專利名稱：真核表達并純化人源化抗血管內皮生長因子單克隆重組抗體(Anti-VEGF)的簡便化工業技術的制作方法
技術領域：
本發明涉及真核表達并純化人源化抗血管內皮生長因子單克隆重組抗體 (Anti-VEGF)的簡便化方法。
背景技術：
血管內皮生長因子(VEGF)是以二硫鍵連接的二聚體糖蛋白，分子量為35 40kDa。VEGF是一個細胞因子家族，包括VEGF-A、-B、-C、-D、-E和胎盤生長因子等多個成員。 VEGF-A基因的選擇性剪切可以產生至少5種蛋白形式，包括分泌型可溶性蛋白VEGF121、 VEGF145、VEGF165。血管內皮生長因子通過特異性與3個血管內皮生長因子受體結合，啟動下游細胞信號級聯，刺激內皮細胞增殖，促進細胞遷移，并抑制細胞凋亡。血管內皮生長因子主要表達于血管內皮細胞、腫瘤細胞、某些炎癥細胞和間質細胞。血管內皮生長因子的表達水平和腫瘤內的血管生成情況和腫瘤的轉移風險。因此，抑制血管內皮生長因子信號轉導可以抑制多種腫瘤的發生和發展。如今，隨著基因工程技術的發展，抗VEGF抗體已經可以由多種方式獲得。目前市面上多為多克隆抗體或單克隆抗體，鮮見重組抗體。傳統的抗VEGF抗體制劑生產的純化步驟繁瑣，純度也較低，使得其經濟意義大為降低。本發明通過基因工程技術，獲得了人源化抗血管內皮生長因子單克隆重組抗體。
發明內容
本發明的目的在于實現人源化抗血管內皮生長因子單克隆重組抗體在真核細胞中的大量表達，并通過簡化的純化步驟，獲得純度較高抗體。在工業生產中滿足生產周期短，生產成本低，產量高的總體要求。本發明通過體外人工合成雙鏈DNA分子的技術，分別合成人源化抗血管內皮生長因子單克隆抗體重鏈和輕鏈的編碼基因，通過EcoRI和XhoI限制性酶切位點與表達載體 ρ⑶NA3. 1連接。隨后將質粒轉染293T細胞系獲得高效表達。
圖1是轉染后人源化抗血管內皮生長因子單克隆抗體表達SDS-PAGE電泳分析結果圖(M為marker ;1.轉染空載體的陰性對照；2.轉染48小時后2ml培養基抗體表達情況 (還原條件下)；3.轉染96小時后2ml培養基抗體表達情況(還原條件下))。圖2是Anti-VEGF SDS-PAGE分析純化純度結果圖。(A非還原條件，B還原條件)。
具體實施例方式1、人源化抗血管內皮生長因子單克隆重組抗體的真核表達編碼人源化抗血管內皮生長因子單克隆重組抗體重鏈和輕鏈的編碼基因通過EcoRI和XhoI限制性酶切位點與表達載體ρ⑶NA3. 1連接。隨后將質粒轉染CHO-Kl細胞系。轉染前48小時，將IOml活力大于95%、細胞密度為1. 5*105/ml的CHO-Kl細胞用含DMEM完全培養基(無抗，含10%胎牛血清)平鋪于IOcm細胞培養皿，在37°C，5% C02 培養箱中培養。當細胞匯合度達到70-80%時，開始轉染。將含抗血管內皮生長因子單克隆抗體重鏈和輕鏈基因的表達載體各1 μ g，加入到200μ 1 37°C預熱的PBS中，混勻后加入 4yllmg/ml PEI (聚乙烯亞胺)，立即震蕩混勻，在室溫下放置15分鐘。將質粒-PEI混合液加入到細胞培養液中，輕輕混勻后在37°C，5% C02培養箱中培養。6小時后，吸棄細胞培養液，并用37°C預熱的PBS洗細胞3次去除殘留的血清之后；加入IOml無血清培養基，同時加入終濃度分為2mM和ImM的谷氨酰胺(L-Glutamine)和丙酮酸鈉繼續培養。分別于48 小時和96小時收集細胞上清。人源化抗血管內皮生長因子單克隆抗體表達SDS-PAGE電泳分析結果見附圖1。2、Protein A親和層析純化抗體將共計10個細胞培養皿收集所得上清200ml ； lOOOOrpm，4°C離心IOmin去除細胞等沉淀物，并用等體積PBS稀釋1倍。將0. 5ml ProteinA純化樹脂用5ml PBS平衡后，將細胞培養上清以流速0. 5ml/min上柱。5ml PBS洗滌去除非特異結合蛋白后，用IOOmM pH3. 0 甘氨酸溶液洗脫蛋白。用IM Tris-HCl pH9. 0將蛋白洗脫液pH調至中性，之后在PBS透析至少4小時。用PEG20000濃縮至濃度為lmg/ml，經液氮冷激后于-80°C冰箱保存。最終獲得蛋白的量為0. Smg0SDS-PAGE驗證獲得的是高純度的蛋白，蛋白純度> 95%見附圖2。
權利要求
1.一種采用真核表達并純化人源化抗血管內皮生長因子單克隆重組抗體 (Anti-VEGF)的簡便化方法，其特征在于該方法通過如下步驟用真核表達并純化人源化抗血管內皮生長因子單克隆重組抗體(Anti-VEGF)人源化抗血管內皮生長因子單克隆重組抗體的真核表達，Protein A親和層析純化抗體。
2.如權利要求1所述的采用真核表達并純化人源化抗血管內皮生長因子單克隆重組抗體(Anti-VEGF)，特征在于所述的Anti-VEGF是通過真核表達并純化的。
3.如權利要求1所述的采用真核表達并純化人源化抗血管內皮生長因子單克隆重組抗體(Anti-VEGF)，特征在于所述的Anti-VEGF的表達為分泌性的可溶性蛋白。
4.如權利要求1所述的采用真核表達并純化人源化抗血管內皮生長因子單克隆重組抗體(Anti-VEGF)，特征在于所述的Anti-VEGF作為生物制劑應用于研究和臨床診斷。
全文摘要
本發明涉及真核表達并純化人源化抗血管內皮生長因子單克隆重組抗體(Anti-VEGF)的簡便化方法。本發明的目的在于實現人源化抗血管內皮生長因子單克隆重組抗體在真核細胞中的大量表達，并通過簡化的純化步驟，獲得純度較高抗體。在工業生產中滿足生產周期短，生產成本低，產量高的總體要求。
文檔編號C12N15/13GK102344926SQ201110274419
公開日2012年2月8日 申請日期2011年9月16日 優先權日2011年9月16日
發明者朱月珍, 楊宣武, 柴笑梅, 江永海 申請人:江蘇普羅賽生物技術有限公司