專利名稱：發酵萎縮芽孢桿菌制備Bacillamide C的培養基及其制備及應用方法
技術領域：
本發明涉及的是一種細菌培養技術領域的培養基及其制備，具體是一種發酵萎縮 芽孢桿菌制備Bacillamide C的培養基及其制備及應用方法。
背景技術：
與陸地生物相比，海洋生物生活于高鹽、高壓、低溫、稀營養等條件嚴苛的環境中。 為求生存，很多海洋生物在長期的進化過程中產生一些結構獨特的化學物質。從海洋生物 中已發現多種活性物質，包括抗腫瘤化合物、腫瘤促進劑、抗炎癥/過敏化合物、抗菌、抗病 毒化合物、生物毒素、抗寄生蟲化合物、多不飽和脂肪酸等，其中相當部分生物活性物質是 陸地生物所沒有的。這些海洋生物活性物質具有種類繁多、結構特異復雜等特點。在眾多 海洋生物中，海綿是目前發現活性物質最豐富的海洋生物之一，人們對海綿活性物質寄予 極大的希望，但海綿體內的活性物質含量很低，捕撈海綿資源有限，藥源的供給不足使得海 綿藥物開發明顯滯后。為尋找穩定可靠的藥源，進行大規模生產，開展相關海綿共附生微生 物的研究是迫切而重要的工作。經過對現有技術的檢索發現，于璐璐等(Lu-Lu Yu et al.，Helvetica Chimica Acta2009 ；92 607-611)從來自中國南海的貪婪倔海綿萎縮芽孢桿菌Bacillus atrophaeus C89菌液的乙酸乙酯萃取物中，分離到一種結構較新的化合物Bacillamide C。 Bacillamides家族化合物及其衍生物已被證實對多環旋溝藻、藍藻和微藻有不同程度的抑 制作用。藻類引起的赤潮和水華對生態、經濟和人類健康的威脅日益嚴重，因而該家族作為 潛在的抑藻劑有很高的研究價值和應用價值。

發明內容
本發明針對現有技術存在的上述缺點，提供一種發酵萎縮芽孢桿菌制備 Bacillamide C的培養基及其制備及應用方法，不僅能滿足搖瓶實驗的需要，亦能滿足發酵 罐發酵大量制備Bacillamide C的要求。本發明是通過以下技術方案實現的本發明涉及一種用于萎縮芽孢桿菌的培養基，其組分及含量為3.64g/L玉米淀 粉、6. Og/L胰蛋白胨、6. 29g/L碳酸鈣、4. Og/L大豆蛋白胨、0. 10g/L半胱氨酸和0. 02g/L色 氨酸，溶劑為人工海水。所述的人工海水的組份及含量為26. 518g/L的NaCl、2. 447g/L的MgCl2、3. 305g/ L 的 MgSO4U. 141g/L 的 CaCl2、0. 725g/L 的 KC1、0. 202g/L 的 NaHCO3 以及 0. 083g/L 的 NaBr， 溶劑為Millpore超純水，該人工海水的pH 7. 0-7. 2。本發明涉及上述用于萎縮芽孢桿菌培養基的制備方法，包括以下步驟第一步、配制人工海水分別將NaCl、MgCl2、MgS04、CaCl2、KCl、NaHC03 以及 NaBr 溶 解于超純水中后進一步混合。
第二步、在人工海水中加入玉米淀粉并加熱煮沸糊化，然后依次加入胰蛋白胨、大 豆蛋白胨和碳酸鈣并攪拌溶解，然后進行高溫殺菌得到培養基。所述的攪拌溶解過程中不斷補充純水補足玉米淀粉蒸煮過程中失去的水分。所述的高溫殺菌是指在121°C環境下滅菌20分鐘。本發明涉及上述培養基的應用方法，通過將半胱氨酸和色氨酸溶解于人工海水中 配成混合氨基酸溶液并采用過濾膜進行過濾，然后將所述培養基對發酵萎縮芽孢桿菌進行 發酵培養，在發酵培養過程中添加過濾后的混合氨基酸溶液，實現萎縮芽孢桿菌產量的優 化。所述的混合氨基酸溶液中含有半胱氨酸0. 10g/L以及色氨酸0. 02g/L。采用本發明方法成功的對萎縮芽孢桿菌產Bacillamide C的培養基成分進行了優 化。在搖瓶水平上，將菌種分別接種到基本培養基和最優培養基中，比較兩種培養基中菌種 的生長情況和產Bacillamide C的情況。在最優培養基中發酵96h的Bacillamide C的產量達到22. 797mg/L，是在未優 化的基本培養基中產量(2.746mg/L)的8. 3倍。這表明，在搖瓶水平上，單菌產目標產物 的能力明顯提高。之后使用最優培養基的成分配比在5L發酵罐上進行放大培養初試。由 于部分物理條件的改變，最大菌濃度進一步增至2. 385X 109/ml，是搖瓶發酵最大菌濃度 (1.78 XlOVml)的1.34倍。菌體生長期的縮短使得5L罐上發酵的總時長為72h，較之搖瓶 發酵所需的96h縮短了 24h，但5L罐上發酵72h的Bacillamide C產量為34. 80mg/L,是搖 瓶發酵96h Bacillamide C產量(22. 797mg/L)的1. 53倍，是培養基優化前2. 746mg/L的 12. 7倍。本發明所得到的培養基成分不僅能滿足搖瓶實驗的需要，亦能滿足發酵罐發酵的 要求。


圖1萎縮芽孢桿菌發酵Bacillamide C產量在基本培養基和最優培養基中的對比 圖。圖2萎縮芽孢桿菌采用最優培養基在5L發酵罐上培養的發酵動態監測圖。
具體實施例方式下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施 例。以下實施例中涉及的Bacillamide C的具體為萎縮芽孢桿菌Bacillus atrophaeus菌株(學名)，其保藏信息/公開獲得渠道為該菌株16S rRNA序列與多株萎 縮芽孢桿菌的16S rRNA序列完全一致，萎縮芽孢桿菌在早稻田(北京)生物科技發展有限 公司銷售。 1、四種基本培養基的配制。1)牛肉膏蛋白胨培養基10g胰蛋白胨，5g牛肉膏溶解于IL人工海水；2) LB培養基10胰蛋白胨，5g酵母膏溶解于IL人工海水；3)M2216培養基5g胰蛋白胨，Ig牛肉膏溶解于IL人工海水；
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4)自制培養基5g玉米淀粉用IL人工海水煮沸糊化，加入5g胰蛋白胨和5g大豆 蛋白胨，攪拌溶解，以適量的純水補足玉米淀粉蒸煮過程中失去的水分至1L。加入5g碳酸 鈣。以上四種培養基皆于121°C滅菌20min。分別以上述四種培養基進行發酵，菌種接種量為1 % (ν/ν)，在250mL三角瓶中裝 液量IOOmL,在28°C、150rpm的恒溫搖床中培養96h，pH自然。采用HPLC法測定Bacillamide C含量，以上四種培養基中Bacillamide C含量分 別為-.2. 414mg/L, 1. 860mg/L, 1. 306mg/L和2. 746mg/L。由此得到比較好的基本培養基配方 (配方1)為5g/L玉米淀粉，5g/L大豆蛋白胨，5g/L胰蛋白胨，5g/L碳酸鈣，人工海水配制， PH自然。以配方1進行發酵，Bacillamide C產量為2. 746mg/L。2、培養基中氨基酸前體的添加。在配方1的基礎上，通過單因素實驗確定半胱氨 酸、丙氨酸和色氨酸單獨添加時的最佳時間和濃度。對每種氨基酸，分別于發酵起始、遲滯 期末、對數期中期、穩定期起始、穩定期開始后20h、穩定期開始后40h單獨添加到IOOml發 酵液中，添加濃度為100mg/L發酵液，測定Bacillamide C產量的變化。而后在最佳添加時 間的基礎上，對每種氨基酸分別用20mg/L發酵液、60mg/L發酵液、100mg/L發酵液、140mg/L 發酵液、180mg/L發酵液作為添加濃度添加到IOOml發酵液中，測定Bacillamide C產量的 變化。實驗結果表明半胱氨酸和色氨酸于穩定期開始后40h添加最佳，最佳添加濃度 均為100mg/L發酵液，Bacillamide C產量分別達到7. 472mg/L和6. 360mg/L ；丙氨酸于穩 定期起始添加最佳，最佳添加濃度為100mg/L發酵液，Bacillamide C產量達到7. 315mg/L。 從而得到最佳培養基的(配方2)組分為5g/L玉米淀粉，5g/L大豆蛋白胨，5g/L胰蛋白胨， 5g/L碳酸鈣，0. lg/L半胱氨酸(穩定期開始后40h添加)，0. lg/L色氨酸(穩定期開始后 40h添加)，0. lg/L丙氨酸(穩定期起始添加)，人工海水配制，pH自然。3、應用Plackett-Burman設計和響應曲面法確定最優培養基。在配方2的基礎上，首先應用Plackett-Burman設計挑選出對Bacillamide C產 量影響較大的因素玉米淀粉、丙氨酸、碳酸鈣、半胱氨酸。它們的添加量水平如表1所示表IPlackett-Burman實驗中各因素的高低值
權利要求
一種用于萎縮芽孢桿菌的培養基，其特征在于，其組分及含量為3.64g/L玉米淀粉、6.0g/L胰蛋白胨、6.29g/L碳酸鈣、4.0g/L大豆蛋白胨、0.10g/L半胱氨酸和0.02g/L色氨酸，溶劑為人工海水。
2.根據權利要求1所述的用于萎縮芽孢桿菌的培養基，其特征是，所述的人工海水 的組份及含量為=26. 518g/L 的 NaCl,2. 447g/L 的 MgCl2,3. 305g/L 的 MgSO4U. 141g/L 的 CaCl2、0. 725g/L 的 KC1、0. 202g/L 的 NaHCO3 以及 0. 083g/L 的 NaBr，溶劑為 Millpore 超純 水，該人工海水的pH 7. 0-7. 2。
3.一種根據權利要求1所述的培養基的制備方法，其特征在于，包括以下步驟第一步、配制人工海水分別將NaCl、MgCl2、MgSO4, CaCl2, KC1、NaHCO3以及NaBr溶解于超純水中后進一步混合；第二步、在人工海水中加入玉米淀粉并加熱煮沸糊化，然后依次加入胰蛋白胨、大豆蛋 白胨和碳酸鈣并攪拌溶解，然后進行高溫殺菌得到培養基。
4.根據權利要求3所述的培養基的制備方法，其特征是，所述的攪拌溶解過程中不斷 補充純水補足玉米淀粉蒸煮過程中失去的水分。
5.根據權利要求3所述的培養基的制備方法，其特征是，所述的高溫殺菌是指在121°C 環境下滅菌20分鐘。
6.一種根據上述任一權利要求所述的培養基的應用方法，其特征在于，通過將半胱氨 酸和色氨酸溶解于人工海水中配成混合氨基酸溶液并采用過濾膜進行過濾，然后將所述培 養基對發酵萎縮芽孢桿菌進行發酵培養，在發酵培養過程中添加過濾后的混合氨基酸溶 液，實現萎縮芽孢桿菌產量的優化。
7.根據權利要求6所述的培養基的應用方法，其特征是，所述的混合氨基酸溶液中含 有半胱氨酸0. 10g/L以及色氨酸0. 02g/L。
全文摘要
一種細菌培養技術領域的發酵萎縮芽孢桿菌制備Bacillamide C的培養基及其制備及應用方法，該培養基的組分及含量為3.64g/L玉米淀粉、6.0g/L胰蛋白胨、6.29g/L碳酸鈣、4.0g/L大豆蛋白胨、0.10g/L半胱氨酸和0.02g/L色氨酸，溶劑為人工海水。本發明不僅能滿足搖瓶實驗的需要，亦能滿足發酵罐發酵大量制備Bacillamide C的要求。
文檔編號C12R1/07GK101948891SQ201010278110
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月10日 優先權日2010年9月10日
發明者張風麗, 李志勇, 金靚婕 申請人:上海交通大學