專利名稱：具有使用蔗糖作為碳源能力的重組微生物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種能夠代謝蔗糖的重組微生微，尤其涉及一種其中引入了編碼蔗糖 磷酸轉移酶的基因和/或編碼蔗糖-6-磷酸水解酶的基因的能夠代謝蔗糖的重組微生物或 者其中引入了編碼呋喃果糖苷酶的基因的能夠代謝蔗糖的重組微生物。
背景技術：
為了人類的可持續發展，人們正以極大的興趣積極地進行用于從可再生生物資源 生產有用化合物的工業生物技術發展的研究。迄今為止進行的利用微生物發酵的化學物 質的生產都是以葡萄糖作為主要原料的。然而，利用微生物發酵的化學產品的生產難以商 業化，因為葡萄糖價格昂貴且從而利用微生物發酵生產的化合物的價格高于以原油為主要 原料通過化學合成生產的化合物。因此，為發展使用昂貴的葡萄糖作為碳源的替代方法， 人們正在積極地進行能夠從充足的生物資源獲得的各種廉價碳源的探索的研究。例如，包 括本發明發明人的多數研究者正在進行使用相對廉價的原料如木質纖維素水解物、甘油、 乳清、玉米漿液或類似物的各種主要代謝物的生產的研究(Samuelov等，Appl. Environ. Microbiol. ,65 2260,1999 ；Lee 等，Appl. Microbiol. Biotechnol. ,54 23,2000 ；Lee 等 人，Biotechnol. Bioeng. ,72 41,2001 ；Lee 等，Biotechnol. Lett. ,25 111,2003 ；Lee 等， Bioproc. Biosystems Eng. ,26 :63，2003)。但是，根據目前為止所公布的研究結果表明，當 使用所述原料替代葡萄糖作為碳源時，與使用葡萄糖作為碳源時相比所需的代謝產物的生 產率或產量顯著地低。因此，迫切地需要進行研究和發展來克服這個缺點。蔗糖(俗稱糖)是一種有葡萄糖和果糖組成的雙糖，而它是自然界中非常充足且 能夠從所有具有光合作用能力的植物所生產的碳源。特別是甘蔗和甜菜含有大量的蔗糖， 且世界上60%以上的蔗糖正在由甘蔗產生。特別是蔗糖生產的成本非常低，因為其能夠 通過對機械壓榨甘蔗的提取物進行蒸發/濃縮的簡單工藝而工業化生產。Koutinas等人 在2004年基于葡萄糖的含量，對可用于化學物質的微生物生產的各種原料的價格進行了 計算。結果，基于IKg葡萄糖含量的蔗糖的價格為26. 1美分，這是非常低廉的價格，相當 于小麥價格的77%、糖蜜價格的50%、蔗糖價格的28. 9% (Koutinas等人，Ind. Crops和 Products,20 75,2004)。關于國際糖協定的每日價格的報告表明蔗糖的價格在1994-1995年達到頂峰之 后由于供給過剩而處于穩步下降的趨勢且這種下降趨勢預計將繼續下去。因此，蔗糖作為 代替昂貴的葡萄糖的最有效的碳源而備受矚目，葡萄糖目前通過微生物發酵來生產各種化 學物質。尤其是，本領域技術人員公知將葡萄糖的生產成本降低到蔗糖的水平是非常困難 的，因為葡萄糖主要從玉米淀粉中生產，其通過非常復雜的工藝，包括從玉米中提取淀粉、 熱/化學預處理淀粉、通過酶反應將淀粉轉化為葡萄糖、和純化葡萄糖，而且玉米的價格不 斷在上升。基于這些原因，在美國以玉米為原料的生物乙醇的生產逐漸減少(Mae-Wan Ho, Science in Society，33 :40，2007)，但在巴西以甘蔗(即蔗糖)為原料的生物乙醇的生產 快速增長。
迄今為止，對以蔗糖為碳源的有用化合物生產的研究，通過有關可生物降解聚合 物(Lee 等人，Biotechnol. Lett.，15 :971，1993 ；Lee 等人，Biotechnol. Techni ques, 1 59，1997)、檸檬酸(Forster 等人，App. Microbiol. Biotechnol. ,75 1409，2007)、丙酮、丁 醇、乙醇和異丙醇(George 等人，Appl. Environ. Microbiol. ,45 1160，1983 ；Durre, Appl. Microbiol. Biotechnol. ,49 :639，1998)、衣康酸(Kautola 等人·，Biotechnol. Lett.，11 313，1989)、黃原膠(Letisse 等人，Appl. Microbiol. Biotechnol. ,55 417,2001)等的高濃 度細胞培養而進行。特別是，分析國際生物能源和生物燃料貿易的國際能源機構(IEA)生 物能源第40項任務的報告(2006)評估認為，巴西的從甘蔗生產生物乙醇是環境友好型且 可持續發展的生物燃料生產的典范。以蔗糖作為原料通過微生物發酵生產的化合物價格低廉且起到保護細胞膜遠離 含有大量所需代謝物的外部環境，因此產生高濃度的所需代謝物。Kilimarm等人將微生物 在致死溫度下暴露于含有蔗糖和不含蔗糖的培養基中然后檢測它們的活性和蛋白質的二 級結構(Biochimica et Biophysica Acta，1764，2006)。研究結果顯示暴露在含有蔗糖的培養基中的微生物細胞中的蛋白質的二級結構 保存良好，但是暴露在含有蔗糖的培養基中的微生物細胞中的蛋白質的二級結構具有較大 的改變。特別是，暴露在含有蔗糖的培養基中的微生物的活性顯著高于暴露在不含蔗糖的 培養基中的微生物。這直接證明了蔗糖具有保護微生物遠離有害的外部環境的作用。盡管蔗糖是具有上述包括價格低廉且具有保護微生物遠離有害的外部環境的作 用等優點的優良的原料，一個例子顯示了以蔗糖作為碳源成功生產所需化合物的過程，而 他們的商業應用則仍沒有報道。這是因為大量的微生物沒有將蔗糖輸送到細胞內、將輸送 到的蔗糖降解并將降解產物連接到糖酵解的完善機制，因此不能使用蔗糖作為碳源。即使 在具有能夠使用蔗糖的機制的微生物中，他們也不能有效地生產所需的代謝產物，因為以 蔗糖為碳源的攝取率和降解率很低。為了以產業經濟的方式進行利用微生物發酵生產各種化合物，需要利用廉價原料 如上面描述的蔗糖。此外，需要識別能夠高效率有效攝取和降解以蔗糖為碳源的酶和能夠 使用上述酶的研發技術。特別是，鑒于事實上通過微生物發酵生產的化合物中，原料價格占 去最終產物價格的50%，所以迫切需要識別能夠有效利用蔗糖作為廉價原料的酶且發展所 述酶的應用。已經有報道，蔗糖通過高濃度細胞培養可用于生產各種生物制品，其包括可生物 降解聚合物、檸檬酸、衣康酸、丙酮、丁醇、乙醇、異丙醇和黃原膠。然而，通過微生物發酵成 功生產所需化合物和它們的實際上商業應用的例子很少有報道。因此，為了使通過微生物發酵生產各種化合物作為一項環境友好型技術成功地在 工業中應用，需要能夠有效地攝入和降解如蔗糖的廉價和充足的碳源的微生物的發展。

發明內容
因此本發明的一個目的在于提供能夠以蔗糖作為碳源的新的蔗糖代謝相關基因， 以及由所述基因編碼的酶。本發明的另一目的在于提供一種其中導入了蔗糖代謝相關基因的能夠代謝蔗糖 的重組微生物，以及使用所述微生物生產代謝產物、可生物降解聚合物或重組蛋白質的方法。為了達到 上述目的本發明提供具有序列號1的氨基酸序列的蔗糖磷酸轉移酶、 編碼所述蔗糖磷酸轉移酶的基因(PtsG)以及含有所述ptsG基因和編碼蔗糖-6-磷酸水解 酶的基因(sacC)的重組載體。本發明還提供能夠代謝蔗糖的一種重組微生物，其中所述基因導入到選自下組中 的宿主細胞，所述組由細菌、酵母和真菌組成；以及生產代謝產物、可生物降解聚合物或重 組蛋白質的方法，所述方法包括在含有以蔗糖作為碳源的培養基中培養所述重組微生物。本發明還提供一種β -呋喃果糖苷酶，其具有將β -D-呋喃果糖苷鍵水解以釋放 果糖的活性；以及編碼所述呋喃果糖苷酶的基因。本發明還提供一種能夠代謝蔗糖的重組微生物，其中所述基因導入到選自下組的 宿主細胞，所述組由細菌、酵母和真菌組成；以及生產代謝產物、可生物降解聚合物或重組 蛋白質的方法，所述方法包括在含有以蔗糖作為碳源的培養基中培養所述重組微生物。本發明的其他特征和方面通過以下詳細說明和附屬的權利要求將更加明確。


圖1是源自Μ. succiniciproducens MBEL55E的新的能夠代謝蔗糖的代謝相關酶 (蔗糖磷酸轉移酶、蔗糖-6-磷酸水解酶和果糖激酶)導入到不能代謝蔗糖的微生物中時， 蔗糖被攝取和降解以及所述降解產物通過糖酵解代謝的途徑的示意圖。粗箭頭(一)表示 引入源自M. succiniciproducens MBEL55E的新的代謝相關酶所參與的代謝途徑；以及細 箭頭(一)表示重組微生物原來的代謝途徑。圖2是當所述酶導入到不能代謝蔗糖的微生物中時，源自M. succiniciproducens MBEL55E的新的能夠代謝蔗糖的β _呋喃果糖苷酶參與蔗糖代謝的4個可能的途徑的示意 圖。粗箭頭(一)表示源自Μ. succiniciproducens MBEL55E的新的β -呋喃果糖苷酶將 參與的4個可能的途徑；以及細箭頭(一)表示重組基因原來的代謝途徑。圖3是含有編碼蔗糖磷酸轉移酶、蔗糖-6-磷酸水解酶和果糖激酶的基因(ptsG、 sacC和rbsK)的重組載體pMSscrIIA的圖譜。圖4是親本MBEL55E、重組MptsG菌株和重組MsacC菌株在蔗糖培養基中生長的圖 表(· :MBEL55E ;▲ =MptsG ；和Δ =MsacC)。圖5是重組載體pTacl5K的酶切圖譜。圖6是含有編碼蔗糖-6-磷酸水解酶基因的重組載體pTacl5K的酶切圖譜。圖7是重組大腸桿菌W3110pTacl5K在含有蔗糖的M9培養基中生長的圖表(含· 的實線蔗糖濃度；含 的實線0D_)。圖8是具有代謝蔗糖的能力的本發明重組大腸桿菌W3110pTacl5K在含有蔗糖的 M9培養基中生長的圖表(含·的實線蔗糖濃度；含 的實線=OD6tltl ；含有 點線葡萄糖 的濃度；含有▼的點線醋酸的濃度)。圖9是大腸桿菌W3110pTacl5KEWcscA和大腸桿菌W3110pTacl5KBSsacA在含有蔗 糖的M9培養基中生長的圖表(含·的實線大腸桿菌W3110pTaC15KEWCSCA ；和含▲的實 線大腸桿菌 W3110pTacl5KBSsacA)。圖10是本發明的在厭氧條件下發酵，能夠代謝蔗糖的大腸桿菌W3110pTacl5KsacC的生長和代謝產物的圖表(含有 的實線蔗糖濃度；含有Δ的實線 OD600 ；含有▼的實線葡萄糖濃度；含有■的實線果糖濃度；含有眷的點線琥珀酸濃度； 含有▽的虛線乳酸；含有■的虛線甲酸濃度；含有 的點線醋酸濃度；和含有▲的點 線乙醇濃度)。
具體實施方式

本發明的目的在于以蔗糖(俗稱糖)作為廉價且充足的碳源制備生物制品，特別 是發現了能夠使用蔗糖作為碳源的微生物或者使不能使用蔗糖作為碳源的微生物變為能 夠使用蔗糖的酶，另外目的是使用所述酶生產生物制品。蔗糖是由葡萄糖和果糖組成的雙糖，是全球豐富的碳源。它由具有光和作用的大 多數植物產生，特別是，甘蔗和甜菜是含有大量蔗糖的熱帶和亞熱帶植物。蔗糖可以通過對 機械壓榨甘蔗的提取物進行蒸發/濃縮的簡單工藝而工業化生產，且目前全球60%以上的 蔗糖由甘蔗產生。根據Koutinas等人的論文(2004年出版)，他們基于葡萄糖含量計算了 可用于微生物發酵的各種原料的價格，基于IKg葡萄糖的蔗糖的價格為26. 1美分，這是葡 萄糖價格的1/4和小麥和糖蜜價格的1/2到2/3 (Koutinas等人，Ind. Crops和Products， 20 75,2004)。此外，有關近15年來國際糖協定的公布的蔗糖價格變動，蔗糖價格在1995 年達到13. 28美分/磅的頂峰之后下降到1999年的6. 27美分/磅，在2008年3月再次上 升到14. 20美分/磅且維持在2008年5月7號的12. 44美分/磅的水平，而且由于供給過 剩蔗糖的價格預計將有下降趨勢。除了成本這方面的優勢，蔗糖的優點還在于即使在食物 危機的情況下，例如最近的糧食危機，其也能夠穩定地供給，因為它不是從糧食中獲得。迄今為止，已經有報道稱蔗糖可通過高濃度細胞培養用于生產各種生物制品， 包括可生物降解聚合物、檸檬酸、衣康酸、丙酮、丁酮、乙醇、異丙醇和黃原膠(Lee等 人，Biotechnol. Lett.，15 :971，1993 ；Lee 等 人，Biotechnol. Techniques，1 :59，1997 ； Forster 等人，App. Microbiol. Biotechnol.，75 1409，2007 ；George 等人，Appl. Environ. Microbiol.，45 :1160，1983 ；Durre, Appl.Microbiol. Biotechnol.，49 :639，1998 ；Kautola 等人，Biotechnol. Lett.，11 :313，1989 ；Letisse 等人，Appl. Microbiol. Biotechnol.，55 417,2001)。這表明蔗糖應用的發展直接影響生物制品的有效生產。然而，盡管蔗糖具有各種優點，包括作為原料、起到防止蛋白質被修飾的作用和起 到保護細胞遠離外部環境的作用(Kilimann等人，Biochimica et Biophysica Acta, 1764, 2006)，許多例子顯示了以蔗糖作為碳源通過微生物發酵成功生產所需化合物的過程，而它 們的實際商業應用卻鮮有報道。原因之一是，大量的微生物不能有效生產所需的生物制品， 因為所述微生物不具有代謝蔗糖的機制或者即使具有這種機制，其代謝率也很低。因此，為 了通過作為環境友好型技術的微生物發酵生產各種化合物能夠成功地在工業上應用，需要 發展能夠有效地攝取和降解廉價且充足的碳源如蔗糖的微生物。為此，需要識別能夠高效 降解和代謝的酶以及應用所述酶。到目前為止，一些研究人員已經開發出能夠利用蔗糖的酶組。典型例子的包括 Ajinomoto公司的工藝，其中大腸桿菌來源的PTS (磷酸烯醇丙酮酸依賴型磷酸系統)和非 PTS蔗糖運輸系統被導入并用于生產氨基酸。這項工藝的特征在于，導入了與PTS或非PTS 相關的整個基因組而完成發明。
但是，在本發明中，基于Mannheimia succiniciproducens MBEL55E(KCTC 0769BP)的遺傳信息，發現了編碼酶(蔗糖磷酸轉移酶(PtsG，MS0784)、蔗糖-6-磷酸水解 酶(SacC, MS0909)和果糖激酶(RbsK，MS1233))的新基因(ptsG, sacC和rbsK)，其涉及將 蔗糖輸送到細胞內，降解輸送的蔗糖且將降解產物連接到糖酵解；并確定其序列和功能。因此，一方面本發明涉及到具有序列號1氨基酸序列的蔗糖磷酸轉移酶、具有序 列3氨基酸序列的蔗糖-6-磷酸水解酶和具有序列號5氨基酸序列的酸果糖激酶，他們 是參與將蔗糖輸送到細胞內、降解轉送的蔗糖且將降解產物連接到糖酵解的酶。本發明還 涉及一種編碼所述蔗糖磷酸轉移酶的基因(PtsG)、一種編碼所述蔗糖-6-磷酸水解酶的基 因(sacC)以及一種編碼所述果糖激酶的基因(rbsK)。 在本發明中，所述蔗糖磷酸轉移酶(PtsG)起到將蔗糖輸送到細胞內同時將蔗糖 轉化為蔗糖-6-磷酸的作用，蔗糖-6-磷酸水解酶(SacC)具有將蔗糖-6-磷酸轉化為葡萄 糖-6-磷酸和果糖的活性，且果糖激酶(RbsK)具有將果糖轉化為果糖-6-磷酸的活性。在本發明中，ptsG優選由序列號2的堿基序列表示，sacC優選由序列號4的堿 基序列表示，且rbsK優選由序列號6的堿基序列表示。特別是在本發明中構建了含有ptsG和sacC基因的重組載體，然后導入到不能使 用蔗糖作為碳源的大腸桿菌中，并將所述構建的重組大腸桿菌在含蔗糖作為唯一的碳源的 培養基中培養。結果，發現所述重組大腸桿菌具有了代謝蔗糖的能力。因此，如圖1所示，可以推斷蔗糖被蔗糖磷酸轉移酶(PtsG)輸送到細胞內同時 被轉化為蔗糖-6-磷酸，輸送到細胞內的所述蔗糖-6-磷酸被所述蔗糖-6-磷酸水解酶 (SacC)轉化為葡萄糖-6-磷酸和果糖，所述果糖被果糖激酶(RbsK)轉化為果糖_6_磷酸， 然后所述降解產物連接到糖酵解。同時，本發明的發明人示出了通過導入了蔗糖-6-磷酸水解酶(SacC，MS0909) 與其他編碼呋喃果糖苷酶的新基因(cscA和sacA)，不能代謝蔗糖的微生物能夠代謝 蔗糖，所述蔗糖-6-磷酸水解酶是源自 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP)的呋喃果糖苷酶，并示出了利用微生物菌株生產各種代謝產物的實例，從而完 成了本發明。換言之，基于Mannheimia succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP)，大腸 桿菌W和枯草芽孢桿菌的遺傳信息，發現了編碼涉及將蔗糖降解和將降解產物連接到糖酵 解的β-呋喃果糖苷酶的新基因(SacC，CSCA和sacA)，并確定這些基因的序列和功能。國 際生物化學和分子生物學聯盟命名委員會提供的EC編碼(酶學委員會編碼)(//WWW. iubmb. org/)是一個眾所周知的數值分類體系，其根據酶催化的化學反應進行分類。蔗糖-6-磷酸水解酶的正式名稱為β-呋喃果糖苷酶(EC 3.2. 1.26)且還具有其 他名字，包括β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶(β-D-fructofuranoside fructohydrolase)、 轉化酶(invertase)、蔗糖酶(saccharase)、葡聚糖蔗糖酶(glucansucrase)、β _h_ 果糖 苷酶(β-h-fructosidase)、β -果糖苷酶(β-fructosidase)、轉化酵素(invertin)、蔗 糖酶(sucrase)、蔗糖轉化酶(maxinvert)L 1000、果糖轉化酶(fructosylinvertase)、堿 性轉化酶(alkaline invertase)、酸性轉化酶(acid invertase) (http//www. chem. qmul. ac. uk/iubmb/enzyme/EC3/2/l/26. html)。也就是說蔗糖_6_磷酸水解酶和蔗糖酶都具有 正式名稱β -呋喃果糖苷酶(EC 3. 2. 1. 26)。這種β-呋喃果糖苷酶催化在β-D-呋喃果糖苷中的的非還原β-D-呋喃果糖苷殘基末端的水解反應。當其催化蔗糖水解時具有正式名稱“蔗糖酶或轉化酶”，且當他催化 蔗糖-6-磷酸水解時具有正式名稱“蔗糖-6-磷酸水解酶”。
在本發明的 實施例中，除了證明導入源自Marmheimia的蔗糖_6_磷酸水解酶(EC 3.2.1.26，SacC), BP, β -呋喃果糖苷酶引起的蔗糖代謝能力外，還努力證明了將一般的 β-呋喃果糖苷酶導入到微生物中賦予了微生物蔗糖代謝能力。結果，當分別將來自大腸桿 菌W的轉化酶(invertase) (EC3. 2. 1. 26，CscA)和來自枯草芽孢桿菌的β -呋喃果糖苷酶 導入到不能代謝蔗糖的微生物中時，觀察到導入了 呋喃果糖苷酶(EC 3.2.1.26)的微 生物通過代謝蔗糖而生長。因此，在另一方面，本發明涉及β-呋喃果糖苷酶，其具有將β-D-呋喃果糖苷鍵 水解釋放果糖的活性，包括將蔗糖水解為葡萄糖和果糖的活性和將蔗糖-6-磷酸水解為葡 萄糖-6-磷酸和果糖的活性。且，β-呋喃果糖苷酶具有從下組中選擇的氨基酸序列，該組 包括序列號3，序列號7和序列號9的氨基酸序列，但是本發明的范圍不限于此。特別是，在本發明中，作為β-呋喃果糖苷酶的一個實例蔗糖-6-磷酸水解酶 (SacC)具有將蔗糖-6-磷酸轉化為葡萄糖-6-磷酸和果糖的活性或者將蔗糖轉化為葡萄糖 和果糖的活性。同樣，在本發明的實施例中，使用了源自Marmheimia的β-呋喃果糖苷酶， 但是源自其他微生物的這些酶也落入本發明的范圍內且可具有序列號3的氨基酸序列， 編碼所述β-呋喃果糖苷酶的基因(sacC)優選由序列號4的堿基序列表示。在本發明中作為β _呋喃果糖苷酶例子的轉化酶(invertase)、蔗糖酶(sucrase) 和蔗糖水解酶(sucrose hydrolase) (CscA)都與降解蔗糖和將降解產物連接到糖酵解有關 的酶，且這些酶具有將蔗糖-6-磷酸轉化為葡萄糖-6-磷酸和果糖的活性或者將蔗糖轉化 為葡萄糖和果糖的活性。此外，在本發明的實施例中，舉例說明了來自大腸桿菌的呋喃 果糖苷酶，但是從其他微生物中獲得的也落入本發明的保護范圍內且可具序列號7的氨 基酸序列，編碼所述酶的基因(cscA)優選由序列號8的堿基序列表示。在本發明中，作為β-呋喃果糖苷酶的一個例子的蔗糖-6-磷酸水解酶(SacA) 是與降解蔗糖和將降解產物連接到糖酵解有關的酶，且具有將蔗糖-6-磷酸轉化為葡萄 糖-6-磷酸和果糖的活性或者將蔗糖轉化為葡萄糖和果糖的活性。在本發明的一實施例 中，舉例說明了來自枯草芽孢桿菌的呋喃果糖苷酶，但是來自其他微生物的酶也落入 本發明的保護范圍內且可具有序列號9的氨基酸序列，而且編碼所述酶的基因(sacA)優 選由序列號10(sacA，BSU38040，蔗糖-6-磷酸水解酶)的堿基序列表示。此外，當由sacC基因編碼的來自Marmheimia的β -呋喃果糖苷酶的氨基酸序列 與通過蛋白質 BLAST(//blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)搜索到的氨基酸序 列比較時，與來自大腸桿菌W來源的cscA編碼的轉化酶具有28 %的氨基酸序列同源性， 且與來自由枯草芽孢桿菌來源的sacA編碼的蔗糖-6-磷酸水解酶具有35%的氨基酸序 列同源性。同樣，源自所述兩種菌株的呋喃果糖苷酶都具有指定為“SacC”的保守區 域區域β-果糖苷酶(β-fructosidase) (C0G1621)。這表明，將與sacC基因編碼的來 自Marmheimia的氨基酸序列有些不同但是含有指定為“SacC”的保守區域β -果糖苷酶 (β-fructosidase)的任何酶導入到下述的微生物中，所述微生物能夠代謝蔗糖而生長。因 此，通過序列號3、7或9的氨基酸序列舉例說明了 β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列，但本 發明的保護范圍并不限于此。也就是說，所有呋喃果糖苷酶可包含在本發明的范圍之內，只要他們具有將β-D-呋喃果糖苷鍵水解釋放果糖的活性。例如，與序列號3、7或9具 有至少70%、80%或90%的氨基酸序列同源性的氨基酸序列同樣可包含在本發明范圍之 內同樣，編碼β-呋喃果糖苷酶的基因可具有，例如序列號4、8或10的堿基序列。 DNA包括這些序列中的一個或多個堿基的一種變異(替代、缺失、插入或增加)且與根據本 發明的堿基序列比較具有至少70 %或80 %的序列同源性，優選90 %，更優選95 %。這里所用的術語“序列同源性”是指兩個多聚核苷酸或兩個核酸分子之間的序列 相似性。所述序列同源性可通過比較窗口(comparison window)比較兩個最佳對準序列來 確定，其中在比較窗口中的多聚核苷酸或氨基酸序列的片段與參考序列(例如一致序列) 比較可包括增加或缺失(例如缺口或外伸)。序列同源性的百分比可通過計算兩個序列中 同源核酸堿基或者氨基酸殘基出現的位置的數量得出相匹配的位置的數量，匹配位置的數 量除以比較窗口中的所有位置的總數并乘以100獲得序列同源性的百分比。核酸或者氨基 酸序列的同源性可利用序列分析軟件來測量，例如BLASTN或BLASTP。BLAST 一般可在網站 上使用(//www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)。在本發明中，如上所述，蔗糖是含有D-葡萄糖和D-果糖的雙糖，已知它具有阻止 細胞中的蛋白質被修飾、穩定細胞中的蛋白質和減少由于外部環境改變而引起的細胞溶解 的作用。因此，蔗糖在基礎化合物的高濃度生產或者在高濃度細胞培養中是非常有用的。如圖2所示，當源自M. succiniciproducens MBEL55E的新β-呋喃果糖苷酶的蔗 糖-6-磷酸水解酶導入到不能代謝蔗糖的微生物中時，導入的酶被認為是通過4種可能的 途徑代謝蔗糖或者蔗糖-6-磷酸。第一種可能的途徑(反應I)為蔗糖-6-磷酸水解酶在細胞外空間將蔗糖降解為 葡萄糖和果糖的情況，然后降解產物通過與轉送有關的酶被導入到細胞內，例如各自的磷 酸轉移酶。第二種可能的途徑(反應II)為蔗糖-6-磷酸水解酶在周質將蔗糖降解為葡萄糖 和果糖的情況，然后降解產物通過參與轉送的酶被導入到細胞內，例如各自的磷酸轉移酶。第三種可能的途徑(反應III)為蔗糖通過通透酶而不是磷酸轉移酶家族被導入 到細胞中的情況，然后通過導入的蔗糖-6-磷酸水解酶降解成葡萄糖和果糖。第四種可能的途徑(反應IV)為蔗糖通過磷酸轉移酶轉化為蔗糖-6-磷酸同時被 導入到細胞中的情況，然后通過導入的蔗糖-6-磷酸水解酶轉化為果糖和葡萄糖-6-磷酸。同樣，sacC 基因源自與 Actinobacillus succinogenes 130Z(ATCC55618) —起 屬于 Pasteurellaceae 家族的 M. succiniciproducens MBEL55E(KCTC 0769BP)。特別是， 所述 M. succiniciproducens MBEL55E(KCTC0769BP)禾口 Actinobacillus succinogenes 130Z(ATCC 55618)具有相似的基因組序列和細胞生理功能。這兩個微生物菌株的基 因組序列是迄今為止解碼的所有基因組序列中彼此最為相似的(McKinlay等人，Appl. Microbiol. Biotechnol.，76 :727，2007)。同樣，已知源自 M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP)的 sacC 基因和源自 Actinobacillus succinogenes 130Z(ATCC 55618)的sacC基因具有高度的同源性且最為相似。因此，對于本領域技術人員來說顯而 易見的是源自 M. succiniciproducens MBEL55E 的蔗糖 _6_ 磷酸水解酶(SacC，MS0909) 和編碼它的基因以及源自Actinobacillus succinogenes 130Z的蔗糖-6-磷酸水解酶(Asuc_1829)和編碼它的基因，同樣可應用于本發明。因此，在另一方面，本發明涉及一種能夠代謝蔗糖的微生物，其中導入了編碼蔗糖 磷酸轉移酶和/或蔗糖-6-磷酸水解酶，和一種生產代謝產物、可生物降解聚合物或重組蛋 白質的方法，其包括含有蔗糖作為唯一碳源的培養基中培養所述重組微生物。 在本發明中，所述重組載體是能夠在合適的宿主細胞中表達蛋白質的載體，所述 宿主細胞涉及構造成含有一種DNA序列，所述序列與幫助操縱使蛋白質表達最優化或載體 復制中所需的基因的其他序列一起可操作地連接到能夠控制蛋白質表達的控制序列上。所 述控制序列可包含一個調控轉錄的啟動子、一個可選擇地添加用于調控轉錄的操縱子、一 個合適的mRNA核糖體結合位點和/或控制轉錄/翻譯終止的多個序列。例如，所述重組載體可以是本發明實施例中所用的如pTrc99A的重組載體，但是 除了這個在體外其他已知的載體也可用于本發明。同樣，含有sacC基因的表達框不僅可被 插入到如pKK223-3、pTac99A，pET系列或pMAL系列的表達載體中，還可被插入到如pACYC、 pBluescriptSK-、pBR322、pGEM系列或pMBl的克隆載體中，且這樣的表達載體可用于本發 明。此外，還可以使用與本發明相關的技術領域中已知的重組載體(Sambrook J & Russell D, Molecular Cloning :a laboratory manual,3rd ed. , Cold Spring Harbor Lab (CSHL) Press, New York，2001)。此外，除氨芐青霉素抗性基因之外，本領域已知的其他抗性基因也 可用于本發明。上述基因源自同Actinobacillus succinogenes 130Z(ATCC 55618) —起屬于 Pasteurellaceae 家族的 M. succiniciproducens MBEL55E(KCTC0769BP)。特別是所述兩 個菌禾中 M. succiniciproducens MBEL55E(KCTC0769BP)禾口 Actinobacillus succinogenes 130Z(ATCC 55618)具有非常相似的基因組序列和細胞生理活性。根據McKinlay等人的報 道(2007)，已知所述兩個微生物菌株的基因組序列是在迄今為止解碼的基因組序列中彼此 最為相似的(App 1. Microbiol. Biotechnol.，76 -JTI，2007)。因此，對于本領域技術人員 來說明確是上述基因同M. succiniciproducensMBEL55E(KCTC 0769BP) 一樣可應用于源自 Actinobacillus succinogenesl30Z(ATCC 55618)的基因。在本發明的一實施例中，使用含有ptSG，SaCC和rbsK基因的重組載體轉化不能利 用蔗糖作為碳源的重組微生物，從而構建了具有代謝蔗糖的能力的重組微生物。然而，根據 本領域公知的方法，將上述基因插入到不能利用蔗糖作為碳源的微生物染色體中也可構建 基因工程重組微生物。在本發明中，構建了含有包括sacC基因在內的β -呋喃果糖苷酶_編碼基因的重 組載體，然后導入到不能利用蔗糖作為碳源的大腸桿菌中，然后在含有蔗糖作為唯一碳源 的培養基中培養所述構建的重組微生物。結果發現，所述重組微生物具有代謝蔗糖的能力。 在另一方面，本發明涉及所述重組載體，一種用所述重組載體轉化并具有代謝蔗糖的能力 的重組微生物以及利用所述重組微生物生產代謝產物、可生物降解聚合物或重組蛋白質的 方法。所述重組載體可以是具有如圖5所示酶切圖譜的重組載體，但是除了圖5所示的 pTacl5K載體，其他已知載體可用于本發明。此外，含有包括sacC基因的β -呋喃果糖苷 酶_編碼基因的表達框不僅可被插入到如pTrc99A、pTac99A或pMAL系列的表達載體中，還 可被插入到如pACYC、pBluescript SK_、pBR322、pGEM系列或pMBl的克隆載體中，且所述重組載體可應用于本發明。此外，還可以使用本發明所屬領域中已知的重組載體(Sambrook J & Russell D,Molecular Cloning :a laboratory manual,3rd ed. ,Cold Spring Harbor Lab (CSHL) Press, NewYork,2001)。另外，含有除了含有卡那霉素抗性基因之外，一些包含本 領域其他已知抗藥基因的載體也可用于本發明。在本發明實施例中，使用含有SaCC，CSCA和sacA基因的重組載體轉化不能利用蔗 糖作為碳源的一種微生物，從而構建了能夠代謝蔗糖的重組載體。然而，根據本領域已知的 方法通過將上述基因插入到不能利用蔗糖作為碳源的微生物的染色體中也可構建能夠代 謝蔗糖的重組微生物。此外，在本發明的實施例中只以特定的大腸桿菌菌株作為不能利用 蔗糖作為碳源的宿主微生物進行說明，對于本領域技術人員來說顯而易見的是即使上述基 因插入到其他大腸桿菌菌株也可以得到與上述大腸桿菌同樣的結果，而且不能利用蔗糖作 為碳源的宿主微生物還包括細菌、酵母和真菌。
這里使用的術語“代謝產物”指的是通過代謝途徑產生的中間產物和產物的集合。 所述代謝產物可分為初級代謝產物和次級代謝產物。例如，本發明可通過各種方式應用于 不能利用蔗糖的重組體或基因工程微生物中來生產生物燃料、初級和次級代謝產物、可生 物降解聚合物和重組蛋白質。例如，為了生產丁醇(Atsumi等人Nature.，451 =7174, 2008), 乙醇(Lindsay 等 A Appl. Microbiol. Biotechnol,43 :70，1995)和乳酸(Zhou, Appl. Environ. Microbiol,69 3992003)和琥珀酸及蘋果酸(Jantama等人Biotechnol. Bioeng.， 99 1140, 2008)、氨基酸(Park 等人 PNAS，104 7797,2006 ；Lee 等人 Molecular Systems Biology, 3 :1，2007)、可生物降解聚合物(Ahn 等人，Appl. Environl. Microbiol. ,66 :3624， 2000 ；Park ^A, Biomacromolecules, 2 248,2001 ；Park ^A, Biotechnol. Bioeng. ,74 81,2001)重組蛋白質(Jeong 等人，Appl. Environl. Microbiol. ,65 3027,1999 ；Han 等人， Appl. Environl. Microbiol.，69 :5772，2003)，在現有技術中利用葡萄糖作為主要碳源生產 所需生物制品；然而，當本發明的基因導入到已知的微生物菌株中時，所需的生物制品可利 用蔗糖作為碳源而生產。此外，本領域技術人員可同樣容易地應用本發明來生產可生物降解聚合物和重組 蛋白。在本發明的實施例中，如蘇氨酸的代謝產物被作為例子說明，但是對本領域技術人員 來說顯而易見的是本發明同樣可容易地應用于生物降解微生物、重組蛋白質及類似物的生產。實施例以下根據實施例進一步描述本發明。但是可以理解的是，這些實施例僅用于說明 而不構成對本發明的范圍的限定。特別是，在下面的例子，舉例說明了特定的大腸桿菌作為不能代謝蔗糖的宿主細 胞來表達本發明的基因，但是對于本領域技術人員顯而易見的是，即使使用其他大腸桿菌 菌株或者其他種類的微生物，通過將本發明的涉及蔗糖代謝基因導入到所述微生物并培養 重組微生物，也能夠生產包括蔗糖的代謝產物。實施例1 :ptsG，sacC和rbsK基因的蔗糖代謝能力的檢測1. IptsG, sacC 和 rbsK 基因的分離為了檢測根據本發明的基因(ptsG，sacC和rbsK)是否一起參與蔗糖代謝，從 M. succiniciproducens MBEL55E(KCTC0769BP)中分離了所述基因。
首先，以Μ· succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP)的基因組 DNA 作為模板， 以序歹丨J 11和12作為引物對，進行PCR擴增ptsG(MS0784)的DNA。同樣，sacC(MS0909) 和rbsK(MS1233)的DNA分別使用一對序列13和14的引物和一對序列15和16引物分 別進行PCR擴增。使用序列13和16的引物，以DNA片段的混合物作為模板重疊PCR。所 述ptsG(MS0784)，sacC(MS0909)和rbsK(MS1233)基因分別為編碼蔗糖磷酸轉移酶、蔗 糖-6-磷酸水解酶及果糖激酶的基因。序列11:5' -GGAATTCATGCTCGTTTTAGCTAGAATTGG 序列12:5' -TCCGAGCTCTTACTATTCTTTTGCGTTAGCTCTTG序列13 5' -ACCTGCGAGCTCTTTCACACAGGAAACAATTTTCATGCGGTCGTTTTTACCG序列 14 5 ‘ -CAAATTTTGTTTGTCATATGCATGAAATCTGTTTCCTGTGTGAAATTACTATTTATATTCAATTT CTTTCGGATA序列 15 5 ‘ -TATCCGAAAGAAATTGAATATAAATAGTAATTTCACACAGGAAACAGATTTCATGCATATGACAA ACAAAATTTG序列16:5' -ACCTGCGGGTACCCTATTAGTTTGCTAAAAATTCCGCT1. 2 重組載體pMSscrIIA的構建為了使來自 Mannheimia 的基因表達，ptsG (MS0784)，sacC(MS0909)和 rbsK(MS1233)，其在大腸桿菌分別編碼蔗糖磷酸轉移酶、蔗糖-6-磷酸水解酶及果糖激酶， 通過如下方式構建了表達載體。在實施例1. 1中擴增的含有sacC(MS0909)和rbsK(MS1233)基因的DNA片 段使用限制性內切酶Sac I和KpnI消化，連接到使用相同的限制性內切酶消化的 pTrc99A(Pharmacia Biotech. , Uppsala, Sweden)上，從而構建了 pTrc99AsacCrbsK。然后，使用EcoRI和SacI消化實施例1. 1獲得的ptsG (MS0784) DNA片段，隨 后連接到使用相同的限制性內切酶消化的表達載體pTrc99AsacCrbsK上，從而構建了 pTrc99AptsGsacCrbsK0 所述構建的載體命名為“pMSscrIIA”(圖 3)。1. 3 大腸桿菌 W3110pMSscrIIA 和 W3110pTrc99A 菌株的構建下面的實驗使用一種模式微生物大腸桿菌W3110進行的，它是已知的一種不能代 謝蔗糖的大腸桿菌K-12的次代菌株。將大腸桿菌W3110涂在LB固體培養基中并在37°C培養8小時。然后，將菌落接種 在IOml的LB液體培養基中培養8小時。培養液以(ν/ν)接種在IOOml的LB液體培養 基中并在37°C下在搖床上培養。大約2個小時之后，當培養液的OD6tltl值達到約為0. 30-0. 35的時候，將其置于冰 上20分鐘，使細胞的生長停止。培養液在4°C下，以3000rpm離心15分鐘收集細胞，然后 將細胞在4°C下懸浮于32ml的RFI溶液中。懸浮液在4°C下，以3000rpm離心15分鐘收 集細胞，細胞再次懸浮在8ml的RFII溶液中，然后將其置于冰上15分鐘。最后，重懸浮液 以 100 μ 1/ 孔分裝并在-70°C儲藏。RFI 溶液的成分由 IOOmM RbCl, 50mMMnCl2-4H20,0. IM CH3COOK, IOmM CaCl2和15% (w/v)甘油組成并用0. 2M的醋酸鹽將pH值調至5. 8。RF II 溶液的成分由 IOmM MOPS, IOmM RbCl,0. IM CH3COOK, IOmM CaCl2 和 15% (w/v)甘油組成并用NaOi^fpH值調至6. 8。實施例1. 2 構建的 pMSscrIIA 表達載體或者 pTrc99A(Pharmacia Biotech., Uppsala, Sweden)作為對照添加到大腸桿菌W3110菌株中，然后，在42°C下90秒鐘進行熱 休克 轉化，從而轉化菌株。熱休克轉化之后，向菌株中加入0. 8ml的LB液體培養基并將菌 株在37°C下在搖床中培養1小時。所述培養液涂在含有抗生素氨芐青霉素(最終濃度50ug/L)的LB固體培養基上 并在37°C下培養12小時或12小時以上。所形成的大腸桿菌W3110 pMSscrIIA和大腸桿菌 W3110 pTrc99A接種于LB液體培養基，在37°C下培養8小時或8小時以上。為了確認所述 載體是否成功被導入，利用GeneAllK質粒SV(GeneAll Biotechnology，韓國)從所述培養 菌株中分離載體并進行電泳。大腸桿菌W3110pMSsCrIIA菌株Solgent公司(韓國)利用 序列為序列17到24的引物進行測序，從而檢測所述菌株的堿基序列是否與所述基因的堿 基序列一致。序列17:5' -GGAAACAGACCATGGAATTC序列18:5' -CCGCAAAAGATTTATTCGAAGAAG序列19:5' -CCTGGTTATATGATACTTTAGG序列20:5' -TAGTGCTGGGCGCAAGAGCTAACG序列21:5' -ACCAGTGGGCGATAAAATCG序列22:5' -TGATCAAGGTTTCGATTTCT序列23:5' -TTTTCCTGAATGACGGCGAA序列24:5' -CGATCTGCCGCAATTTCAAG1. 4 重組大腸桿菌代謝蔗糖的能力的檢測在實施例1. 3中構建的大腸桿菌W3110pMSscrIIA和大腸桿菌W3110pTrc99A在固 體培養基上形成菌落，接種在含有以5g/L蔗糖作為唯一碳源的M9基本培養基中并在37°C 下培養16個小時。然后，所述培養液接種到含有以3% (ν/ν)蔗糖的IOOml的Μ9基本培養 基中，接著在37°C培養。這里作為一種抗生素，加入氨芐青霉素至最終濃度為50ug/L。所 述 M9 基本培養基由 33. 9g/L 的 Na2HPO4U5g/L 的 KH2PO4,2. 5g/L 的 NaCl、5g/L 的 NH4Cl 禾口 0.36g/L的MgSO4組成。使用分光光度計測定OD6tltl來確定培養基中的細胞濃度。在培養過 程中，定期收集樣本，收集的樣本13，OOOrpm離心5分鐘，然后利用高效液相色譜法測定上 清液中的蔗糖濃度。結果如表1所述，大腸桿菌W3110pTrc99A菌株不能在含有以蔗糖作為唯一碳源的 M9基本培養基中生長，但是大腸桿菌W3110pMSSCrIIA菌株顯示了極好的代謝蔗糖的能力。 大腸桿菌W3110pMSsCrIIA菌株在19小時代謝了約2. 2g/L的蔗糖，這表明基于0D6(1(13. 12 的生物量增加，并產生了 0. 67g/L的醋酸作為副產物。由此確定當一種微生物包含所有的 PtsG, sacC和rbsK基因時，其顯示極好的代謝蔗糖的能力。表 1- scr- 5.23 5.22 大腸桿菌 W3110 pMSscrllA__+__scr+__6.73 4.53如上所述，無論是將蔗糖磷酸轉移酶基因還是將蔗糖磷酸轉移酶基因與蔗 糖-6-磷酸水解酶基因的組合物導入到不能代謝蔗糖的微生物中，所述微生物都具有了代 謝蔗糖的能力，此外產生醋酸作為以蔗糖作為碳源的代謝產物。
因此，任何本領域技術人員可容易地應用本發明生產醋酸之外的乳酸、琥珀酸、乙 醇、生物燃料和含有生物丁醇、可生物降解聚合物以及重組蛋白的生物能源。實施例2 每個pstG基因和sacC基因對于代謝蔗糖能力的檢測2. 1 構建重組載體用于檢測pstG基因和sacC基因代謝蔗糖的能力為了檢測本發明的pstG基因和sacC基因是否單獨具有代謝蔗糖的能力，構建 了缺失PtsG基因的(MS0784)載體(pSacHR06ptsG)和缺失sacC(MS0909)基因的載體 (pSacHR06sacC)用于基因敲除實驗。首先，為了干擾所述蔗糖磷酸轉移酶基因(PtsG)用同源重組方法按以下 方式構建了基因交換載體。左同源臂區域利用Mannheimiasucciniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP)的基因組DNA作為模板以序列25和26為引物，且右同源臂區域 使用序列27和28作為引物進行擴增；含有抗生素標記和Iox突變位點的DNA片段，以 pECmulox 載體(Kim等人，FEMS Microbiol. Lett.，278 78,2008)作為模板以序列29 和 30 作為引物進行擴增。這三個DAN片段利用序列25和28作為引物通過重疊PCR進行擴增。序列25:5' -ATATCTGCAGCCGGCATTAAATATTAGTCAAC序列26:5' -CGTTCTAACGGAGGTTGAAAACTGCCCTTT序列27:5' -GTCTCCCTATCACGCCGTTATTTTCATTATT序列28:5' -ATTAGTCGACACCATCCCCACGGAATACAT序列29:5' -TTTCAACCTCCGTTAGAACGCGGCTACAAT序列30:5' -TAACGGCGTGATAGGGAGACCGGCAGATCC如此擴增的最終DNA片段用限制性內切酶PstI和SalI消化并克隆到用同樣的酶 消化的 pSacHR06 載體(Park 等人，PNAS, 104 7797,2007)中，由此構建了 pSacHR06ptsG。 此外，利用上述同樣的方法利用序列31和36作為引物構建了 pSacHROesacC。序列31:5' -ATACACTGCAGTTATGCAATTTATCGCACCC序列32:5' -AATCTGCTCTGATGCGGTCGTGAAATGCTTCCA序列33:5' -CACAGAATCAGGACAAATGGCATTCAATGCTG序列34:5' -ATACTGTCGACTCAATGGCATATGCAGCG序列35:5' -AAGCATTTCACGACCGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAG
序列36:5' -TTGAATGCCATTTGTCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTAC2. 2 :M. succiniciproducens MptsG 禾口 Μ· succiniciproducens MsacC 菌株的構建分別使用實施例2. 1中構建的交換載體pSaCHR06ptsG剔除ptsG基因的和交換載 體 pSacHR06sacC 剔除 sacC 基因，根據 Kim 等人(FEMSMicrobiol. Lett.，278 78,2008)報 道的方法從M. succiniciproducensMBEL55E (KCTC0769BP)基因組中剔除了所述基因，因此 構建了突變菌株，M. succiniciproducens MptsGfPM. succiniciproducens MsacC0特別是，M.succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP)涂在含有 10g/L 葡萄糖的 LB-葡萄糖固體培養基中并在37°C下培養36小時。然后，菌落接種到IOml的LB-葡萄糖 液體培養基中培養12小時。充分生長的細胞培養液以(ν/ν)接種到100ml的LB-葡萄 糖液體培養基中，然后在37°C下以200rpm在搖床中培養。在4-5小時后，當所述培養液的OD6tltl達到約為0. 3-0. 4時，在4°C、4，500rpm下離 心20分鐘收集細胞，然后細胞在4°C下重新懸浮在200ml的10%甘油溶液中。所述重懸浮 溶液在4°C、5，500rpm下離心20分鐘以收集細胞。所述重懸浮過程重復兩次同時甘油溶液 的濃度減少到一半，然后所述細胞以1 1的體積比重新懸浮在甘油溶液中以獲得一種細 胞濃縮物。所述細胞濃縮物分別與實施例2. 1中構建的pSacHR06ptsG或者pSacHR06sacC 基因交換載體混合，然后在2. 5kV，25 μ F和400ohms條件下進行電穿孔，由此將每種基因導 入到培養的M. succiniciproducens中。電穿孔之后，Iml的LB-葡萄糖液體培養基加入到 菌株中然后所述菌株在200rpm、37°C條件下在搖床中培養1小時。所述培養液涂布在含有 抗生素氯霉素(最終濃度6.8yg/L)的LB-葡萄糖固體培養基中在37°C下培養48小時或 48小時以上。為了篩選只有雙交叉發生的菌落，將所形成的菌落在含有氯霉素(最終濃度 6. 8 μ g/L)的LB-培養基(含有100g/L蔗糖的LB培養基)上劃線。24小時后，形成的菌 落在同樣的培養板中重新劃線。在培養板上形成的所述菌落(突變)在含有一種抗生素的LB-葡萄糖液體培養基 中培養，且通過Rochelle等人(FEMS Microbiol. Lett.，100 :59，1992)描述的方法從培養 的菌株中提取基因組DNA。以提取的突變基因組DNA作為模板進行PCR，然后所述PCR產物 進行電泳以確定在各自突變菌株中的已剔除PtsG基因和sacC基因。為了確定MptsG菌株中已剔除ptsG基因，分別用序列37和38的一對引物以及 序列39和40的一對引物進行PCR。為了確定MsacC菌株中已剔除sacC基因，分別用一對 序列39和40的引物以及一對序列41和42的引物進行PCR0序列37:5' -CGGGGCGAAAGTGATTGAGA序列38:5' -AATTGCCGCCTGGGTATTGG序列39:5' -ACCTTTACTACCGCACTGCTGG序列40:5' -GCGGGAGTCAGTGAACAGGTAC序列41:5' -GATCTTGAGTCCGTAAAACAGGCTT序列42:5' -TTCCGCTCAAGCCATTGTAGTG2. 3 =MptsG菌株、MsacC菌株以及親本菌株(MBEL55E)之間生長的比較在實施例2. 2中構建的MptsG菌株、MsacC菌株分別在BHI (BactoTMBrain Heart Infusion ；Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD)8 /]、0 ，ΜΜ 10ml 白勺培養液接種到300ml的MH5S培養基(每升2. 5g酵母提取物、2. 5g多聚蛋白胨、Ig NaCl, 8. 7gK2HP04、10gNaHC03、0. 02g CaCl2 · 2Η20、0· 2g MgCl2 · 6H20 禾口 IOg 蔗糖)中，然后比較所 述菌株的生長曲線和以相同條件培養的親本菌株(MBEL55E)的生長曲線。圖4是通過0D_ 測定的MBEL55E( ^hMptsG(A)和MsacC(A)菌株的生長曲線。如圖4所示，從菌株中 缺失每種基因之后，在蔗糖培養基中親本菌株(MBEL55E)的生長能力大幅消失。這表明對 于在蔗糖培養基中的菌株的生長來說每種所述基因都是必需的。同時，rbsK基因編碼的果糖激酶(RbsK，MS1233)進行了如上述的相同實驗，沒有 觀察到如生長率下降的生長變化。同樣，酶活性測定結果顯示，親本菌株和rbsK缺失菌株 之間在酶活性上沒有顯示很大差別且具有比通常的果糖激酶低很多的酶活性水平。也就是 說，這兩個菌株顯示了微小的酶活性。基于這種結果，推斷認為rbsK基因不編碼果糖激酶 或者即使它編碼果糖激酶也只具有非常微弱的活性。2. 4 =MptsG菌株、MsacC菌株以及親本菌株的酶活性比較為了測定蔗糖PTS 的酶活性，使用了 Jacobson 等人(J. Biol. Chem.，254 :249， 1979)和 Lodge 等人(Infect. Immun. ,56 :2594，1988)的方法。第一，為了使細胞具有滲透性，Iml的OD6tltl值約為1. 2的細胞培養液用TDM緩沖 液(50mM Tris/HCl,10mM MgCl2, ImM DTT ；pH 7.5)洗滌并在Iml的相同緩沖液中重懸浮， 0.01ml甲苯加入到其中，然后所述細胞溶液強烈震蕩45秒鐘。震蕩的細胞在12，OOOXg 離心，然后收集的細胞用TDM緩沖液洗滌2次。再次重復這一過程，得到的細胞在50μ 1的 TDM緩沖液中重懸浮，由此制備了具有滲透性的細胞。PEP依賴型蔗糖磷酸化是通過將5μ 1 的具有滲透性的細胞懸浮液添加到含有25mMTris/HCl (pH 8. 0)，ImM DTT, 5mM MgCl2, IOmM KF和1 μ Ci [U-14C]蔗糖的100 μ 1反應混合物中，并測定含有ImM PEP的混合物和不含PEP 的混合物之間的反應差異。所述混合物在37°C反應10分鐘，并用Iml的冷水終止反應。終 反應產物經過一過濾系統的DEAE過濾盤(Whatman，DE81)并用10倍體積的冷水進行洗滌， 然后根據已知的方法利用Beckman LS6500液體閃爍計數器(Beckman，Ramsey，MN)測定其 中的放射性。蔗糖-6-磷酸水解酶的活性通過做了些修改的Martin等人(Appl. Environ. Microbiol. ,53 :2388，1987)方法進行測量的。OD6tltl值大約為1的20ml細胞培養物以測量 蔗糖PTS活性的相同方法進行具有滲透性并最終重懸浮在Iml的TDM緩沖液中，由此制備 了具有滲透性的細胞。PEP依賴蔗糖磷酸化是通過將30 μ 1的具有滲透性的細胞添加到含 有50mM鈉鉀磷酸鹽緩沖溶液(pH 7. 2)、5mM的MgCl2、4mM的蔗糖、0. 8Mm的NADP以及6. 4U 的葡萄糖-6-磷酸水解酶的300 μ 1反應混合物中，并測定含有IOmM PEP的混合物和不含 PEP的混合物之間的反應差異。測定分別剔除了 PtsG基因和sacC基因的突變菌株以及親本菌株的活性，且在 表2中示出測定結果。結果表明由MS0784(ptsG)編碼的蔗糖PTS酶具有PTS活性且由 MS0909(sacC)編碼的蔗糖_6_磷酸水解酶在細胞中具有糖酵解功能。表2
1權利要求
一種具有序列號1的氨基酸序列的蔗糖磷酸轉移酶。
2.根據權利要求1所述的蔗糖磷酸轉移酶，其特征在于，其具有將蔗糖轉移到細胞的 同時將蔗糖轉化為蔗糖-6-磷酸的功能。
3.一種編碼根據權利要求1所述的蔗糖磷酸轉移酶的PtsG基因。
4.根據權利要求3所述的ptsG基因，其特征在于，其由序列號2的堿基序列表示。
5.一種呋喃果糖苷酶，其具有水解β-D-呋喃果糖苷鍵以釋放果糖的活性。
6.根據權利要求5所述的β-呋喃果糖苷酶，其特征在于，其具有選自下組的一種氨基 酸序列，該組由序列號3、序列號-J以及序列號9的氨基酸序列組成。
7.一種編碼根據權利要求5所述的呋喃果糖苷酶的基因。
8.根據權利要求7所述的基因，其特征在于，其由選自下組的一個堿基序列表示，該組 由序列號4、序列號8以及序列號10的堿基序列組成。
9.一種包含根據權利要求3所述的ptsG基因以及編碼蔗糖-6磷酸水解酶的sacC基 因的重組載體。
10.根據權利要求9所述的重組載體，其特征在于，所述sacC基因由序列號4的堿基 序列表示。
11.一種包含根據權利要求7所述的基因的重組載體。
12.根據權利要求11所述的重組載體，其特征在于，所述基因由選自下組的堿基序列 表示，該組由序列號4、序列號8以及序列號10的堿基序列組成。
13.—種能夠代謝蔗糖的重組微生物，其中根據權利要求9或權利要求10的重組載體 導入到選自下組的宿主細胞中，該組由細菌、酵母和真菌組成。
14.根據權利要求13所述的能夠代謝蔗糖的重組微生物，其特征在于，其為大腸桿菌。
15.一種能夠代謝蔗糖的重組微生物，其中根據權利要求3所述的ptsG基因和編碼蔗 糖-6-磷酸水解酶的sacC基因被導入到選自下組的宿主細胞的染色體DNA，該組由細菌、酵 母和真菌組成。
16.根據權利要求15所述的能夠代謝蔗糖的重組微生物，其特征在于，所述sacC基因 由序列號4的堿基序列表示。
17.根據權利要求15所述的能夠代謝蔗糖的重組微生物，其特征在于，其為大腸桿菌。
18.—種能夠代謝蔗糖的重組微生物，其中根據權利要求7所述的基因導入到選自下 組宿主細胞的染色體DNA中，該組由細菌、酵母和真菌組成。
19.根據權利要求18所述的能夠代謝蔗糖的重組微生物，其特征在于，所述基因由選 自下組的堿基序列表示，該組由序列號4、序列號8以及序列號10的堿基序列組成。
20.根據權利要求18所述的能夠代謝蔗糖的重組微生物，其特征在于，其為大腸桿菌。
21.—種生產代謝產物、可生物降解聚合物或者重組蛋白質的方法，該方法包括在含有 蔗糖作為唯一碳源的培養基中培養所述重組微生物。
22.—種生產代謝產物、可生物降解聚合物或者重組蛋白質的方法，該方法包括在含有 蔗糖作為唯一碳源的培養基中培養權利要求15或18的重組微生物。
全文摘要
本發明涉及一種能夠代謝蔗糖的重組微生物，更具體地涉及一種其中導入了編碼蔗糖磷酸轉移酶的基因和/或編碼蔗糖-6-磷酸水解酶的基因的能夠代謝蔗糖的重組微生物，或者是一種其中導入了編碼β-呋喃果糖苷酶的基因的能夠代謝蔗糖的重組微生物。根據本發明提供了一種能夠利用廉價的蔗糖作為碳源代替昂貴的葡萄糖的重組微生物。另外，在原先不能利用蔗糖作為一種碳源的微生物培養過程中，蔗糖能夠代替其他碳源包括葡萄糖。
文檔編號C12N9/10GK101970648SQ200880126780
公開日2011年2月9日 申請日期2008年12月18日 優先權日2007年12月18日
發明者宋孝鶴, 崔松, 樸真煥, 李政旭, 李相燁, 金知滿 申請人:韓國科學技術院