專利名稱：單鏈非編碼MicroRNA及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種MicroRNA的乙肝重癥病人血漿中的表達水平及其在診斷乙型肝 炎重癥化中的作用。
背景技術：
目前全球估計有3. 5億慢性乙肝病毒(HBV)攜帶者，有三分之一的人口感染過 HBV0在我國，乙型肝炎是最為嚴重、最廣泛的傳染病之一，感染率高達60%，約有1. 2億人 攜帶HBV。乙型肝炎的發病率居傳染病首位，死亡數居傳染病第三位。乙肝重型肝炎是一類表現為短期大量肝細胞壞死導致肝功能衰竭的綜合癥，其死 亡率極高，發展迅速，兇險而且臨床預后差。并嚴重威脅人們身體健康的肝疾病，因此，早期 診斷，以便及時采取有效的治療措施尤其重要。MicroRNA是由機體內源基因轉錄的約70nt的發夾狀結構前體(pre-MicroRNA)被 Dicer酶切割后產生的約22nt的非編碼單鏈RNA片段，在進化過程中高度保守，能通過與靶 基因mRNA特異性的堿基互補配對，引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻譯，廣泛地負調控 靶基因的表達。MicroRNA作為一種新的基因干預工具，具有高效、特異、快速等優點，為基因 調控的研究和基因治療的發展帶來了新的視角。MicroRNA非常穩定，用于臨床診斷試劑的 研發具有重復性好、容易操作等優點。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種利用單鏈非編碼MicroRNA let-7a-l制備診 斷試劑盒以診斷重癥肝炎。為了解決上述技術問題，本發明提供一種單鏈非編碼MicroRNA，單鏈非編碼 MicroRNAlet-7a-l 為 SEQ ID NO 1 所示的序列。本發明還同時提供了上述單鏈非編碼MicroRNA let-7a_l在制備診斷乙型重癥肝 炎的診斷試劑中的應用。本發明還同時提供了一種用于診斷乙型重癥肝炎的試劑盒，包括PCR試劑、探針、 上游引物和下游引物；探針為SEQ ID NO :5所示的序列，上游引物為SEQ ID NO :3所示的 序列，下游引物為SEQ ID NO :4所示的序列。作為本發明的用于診斷乙型重癥肝炎的試劑盒的改進PCR試劑為 IXTaqManUniversal PCR MasteMix。MicroRNA是一類高度保守的單鏈RNA(約22個核苷酸)，生物信息學分析表明， 每個microRNA可能調節數百個靶基因，提示microRNA可能參與調節細胞生命活動中眾多 的信號轉導途徑，在細胞增殖、分化、凋亡、免疫反應及血管生成等一系列過程中發揮作用。 另外，MicroRNA的異常表達將會導致生理的異常和疾病的產生，相反疾病的產生也將導致 MicroRNA的表達水平的改變，人們可以利用它來反映疾病的程度并做出相應的治療。MicroRNA序列測定相對簡單，通過基因工程技術可以比較容易地分離純化人類外周血中存在的MicroRNA，并對其進行測序。到目前為止已經報道了超過800個MicroRNA序 列，但是由于MicroRNA功能的復雜性，大部分MicroRNA的功能和用途仍屬未知，因此，尋找 和開發有用的MicroRNA用于臨床診斷和治療是當前研究熱點。美國應用生物系統公司根 據目前的研究現狀研發了 MicroRNA芯片(TaqMan MicroRNA Arrays)，它包含大部分已知 的MicroRNA的反轉錄引物，利用該芯片可以檢測出已知序列的這些MicroRNA表達水平的 變化情況。本發明利用該芯片對乙型肝炎重癥患者血漿中MicroRNA進行檢測，以正常人為 對照，對患者作一個比較全面的MicroRNA圖譜，從中找出與乙型肝炎重癥化病情變化密切 相關的MicroRNA分子。利用該分子可研發預測和診斷肝炎重癥化診斷試劑。在本發明中，發明人通過檢測乙型肝炎重癥患者血漿中MicroRNA let-7a-l的表 達水平，觀察乙型肝炎重癥狀態下MicroRNA的改變情況。本發明選取正常人和已被確診為 乙型肝炎重癥患者的血漿，從血漿中提取RNA，利用MicroRNA表達譜芯片(美國應用生物 系統公司 Taq Human MicroRNA Array A(B))對 MicroRNA 進行分析。結果發現，MicroRNA let-7a-l在乙型肝炎重癥患者血漿中顯著上調，S卩，該MicroRNA在乙型肝炎重癥患者血漿 中表達較正常人明顯增高。提示MicroRNA let-7a_l在乙型肝炎重癥化中起著重要的調控 作用，同時該MicroRNA可以作為乙型肝炎重癥化的診斷標志物。采用本發明的方法來早期診斷乙型肝炎重癥化，具有如下優點本發明確認了 MicroRNA let-7a-l作為診斷乙肝重型肝炎的潛在靶點，能用于快 速檢測和診斷。microRNA在血漿和血清中非常穩定，它們有效保護以免接觸RNases，在嚴酷環境 的條件下仍能保持穩定。因此，它們的穩定性使得其實際值與在病人身上得到的測試值吻 合的很好。血清中microRNA表達譜的檢測技術已經成熟，目前研究microRNA表達譜的常 用技術主要有Northern雜交、表達芯片、實時熒光定量PCR和Solexa測序等，方法快速、便 捷，精確度和靈敏度可滿足臨床需求。血清microRNA作為臨床診斷和預后的標志物，主要有以下優點檢測的損傷小、 穩定性好、靈敏度高，可應用于疾病早期變化的檢測。目前尚未見用于診斷乙型肝炎重癥 化的microRNA，但是microRNA用于診斷其他疾病已經獲得許多令人鼓舞效果例如血漿 miR-92被成功用作結直腸癌的分子標志物，靈敏度可達89 %，特異性達到70 %，且腫瘤切 除后miR-92的表達量較術前顯著降低；早期診斷可以大大提高生存率和改善預后。


下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖1是MicroRNA表達譜芯片檢測結果，正常人中MicroRNA let-7a_l幾乎不表達， 而乙型肝炎重癥患者則明顯的高表達。
具體實施例方式實施例1血漿中總RNA的提取選取浙江大學醫學院附屬第一醫院，乙型肝炎重癥患者4例，同時選取4例年齡、 性別相匹配的正常人，抽取細1全血；即抽取乙型肝炎重癥患者的全血、正常人的全血各4 例。以TOsnRNA作為內參，MicroRNA的相對表達水平用表示，檢測方法相同。實時熒光定量PCR根據美國應用生物系統公司提供的TaqMan MicroRNA Arrays進行操作。為了減少個體差異我們把不同組的血漿進行混合(即，4例患者的血漿進行混合， 4例正常人的進行混合)。利用mirVana PARIS Kit來從血漿樣品中提取總RNA，提取方 法根據該試劑盒的說明書操作，過程依次如下1.將血漿樣品(最大體積625 μ L)(冰上凍融)與等體積的2Χ Denaturing Solution室溫混勻。如果血漿樣品少于lOOul，先加Cell Disruption Buffer到彡100 μ L， 再加入等體積的2X Denaturing Solution，立刻充分混勻(渦旋30s)，冰上孵育5min。2.加入試劑盒中所提供的酸化的酚/氯仿到上述混合液。3.渦旋震蕩30-60s混勻。4.室溫10，OOOXg離心5min分離出水相和有機相(水相在上層)。5.轉移位于上層的水相到新的EP管，并標注體積。6.加入水相1. 25倍體積的100%乙醇(室溫)到水相，充分混勻。7.將過濾柱置于Collection Tube (收集管)中，吸取裂解物和乙醇的混合物(即步驟6所得)到過濾柱上。8. 10，000 Xg 離心 30s。9.棄濾液，重復離心，直到所有的裂解物/乙醇混合物都濾過過濾柱為止。將過濾 柱重新置于收集管中。加入700yL MicroRNA Wash Solution 1到過濾柱。10，OOOXg離 心 15s。10.棄濾液，置過濾柱到相同的收集管。11.加入 500 μ L Wash Solution 2/3 到過濾柱。10，000 X g 離心 15s，棄濾液，置 過濾柱到相同的收集管。12.重復步驟11。13. 10，000X g 空離 Imin014.轉移過濾柱到新的收集管。15.加入IOOyL預熱(95 °C )的洗脫液或者無核酶水到過濾柱中央，閉蓋， 10，OOOXg離心30s，棄柱，收集總RNA，-20°C保存或更低溫度保存。以下實施例中所用的試劑均為常規試劑，能通過市購的方式獲得，例如，可購自美 國ABI公司。實施例2預擴增1.進行逆轉錄(RT)(1)凍融以下試劑Megaplex RT PrimersTaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit componentSMgCl2反應體系3 μ L (1 to 350ng) total RNA (實施例 1 所得)4. 5μ L of RT reaction mix(如表 1)(2)混合以下試劑(如表1所述)到1. 5ml微離管。表 1Megaplex TM RT primers (IOX)0.8
dNTPs with dTTP(IOOmM)(λ2
MulL丄Sor丄be TM Reverse
1. 5
Transcriptase(50U/ul)
IOXRT BufferoT§
MgCi2 (25mM)(λ9
RNase Inhibitor (20 U/ul)(Π
Nuclease-free water0.2
總體積(3)倒置管6次以混勻，稍微離心一下數秒。(4) ^96-well MicroAmp Optical Reaction Plated MicroAmp 8-Tube Strip 中，吸取4. 5 μ L RT反應混合物到各孔或管。(5)加入3 μ L(lto 350ng)總RNA到含有RT反應混合物的各孔或管，得到7. 5ul 體積的混合液。(6)用 MicroAmp Clear Adhesive Film 或 MicroAmp Optical Strip Caps 封 口，接著倒置板或管6次以混勻，稍微離心一下。(7)冰浴 5min。(8)設置以下RT運行條件(表2)，反應體積7· 5 μ 1。表 2
、Hm
40個循環 6 ^
42 Im
50°C1 s
85 ^
4Τ獲得的cDNA可以-15to_25°C保存一周以上。2.預擴增反應預擴增反應體積25 μ L 2. 5 μ L RT產物(即上述RT步驟所得的cDNA)22. 5μ L PreAmp reaction mix(如下表 3 所示)(1)冰上凍融 Megaplex PreAmp Primers，倒置管 6 次以混勻。
(2)回蕩瓶以混勻 TaqMan PreAmp Master Mix(2X)。(3)混合以下試劑(表3)到1. 5ml微離管。表 權利要求
1.單鏈非編碼MicroRNA，其特征是單鏈非編碼MicroRNAlet-7a-l為SEQID N0:1所 示的序列。
2.如權利要求1所述的單鏈非編碼MicroRNA在制備診斷乙型重癥肝炎的試劑盒中的應用。
3.一種用于診斷乙型重癥肝炎的試劑盒，其特征是包括PCR試劑、探針、上游引物和 下游引物；所述探針為SEQ ID NO :5所示的序列，上游引物為SEQ ID NO :3所示的序列，下 游引物為SEQ ID NO :4所示的序列。
4.根據權利要求3所述的用于診斷乙型重癥肝炎的試劑盒，其特征是所述PCR試劑 % 1X TaqMan Universal PCR MasteMix。
全文摘要
本發明公開了一種單鏈非編碼MicroRNAlet-7a-1，為SEQIDNO1所示的序列。本發明還同時公開了上述單鏈非編碼MicroRNAlet-7a-1在制備診斷乙型重癥肝炎的試劑盒中的應用。本發明還同時公開了一種用于診斷乙型重癥肝炎的試劑盒，包括PCR試劑、探針、上游引物和下游引物；探針為SEQIDNO5所示的序列，上游引物為SEQIDNO3所示的序列，下游引物為SEQIDNO4所示的序列。
文檔編號C12Q1/68GK102127547SQ20101060596
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月27日 優先權日2010年12月27日
發明者劉東成, 李淑萍, 鄭敏, 陳 峰, 陳智 申請人:浙江大學