專利名稱：低甘油合成、高酒精耐性的工業釀酒酵母菌株及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株低甘油合成、高酒精耐性的工業釀酒酵母菌株一釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)TOl及其應用；以及一種集成基因代謝工程和全基因組重排構建工業釀酒酵母工程菌的方法。
背景技術：
酒精濃醪發酵，簡單來說就是發酵過程中的高濃度發酵，具體表現在生產有以下特點1、高酒份；2、高滲透壓；3、高酵母數。就酒精生產而言，不同原料、不同時期濃醪發酵的界限存在著明顯的差別；大概區分如下淀粉質原料酒精濃度在14 16% (V/V)，糖蜜原料酒精濃度在10 12% (V/V)。實現酒精濃醪發酵技術，可極大地提高設備利用率、減少工藝用水、降低蒸煮蒸餾能耗和生產成本，對提高乙醇生產的效率與經濟和社會效益具有重要現實意義和應用價值。與常規酒精發酵相比，釀酒酵母在濃醪發酵過程中，不僅面臨著更加嚴峻的環境脅迫 (高滲、高酒精脅迫等)，還會因甘油、乙酸等副產物生成的增多而降低葡萄糖乙醇轉化率。 因此，為達到工業化生產對發酵速率、乙醇產量和糖醇轉化率等技術指標的要求，選育副產物合成低并具有高耐性的工業釀酒酵母菌株是突破濃醪發酵技術瓶頸的關鍵所在。甘油是釀酒酵母發酵生產乙醇過程中主要的副產物，約消耗4% 10%的總碳源，如這些碳源用于生成乙醇，全球每年無需增加成本即可增產乙醇13億升。目前，對酵母細胞甘油代謝途徑已研究比較透徹，應用基因代謝工程技術對甘油合成相關的基因及途徑進行修飾和改造，可以有效降低甘油的合成，但改造菌株在發酵過程中對高糖、高濃度乙醇等脅迫因子耐受性下降，生長緩慢，進而引起發酵速率降低、發酵周期延長及乙醇產量降低等不良現象。針對一個或少量基因調控、機制已知的性狀，基因代謝工程方法是較容易和直接的可行性理性策略，但對于涉及多個基因及其調控網絡的復雜性狀(如發酵速率、耐受性等發酵性狀)，基因代謝工程技術很難達到預期效果，甚至會引起菌株關鍵性能的退化衰變。目前，已有研究應用基于全基因組水平的盲目育種技術——全基因組重排，有效改良菌株的耐乙酸、耐高濃度乙醇等耐受性，但改造菌株的其他生產性能如糖醇轉化率提高并不顯著，而且隨著醪液可發酵性碳源的增加，副產物合成也增加，極大限制了乙醇產量的提尚ο綜上所述，應用單一的育種手段雖然能夠改良菌株某一方面的性狀，但很難獲得性能全面的優良菌株，而且容易導致生產菌株關鍵性能的退化衰變。要從根本上突破濃醪發酵技術瓶頸，獲得性能全面的優良釀酒酵母菌株，還是需要結合不同的工業微生物育種策略優勢，實現優劣互補，集成創新，更有效、快速地進行工業生產菌株的改良。

發明內容
本發明的目的是提供一株具有低副產物合成和高酒精耐性的工業釀酒酵母工程菌株及其應用，以及一種集成基因代謝工程與全基因組重排技術改良菌株多種生產性能的方法。本發明采用的技術方案是一株低甘油合成、高酒精耐性的工業釀酒酵母菌株——釀酒酵母(Saccharomyces CereVisiae)rei，保藏于中國典型培養物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，430072，保藏編號CCTCC No =M 2011274，保藏日期2011年8月1日。本發明還涉及所述釀酒酵母CCTCC No =M 2011274在微生物工業濃醪發酵生產酒精中的應用。具體的，所述應用為將釀酒酵母CCTCC No =M 2011274接種至以雙酶法配制的玉米糖化醪發酵液，30 35°C發酵60 80h，發酵結束后發酵液經分離純化獲得酒精。具體的，所述玉米糖化醪發酵液可按常規雙酶法配制，本發明中具體如下取玉米粉，加2 3倍質量的水調漿，攪拌加熱至50 70°C，加入耐高溫α -淀粉酶IOU 30U/ g玉米粉，混勻后加熱至80 90°C進行糊化液化，100 110°C保溫0. 5 2h ；糊化醪冷卻至50 70°C，加入糖化酶100U 300U/g玉米粉，55 60°C糖化0. 5 1. Oh,即得所述玉米糖化醪發酵液。本發明還涉及一種集成基因代謝工程和全基因組重排構建工業釀酒酵母工程菌的方法，所述方法包括(1)誘導釀酒酵母菌株產孢，分離純化單倍體菌株，鑒定單倍體菌株交配型，選取交配型a的單倍體菌株Yl和交配型α的單倍體菌株Υ2作為出發菌株；(2)然后分別敲除菌株Yl和菌株Υ2的編碼甘油轉運蛋白的基因FPS1，并在FPSl 位點整合表達變鏈球菌(Str印tococcus mutans)的3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPN)，對單倍體Yl和Y2分別采用G41V和Zec/抗性標記篩選，獲得單倍體基因工程菌株=GMSlr抗性菌株 YFGl (MATa, fpsl Δ :PGKp-gapN)和 Zeor 抗性菌株 YFG2 (ΜΑΤ α，fpsl Δ :PGKp-gapN)；(3)分別使用紫外和EMS對菌株YFGl和菌株YFG2進行誘變，獲得四個突變庫 YFGl紫外誘變庫、YFGl EMS誘變庫、YFG2紫外誘變庫和YFG2 EMS誘變庫；(4)以體積濃度8%的乙醇YPD平板篩選生長迅速的單菌落進行第一輪全基因組重排，用含300μ g/mL G418和50yg/mL Zeocin的YPD平板篩選重排子，誘導重排子產孢破壁后，用體積濃度12%的乙醇YPD平板篩選生長迅速的單菌落進行第二輪全基因組重排， 用含300 μ g/mLG418和50 μ g/mL Zeocin的YPD平板篩選重排子，通過模擬工業原料的濃醪發酵測試，獲得低副產物合成、高糖醇轉化率和高乙醇產量的工業釀酒酵母工程菌株。所述甘油轉運蛋白的氨基酸序列GenBank號NP 013057 ；所述變鏈球菌 (Streptococcus mutans)的3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPN)的氨基酸序列的GenBank號為 AAA91091o所述甘油轉運蛋白的編碼基因GenBank號匪001181863 ；所述變鏈球菌 (Streptococcus mutans)的3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPN)的編碼基因GenBank號為 L38521。本發明的有益效果主要體現在本發明提供了一株具有副產物低、高酒精耐性的優良工業釀酒酵母工程菌株及其應用，以及一種改良工業菌株多種生產性能的方法——基因代謝工程與全基因組重排聯用；運用此方法可改良釀酒酵母菌株的糖醇轉化率、耐性、 發酵速率等多種生產性能，改良菌株可用于工業濃醪酒精發酵生產，減少能耗，降低生產成
4本；此方法也可用于其它工業微生物性能的改良。


圖1為G41V抗性的敲除FPSl整合gapN盒示意圖；圖2為Zec/抗性的敲除FPSl整合gapN盒示意圖；圖3為全基因組重排流程圖；其中， 為G41V抗性的基因工程菌株YFG1，ζ為 Zeor抗性的基因工程菌株YFG2 ；圖4為乙醇脅迫條件下菌株的生長曲線；(■，□)對照菌株Υ12;(·，〇)基因工程菌株YFG12 ； (▲，Δ)基因工程重排子rei ；圖中空心圖標為O% (ν/ν)乙醇脅迫條件； 實心圖標為10% (ν/ν)乙醇脅迫條件；圖5為濃醪發酵性能測試；㈩出發菌株Ζ87 ； ( □)對照菌株Υ12 ；(〇)基因工程菌株YFG12;(A)基因工程重排子rei。Α:殘糖；B:乙醇。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此實施例1 工業釀酒酵母甘油代謝工程菌株的獲得1、單倍體出發菌株的獲得將工業釀酒酵母Z87于30°C YPD活化后，轉接入產孢培養基，在26°C培養3 7天。顯微鏡下觀察其子囊孢子生成時收集菌體，生理鹽水洗滌2次后，加入700 μ L Tris-HCl (ρΗ8. 0,0. 01mol/L) ,200 μ L 100mg/mL 蝸牛酶溶液和 IOOyL 0. lmol/L 巰基乙醇，120r/min在30°C培養16h，使子囊壁破裂釋放孢子。58°C高溫處理15min致死營養細胞，離心收集孢子，稀釋涂布于YPD平板，30°C培養2 3天，挑取單菌落，YPD斜面活化后進行產孢驗證，不能產孢者確定為單倍體菌株。待測菌株及標準菌株BY4741(交配型α型)(ATCC 201388)、ΒΥ4742 (交配型a型) (ATCC 201389)分別接種于YPD液體培養基，30°C、200r/min培養過夜，取待測菌株培養液分別與兩種標準菌株培養液混合，轉接于新鮮YPD液體培養基中，30°C、100r/min培養，培養過程中鏡檢觀察是否有 鈴形細胞產生，48h后離心收集，稀釋涂布產孢基本培養，26°C 培養3 7天，鏡檢觀察有無子囊產生，如產生子囊孢子則認為雜交成功，可確定該單倍體交配型能與a型標準菌株BY4742雜交的菌株其交配型為α ；能與α型標準菌株ΒΥ4741 雜交的菌株其交配型為a。選取兩株單倍體菌株Yl (交配型a型)和Y2(交配型α型)作為后續育種的出發單倍體菌株，并將Yl和Υ2雜交獲得二倍體菌株Υ12作為實驗對照菌株。2、釀酒酵母甘油代謝工程菌株的構建(1)利用醋酸鋰轉化法，將G41K抗性的敲除FPSl整合gapN盒(圖1)轉化單倍體菌株Yl (交配型a型)，用含300 μ g/mL G418的YPD平板篩選得到工程單倍體菌株YFGl， 基因型為(MAT a, fpsl Δ :PGKp-gapN)；(2)利用醋酸鋰轉化法，將Zec/抗性的敲除FPSl整合gapN盒(圖2)轉化單倍體菌株Y2 (交配型α型)，用含50 μ g/mL Zeocin的YPD平板(pH7. 0)篩選得到工程單倍體菌株 YFG2，基因型為(ΜΑΤ α，fpsl Δ :PGKp-gapN)；
(3)將YFGl和YFG2進行雜交，二者經液體YPD 30°C培養24h后，混合培養于新鮮液體YPD培養2天后離心收集，稀釋涂布于含300 μ g/mL G418和50 μ g/mL Zeocin的 YPD雙抗平板(ρΗ7· 0)，獲得二倍體基因工程菌株YFG12 (MAT a/ α，fpsl Δ :PGKp-gapN， fpslΔ :PGKp-gapN)。其中，步驟⑴⑵中敲除FPSl整合gapN盒中的FPSA和FPSB為同源整合區，克隆于酵母染色體DNA，FPSA為甘油轉運蛋白編碼基因FPSl ATG起始密碼子上游-242到-51 序列片段，FPSB為甘油轉運蛋白編碼基因FPSl的1906到2124序列片段；在FPSA和FPSB 之間插入的PGK啟動子(PGKp)和PGK終止子(PGKt)克隆于酵母染色體DNA，在啟動子和終止子之間插入克隆于變鏈球菌染色體DNA的3-磷酸甘油醛脫氫酶編碼基因gapN，并將 gapN基因的起始密碼子TTG改為ATG ；其中步驟(1)中敲除FPSl整合gapN盒中的G418抗性基因(G4189作為篩選標記，克隆于質粒PUG6 (購于Invitrogen)。其中步驟(2)中敲除FPSl整合gapN盒中的Zeocin抗性基因(ZecZ)作為篩選標記，克隆于質粒PPICZaA(購于Invitrogen)。實施例2 對基因工程菌株實施全基因組重排如圖3所示流程實施全基因組重排，具體步驟如下Ul % (v/v)EMS誘變劑分別對基因工程單倍體菌株YFGl (MAT a, fpsl Δ :PGKp-gapN)和 YFG2 (ΜΑΤ α，fpsl Δ :PGKp-gapN)處理 30 120min,每 30min 取樣加入5% (w/v)硫代硫酸鈉去除EMS污染，4000rpm離心5min收集菌體，生理鹽水洗滌兩次，梯度稀釋涂布含8% (ν/ν)乙醇的YPD板，30°C培養3天，挑取生長旺盛的單菌落；2、在距離為40cm，功率為15w的紫外燈下分別對基因工程單倍體菌株Yi7Gl (MAT a, fpsl Δ :PGKp-gapN)和 YFG2 (ΜΑΤ α，fpsl Δ :PGKp-gapN)進行紫外誘變，每隔 Imin 取樣稀釋涂布含8% (ν/ν)乙醇的YPD板平板，處理5min。處理過程所有操作必須在紅燈下進行，防止光修復，平板用黑色的布包好，置于30°C培養3天，挑取生長旺盛的單菌落；3、將步驟1和2獲得的誘變菌株進行雜交全基因組重排，分別經液體YPD 30°C活化24h后，混合培養于新鮮液體YPD培養2天后離心收集，稀釋涂布于含300 μ g/mL G418 和50 μ g/mL Zeocin的YPD雙抗平板(ρΗ7. 0) 30°C培養3天篩選單菌落即為重排子；4、產孢培養基26°C培養步驟3挑取的重排子3 7天，生理鹽水洗滌菌體后，加 Λ 700 μ L Tris-HCl (ρΗ8· 0,0. 01mol/L)、200 μ L lOOmg/mL 蝸牛酶溶液和 100 μ L 0. Imo 1/ L巰基乙醇，120r/min在30°C培養16h，使子囊壁破裂釋放孢子，58°C高溫處理15min致死營養細胞，離心收集孢子，稀釋涂布于含12% (ν/ν)乙醇的YPD板平板，30°C培養3天，挑取單菌落后，重復步驟3進行第二輪重排；5、將步驟4獲得的重排子，進行濃醪發酵測試，雙酶法配制玉米糖化醪發酵液(約含葡萄糖250g/L)，重排子由YPD 30°C培養15h后離心收集，按接種后菌體0D_= 1. O的量接種至裝有260g玉米糖化醪發酵液的錐形瓶，35°C發酵72h，采用多孔性陰離子樹脂柱(Aminex HPX-87Hcolumn)經高效液相色譜測定醪液葡萄糖和乙醇含量，重排子TOl (即 CCTCC No =M 2011274)乙醇最高，產量達到117g/L，殘糖低于5g/L。實施例3 工程菌株生產性能測定1、高濃度乙醇脅迫條件下的生長測定
分別用含0%和10% (ν/ν)乙醇YPD液體培養基30°C培養出發菌株Z87、對照菌株Y12、基因工程菌株YFG12、基因工程重排子陽1，不同時段取樣測定菌株干重，計算菌株最大比生長速率。如圖4所示，在含0%乙醇的YPD培養條件下，四個菌株生長無顯著差異， 延滯期均為0. 4h左右；在含10% (ν/ν)乙醇的YPD培養條件下，四個菌株延滯期均延長至 IOh左右，基因工程重排子rei生長最快，最大比生長速率比Z87和Y12提高11. 4%，比YFGl 提高 21. 9% (ρ < 0. 05)。2、濃醪發酵性能測試模擬工業原料對對照菌株Y12、基因工程菌株YFG12、基因工程重排子rei (即 CCTCC No =M 2011274)進行濃醪發酵測試。雙酶法配制玉米糖化醪發酵液(約含葡萄糖 250g/L)取玉米粉5kg，加IOL水調漿，攪拌加熱至60°C，加耐高溫α -淀粉酶(河南天冠企業集團有限公司)(20000U/mL) 3. 8mL，混勻后加熱至90°C進行糊化液化，105°C保溫Ih ； 糊化醪冷卻至60°C，加糖化酶(河南天冠企業集團有限公司)(105U/mL) 11. 3mL，55°C保溫糖化Ih后，分裝260g至500mL錐形瓶。菌株由YPD 30°C培養15h后離心收集，按接種后菌體OD6tltl = 1. 0的量接種至裝有 200mL玉米糖化醪濾液的錐形瓶，35°C發酵72h，采用多孔性陰離子樹脂柱(Aminex HPX-87H column)經高效液相色譜測定醪液葡萄糖、乙醇、甘油和乙酸含量。基因工程重排子TOl發酵速率最快(圖5)，發酵72h殘糖低于5g/L，已完成發酵，YFG12發酵速率較慢，與其具有較差的乙醇耐受力相一致。發酵結束72h時醪液中各成分含量見表ι 重排子rei乙醇最高， 分別比出發菌株Z87、對照菌株Y12和基因工程菌株YFG12提高10. 3 %、7. 9 %和11. 1 %，糖醇轉化率比Z87和Y12提高3. 3%，與YFG12無顯著差異；重排子TOl和YFG12的葡萄糖甘油轉化率比出發菌株Z87降低14. 7%,比對照菌株Y12降低15. 5%，葡萄糖乙酸轉化率比出發菌株Z87降低24. 3%，比對照菌株Y12降低24. 6%。可見，在濃醪發酵條件下，基因工程重排子rei具有甘油、乙酸副產物合成低，發酵速率快，糖醇轉化率高，乙醇產量高多種優良生產性能。表1 菌株發酵性能測定
權利要求
1.一株低甘油合成、高酒精耐性的工業釀酒酵母菌株一釀酒酵母(Saccharomyces CereVisiae)rei，保藏于中國典型培養物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，430072，保藏編號=CCTCC No :M2011274，保藏日期2011年8月1日。
2.權利要求2所述釀酒酵母CCTCCNo =M 2011274在微生物工業濃醪發酵生產酒精中的應用。
3.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述應用為將釀酒酵母CCTCCNo =M 2011274接種至玉米糖化醪發酵液，30 35°C發酵60 80h，發酵結束后發酵液經分離純化獲得酒精。
4.如權利要求4所述的應用，其特征在于所述玉米糖化醪發酵液按如下方法制得取玉米粉，加2 3倍質量水調漿，攪拌加熱至50 70°C，加入耐高溫α -淀粉酶IOU 30U/ g玉米粉，混勻后加熱至80 90°C進行糊化液化，100 110°C保溫0. 5 2h ；糊化醪冷卻至50 70°C，加入糖化酶100U 300U/g玉米粉，55 60°C糖化0. 5 1. Oh,即得所述玉米糖化醪發酵液。
5.一種集成基因代謝工程和全基因組重排構建工業釀酒酵母工程菌的方法，所述方法包括(1)誘導釀酒酵母菌株產孢，分離純化單倍體菌株，鑒定單倍體菌株交配型，選取交配型a的單倍體菌株Yl和交配型α的單倍體菌株Υ2作為出發菌株；(2)然后分別敲除菌株Yl和菌株Υ2的編碼甘油轉運蛋白的基因FPSl，并在FPSl位點整合表達變鏈球菌(Str印tococcus mutans)的3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPN)，對單倍體Yl 和Y2分別采用G41V和Zec/抗性標記篩選，獲得單倍體基因工程菌株64懷抗性菌株YTOl 和Zec/抗性菌株YFG2 ；(3)分別使用紫外和EMS對菌株YFGl和菌株YFG2進行誘變，獲得四個突變庫YFG1紫外誘變庫、YFG1EMS誘變庫、YFG2紫外誘變庫和YFG2EMS誘變庫；(4)以體積濃度8%的乙醇YPD平板篩選生長迅速的單菌落進行第一輪全基因組重排， 用含300 μ g/mL G418和50 μ g/mL Zeocin的YPD平板篩選重排子，誘導重排子產孢破壁后，用體積濃度12%的乙醇YPD平板篩選生長迅速的單菌落進行第二輪全基因組重排，用含300 μ g/mLG418和50 μ g/mL Zeocin的YPD平板篩選重排子，通過模擬工業原料的濃醪發酵測試，獲得低副產物合成、高糖醇轉化率和高乙醇產量的工業釀酒酵母工程菌株。
全文摘要
本發明提供了一株低甘油合成、高酒精耐性的工業釀酒酵母菌株——釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FG1，保藏于中國典型培養物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，430072，保藏編號CCTCC NoM2011274，保藏日期2011年8月1日。本發明提供了一株具有副產物低、高酒精耐性的優良工業釀酒酵母工程菌株及其應用，以及一種改良工業菌株多種生產性能的方法——基因代謝工程與全基因組重排聯用；運用此方法可改良釀酒酵母菌株的糖醇轉化率、耐性、發酵速率等多種生產性能，改良菌株可用于工業濃醪酒精發酵生產，減少能耗，降低生產成本；此方法也可用于其它工業微生物性能的改良。
文檔編號C12P7/06GK102329743SQ20111029324
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月29日 優先權日2011年9月29日
發明者劉天喆, 吳雪昌, 王品美, 鄭道瓊, 陶香林 申請人:浙江大學