5mM。優選的，所述方法中所述第二引物進行第二次PCR擴增的第二 PCR反應體系包括PCR緩沖液、dNTPs、MgCl2, TaqDNA聚合酶、待捕獲的目的基因區域序列作為模板DNA，所述第二 PCR反應體系終濃度組成為PCR緩沖液終濃度I IOX ;
dNTPsO. 01 I. 5mM ；引物序列終濃度為O. 01 2 μ M ;模板DNAO. 01 IOng/ μ L ；TaqDNA 聚合酶 O. 01 I. OU/ μ L ;MgCl2終濃度為 O. 5 5mM。優選的，所述方法步驟(I)中待捕獲的基因組是從選自人或動物或微生物群體中提取的。優選的，所述方法步驟(5)中高通量測序技術選自454焦磷酸測序方法、IlluminaSolexa合成測序方法、ABI SOLiD連接法測序方法、Life technologies公司的Ion torrent測序方法、單分子測序方法。優選的，所述方法步驟(5)中進行核酸的定性分析和定量分析是利用計算機軟件計數和簡單的統計分析(t-test)、標準差分析方法來完成。本發明待捕獲的基因組樣本來自包括但不限于人或動物血液組織、其他組織和排泄物的基因組和轉錄組；人或動物的口腔、皮膚和腸胃微生物菌群基因組；土壌、水、樹林、草地等生態環境中微生物群體的基因組等等。作為示例，如外周血細胞、外周血血清或血漿、體液、腔道的脫落物、病變新鮮組織、冰凍病變切片、石蠟病變切片。本發明基于高通量測序原理來完成的，本發明首次完成了核酸“測序-定性”、相對“測序-定量”和絕對“測序-定量”的方法，利用對ー份核酸樣本中幾十萬到上百萬個不同DNA分子同時測序鑒定后，利用計算機軟件計數和簡單的統計分析(t-test)、標準差分析方法就可完成對樣本的準確定性定量。該方法克服了需要real-time Q-PCR標準曲線的方法，省去了逆轉錄效率的限制，本方法實驗成本很低，并結合采用多基因多區域兩步單向擴增捕獲特異核酸靶標方法進行高通量測序后，就是ー個“直接點數”識別各種不同核酸分子后定性和定量同時完成。檢測一次獲得幾百上千萬個數據只需要數百元人民幣。所述的多基因多區域兩步單向擴增捕獲特異核酸靶標方法，包括以下步驟(I)將待捕獲的基因組隨機打斷后采用第一引物進行第一次PCR擴增；所述第一引物一端與標記有生物素的第一接頭DNA片段相連，并與待捕獲的目的基因區域序列互補結合的寡核苷酸單鏈序列；(2)使用捕獲組分對進行第一次單向PCR擴增后的目的基因區域序列進行捕獲；所述捕獲組分包括親和素和與親和素結合的固相載體；所述親和素與所述第一次單向PCR擴增后的目的基因區域序列上的生物素相結合；(3)使用第二引物對親和素結合后的目的基因區域序列進行第二次單向PCR擴增；所述第二引物一端與第二接頭DNA片段相連，并與所述目的基因區域序列互補結合，且與第一引物進行PCR擴增的方向相反；(4)將第二次單向PCR擴增后的目的基因區域序列除去親和素生物素復合物，獲得兩端帶有相同或不同DNA接頭的單鏈DNA文庫。優選的多基因多區域兩步單向擴增捕獲特異核酸靶標方法可以采用如下的步驟進行，如圖I所示
(I)首先將基因組用超聲破碎儀進行隨機打斷；(2)將單引物加入破碎的基因組中進行單向PCR擴增。單引物由DNA特異引物在5’端與接有生物素的接頭DNA相連；(3)用鏈霉親和素磁珠將攜帯生物素(Bio)的單鏈目的片段DNA進行捕獲；(4)用特異性引物對捕獲的DNA進行第二次單向PCR擴增；(5)除去帶有生物素的單鏈，獲得兩端帶有相同或不同DNA接頭的單鏈DNA文庫(文庫DNA相同序列分子也可以是不同系列的分子)；(6)文庫DNA用于測序或其它任何應用。本發明多基因多區域兩步單向擴增捕獲特異核酸靶標方法既集合了 in-solution的高特異性的優點，由具有操作簡單、省時省力的優點，又具有用樣品量少的優點。這樣，進行核酸定性定量檢測的方法可以按照如下步驟進行(I)提取樣本的核酸(包括人或動物血液組織、其他組織和排泄物的基因組和轉錄組；人或動物的口腔、皮膚和腸胃微生物菌群基因組；土壌、水、樹林、草地等生態環境中微生物群體的基因組等等)；(2)應用多基因多區域兩步單向擴增捕獲特異核酸靶標方法或其它成熟的技木，制備單鏈DNA(ssDNA)測序文庫；(3)進行高通量測序；(4)對測序結果進行定性、絕對定量(計數)和進行相對定量(比較)。測序定性就是說對ー個未知的微生物群體或者對可能有癌細胞存在的人體中的基因組進行測序后，確定了微生物群體中的微生物的種類和腫瘤細胞確定存在以及存在的突變的位置。測序絕對定量就是對測序后測得的每ー種微生物種類或每ー腫瘤細胞種類的某一或某幾個特定的基因進行計數得出ー個平均值作為群體中某一微生物或某一細胞的統計數目。測序的相對定量是對微生物種群中的不同微生物種類的統計數目的比值或者腫瘤細胞統計數目與正常細胞的統計數目的比值，這樣可以辨別微生物種群中什么微生物是核心種群，以及腫瘤細胞達到什么樣的比例是初期、中期或后期。如本文所用，術語“親和素”包括卵白親合素(Avidin，A)、鏈霉親合素(Streptavidin, SA)、卵黃親合素及類親合素等。該術語還包括野生型、突變型以及衍生型的親和素。如本文所用，術語“生物素”(biontin，B)廣泛分布于動、植物組織中，常從含量較高的卵黃和肝組織中提取，分子量244. 31Kd。生物素分子有兩個環狀結構，其中I環為咪唑酮環，是與親和素結合的主要部位；11環為噻吩環，C2上有一戊酸側鏈，其末端羧基是結合抗體和其他生物大分子的惟一結構，經化學修飾后，生物素可成為帶有多種活性基團的衍生物——活化生物素。
如本文所用，術語“固相載體” 一般選擇可結合如親和素或鏈霉親和素等大分子蛋白質；生物大分子固相化后仍應保持活性，而且為有利于反應充分進行，最好其活性基團朝向反應溶液。接頭DNA片段分別設計如下，其可以通過PCR擴增的方式連接入DNA片段；也可以通過連接酶連接的方式連接入DNA片段。接頭A :5’ -/BioTEG/GAGGATCCAGAATTCTCGAGTT-3，；接頭B :5，-CTCGAGAATTCTGGATCCTC-3，；捕獲引物包括第一引物和第二引物，均由接頭DNA片段+ACTG堿基組+與待擴增的基因組DNA片段配合的特異性引物(specific primer)組成。即第一引物的結構為接頭A+ACTG+specific primer ;第二引物的結構為接頭 B+ACTG+specific primer ;兩引物中特異性引物根據所要捕獲的不同基因而不同。所述的特異性引物(specific primer),為用于特異性擴增目的基因祀向序列,含有目的基因的至少15個連續的核苷酸序列；如進行PCR擴增血管性血友病基因的1-5個外顯子的特異性引物具有SEQ No 5 14的連續核苷酸序列。
權利要求
1.一種基于高通量測序技術進行核酸定性定量檢測的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟 (1)將待捕獲的目的基因組隨機打斷后采用第一引物進行第一次PCR擴增；所述第一引物一端與標記有生物素的第一接頭DNA片段相連，并與待捕獲的目的基因區域序列互補結合的寡核苷酸單鏈序列； (2)使用捕獲組分對進行第一次單向PCR擴增后的目的基因區域序列進行捕獲；所述捕獲組分包括親和素和與親和素結合的固相載體；所述親和素與所述第一次單向PCR擴增后的目的基因區域序列上的生物素相結合； (3)使用第二引物對親和素結合后的目的基因區域序列進行第二次單向PCR擴增；所述第二引物一端與第二接頭DNA片段相連，并與所述目的基因區域序列互補結合，且與第一弓I物進行PCR擴增的方向相反； (4)將第二次單向PCR擴增后的目的基因區域序列除去親和素生物素復合物，獲得兩端帶有相同或不同DNA接頭的單鏈DNA文庫； (5)采用高通量測序技術對獲得的單鏈DNA文庫進行測序，然后對測序結果進行核酸的定性分析和定量分析，獲得核酸定性定量檢測結果。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述方法中固相載體為微球。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述方法中固相載體為磁性微球。
4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述方法中所述親和素選自卵白親合素、鏈親合素、卵黃親合素及類親合素。
5.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述方法中所述第一接頭DNA片段具有SEQ No :1或3的連續核苷酸序列，且5’端通過生物素進行標記；第二接頭DNA片段具有SEQ No :2或4的連續核苷酸序列。
6.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述方法中所述第一引物進行第一次PCR擴增的第一 PCR反應體系包括PCR緩沖液、dNTPs、MgCl2, TaqDNA聚合酶、待捕獲的目的基因區域序列作為模板DNA，所述第一 PCR反應體系終濃度組成為 PCR緩沖液終濃度I 10 X ；dNTPs 0. 01 I. 5mM ; 弓I物序列終濃度為0. 01 2 M ; 模板 DNA 0. 01 10ng/ii L ;TaqDNA 聚合酶 0. 01 I. OU/ ii L ; MgCl2 終濃度為0. 5 5mM。
7.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述方法中所述第二引物進行第二次PCR擴增的第二 PCR反應體系包括PCR緩沖液、dNTPs、MgCl2, TaqDNA聚合酶、待捕獲的目的基因區域序列作為模板DNA，所述第二 PCR反應體系終濃度組成為 PCR緩沖液終濃度I 10 X ；dNTPs 0. 01 I. 5mM ; 弓I物序列終濃度為0. 01 2 M ; 模板 DNA 0. 01 10ng/ii L ;TaqDNA 聚合酶 0. 01 I. OU/ ii L ;MgCl2 終濃度為0. 5 5mM。
8.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述方法步驟(I)中待捕獲的基因組是從選自人或動物或微生物群體中提取的。
9.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述方法步驟(5)中高通量測序技術選自454焦磷酸測序方法、Illumina Solexa合成測序方法、ABI SOLiD連接法測序方法、Lifetechnologies公司的Ion torrent測序方法、單分子測序方法。
10.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述方法步驟(5)中進行核酸的定性分析和定量分析是利用計算機軟件計數和簡單的統計分析(t-test)、標準差分析方法來完成。
全文摘要
本發明公開了一種基于高通量測序技術進行核酸定性定量檢測的方法，包括采用多基因多區域兩步單向擴增捕獲特異核酸靶標方法進行制備單鏈DNA文庫后，采用高通量測序技術對獲得的單鏈DNA文庫進行測序，然后對測序結果進行核酸的定性分析和定量分析，獲得核酸定性定量檢測結果。該方法比普通的real-timeQ-PCR定量方法成本低很多，應用更加廣泛提高了核酸定量的樣本通量，可以對核酸的系列進行精確的定性和定量。
文檔編號C12Q1/68GK102628082SQ201210103138
公開日2012年8月8日 申請日期2012年4月10日 優先權日2012年4月10日
發明者何越, 楊楠, 臧伯瑋, 艾洪新 申請人:凱晶生物科技(蘇州)有限公司