專利名稱：一種流產布魯氏菌重組菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種流產布魯氏菌重組菌及其應用。
背景技術：
布魯氏菌病是一種人畜共患的傳染病，也是大動物傳染病中僅次于口蹄疫，具 有重要的政治、經濟影響力的疾病，在世界各國的流行形勢十分嚴峻。長期以來全 球防控布魯氏菌病的策略主要是檢疫-撲殺(發達國家)或免疫接種(發展中國家)， 前者通過檢疫撲殺患病的牛、羊、豬等動物，耗資巨大、操作困難；后者通過免疫 接種并輔助撲殺措施。但現行的疫苗毒力較強、遺傳背景不清楚，雖然可阻止疾病 在動物群中的傳播，但無法分辯患病動物體內分離得到的菌株是疫苗株還是野生菌 株，使疫苗株的簡單、快速的安全性評價成為目前公眾關注的焦點問題。

發明內容
本發明的目的是提供一種流產布魯氏菌重組菌。
本發明提供的流產布魯氏菌重組菌，是將流產布魯氏菌(&Mce//fl^oWw)基 因組中的冷休克蛋白的編碼基因滅活后得到的重組菌。
所述流產布魯氏菌(5n^eZ/aWoW^)可為現有的菌株，如野生株(包括標準 株和強毒株)、疫苗株。
所述冷休克蛋白可為任何流產布魯氏菌(份MceZ/aa6o"ws)的冷休克蛋白，如 為序列l所示的冷休克蛋白。
所述冷休克蛋白的編碼序列為序列表中序列2所示的核苷酸序列。
可通過任何現有滅活方法滅活所述流產布魯氏菌(萬27/ceWa aZ^rt^)中的冷 休克蛋白，如缺失基因組中該蛋白的編碼序列、插入外源或內源序列、同源重組、 RNA干擾等。
所述同源重組是將DAll的DNA片段導入所述流產布魯氏菌(5n/ce//fl^oW^) 中實現的；所述DAll的DNA片段，從上游至下游依次為同源臂DA1卜1和同源臂 DA11-2;所述同源臂DA11-1和同源臂Mil-2能與所述流產布魯氏菌基因組中冷休 克蛋白編碼基因的上游序列和下游序列發生同源重組，滅活所述冷休克蛋白的編碼 基因。
所述同源臂DA11-1和同源臂DA11-2的長度均為400-600bp。 所述同源臂DA11-1具體可為以流產布魯氏菌2308 (5n/ce〃aa6om^ 2308)標 準株的基因組DNA為模板，用如下引物進行PCR擴增得到的DNA片段
pWUA381 (上游引物)5， - GGAATTCTGTCACGCTTCCAAGTC -3，； pWUA382 (下游引物)5， - AAGCTTCGTAAGAAATGCAGATTT -3，。 所述同源臂DA11-2具體可為以流產布魯氏菌2308 (^wceZ/aaZwrn^ 2308)標 準菌株的基因組DNA為模板，用如下引物進行PCR擴增得到的DNA片段
pWUA383 (上游引物)5' - TTACGAAGCTTGTCCGGTCTGTGCCATG-3，； pWUA384 (下游引物)5， - GGGGTACCGGAAAGAAGCAGATGG -3， 實驗證明，所述重組菌的毒力顯著低于出發菌株和現行疫苗株，而且免疫保護 效力與現有疫苗株相當。因此，該重組菌可用于開發流產布魯氏菌疫苗。 該布魯氏菌疫苗，其活性成分為上述流產布魯氏菌的重組菌。 本發明通過對布魯氏菌基因組中的功能基因進行篩選，發現冷休克蛋白編碼基 因的滅活可使流產布魯氏菌的毒力顯著降低。本發明通過將流產布魯氏菌的冷休克 蛋白的編碼基因滅活，得到了新的菌株，與出發菌株相比，該新菌株的毒力較小， 無需滅活就可以作為疫苗免疫動物。使用本發明的菌株免疫小鼠，通過PCR技術檢 測缺失基因片段的大小鑒定出患病動物體內分離到的菌株是疫苗菌株還是野生菌 株。本發明對布魯氏菌病疫苗的改造、診斷鑒別試劑的研制，開發布魯氏菌基因缺 失標記疫苗，促進全球動物布魯氏菌病的根除和凈化具有十分重要的意義。
以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。


圖1為DAI 1-1和DAI 1-2的PCR擴增結果 圖2為DA11的PCR連接結果
圖3為重組質粒pEX18AP-DA11轉化DH5 a后的PCR鑒定結果
圖4為重組質粒pEX18AP-DAll經EcoRI和Kpnl雙酶切后產物的PCR鑒定結果
圖5為重組載體pEX18AP-DA11的構建流程圖
圖6為流產布魯氏菌重組菌BIDA11的PCR鑒定結果
圖7為流產布魯氏菌重組菌BIDAll接種后小鼠脾臟的重量變化曲線
圖8為流產布魯氏菌重組菌BIDAll接種后小鼠脾臟的載菌量變化曲線
圖9為流產布魯氏菌重組菌BIDA11在小鼠體內的免疫保護實驗
具體實施例方式
下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。 以下實施例中所用的菌株和質粒如下
流產布魯氏菌標準菌株2308 (&wce//aa6oWws2308)、流產布魯氏菌疫苗菌株 S19 (購自中國獸藥監察所菌種室)；pEX18AP質粒(構建方法參見文獻TungT. Hoang, Gene 1998,212:77-86)。
實施例1、流產布魯氏菌重組菌的構建
根據布魯氏菌基因中的冷休克蛋白基因序列(GenBank Accession Number: BAB1—1532)，設計兩對引物， 一對引物用于擴增同源臂DA11-1，另一對引物用于 擴增DAll-2。同源臂DA11-1和同源臂DAll-2連接后形成序列DAll，將序列DAll 插入pEX18AP質粒，得到重組載體pEX18AP-DAll。重組載體pEX18AP-DAll與流產 布魯氏菌基因組發生同源重組即可得到滅活冷休克蛋白編碼基因的流產布魯氏菌 重組菌。
一、重組載體pEX18AP-DAll的構建 構建過程示意圖見圖5。
1、 布魯氏菌基因組的提取
取300y l滅活的流產布魯氏菌標準菌株2308，加入lml TNE (每升含有l. 21g Tris，5. 84g NaCl，0.37g EDTA)混勻，10000r/min離心，留沉淀棄上清。之后加入 135ul TNE重懸洗滌后的沉淀。再向其中加入135ul含2y。 Triton X-IOO的TNE，混 勻。加30y l新鮮配制的溶菌酶(5mg/ml)，輕彈試管混勻。37t:水浴孵育30min， 之后加入15ul蛋白酶K (20mg/ml)，渦旋混勻。65。C水浴至少孵育2h。
加入RNAse (使RNAse濃度達到10ixg/ml)，瓊脂糖凝膠電泳鑒定后將提取的 基因組DNA于4。C保存備用。
2、 PCR擴增上游片段DA11-1(539bp)和下游片段DAll-2(499bp) 擴增上游片段的引物如下
pWUA381 (上游引物)5, - GGAATTCTGTCACGCTTCCAAGTC -3，； pWUA382 (下游引物)5' - AAGCTTCGTAAGAAATGCAGATTT -3，。 上游引物中加入EcoRI酶切位點，下游引物中加入HindIII酶切位點。 擴增下游片段的引物如下
pWUA383 (上游引物)5， - TTACGAAGCTTGTCCGGTCTGTGCCATG-3，；
pWUA384 (下游引物)5， - GGGGTACCGGAAAGAAGCAGATGG -3， 上游引物中加入HindIII酶切位點，下游引物中加入KpnI酶切位點。 以步驟1得到的基因組DNA為模板，使用上述兩對引物對進行降落PCR。降落 PCR反應的具體條件是先94。C預變性3min;然后94。C變性45s;退火溫度從65 i:至5(TC每降rC運行2個循環，每個循環72i:延伸lmin;最后72°(3延伸1C min。 擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，見圖l。其中，1: DA11-1的PCR擴增產物， 2: DA11-2的PCR擴增產物，3: DNA分子量標準。結果表明，成功擴增出了目的片 段。
3、 DA11片段的獲得
通過PCR擴增將上游片段DA11-1和下游片段DA11-2連接，得到片段即為DA11 片段。PCR擴增所用的引物如下
pWUA381 (上游引物)5， - GGAATTCTGTCACGCTTCCAAGTC -3， pWUA384 (下游引物)5' -GGGGTACCGGAAAGAAGCAGATGG -3， PCR擴增體系
DA11-l片段1ul
DA11-2片段1ul
dNTP (2.5 mM)1ul
Taq酶2ul
10XTaq buffer5ul
pWUA381 (20pmol/ii 1)1ul
pWUA384 (20pmol/u 1)1ul
雙蒸水補足至50 ul38 ul擴增產物進行電泳檢測，見圖2。結果表明，成功獲得了將DAll-l和DAll-2 連接的DA11片段。
4、 pEX18AP-DA11質粒的構建
提取含有AMP抗性基因、SacB基因以及含有多克隆位點的pEX18AP質粒。將經 EcoRI和Kpnl雙酶切后的pEX18AP質粒與步驟3得到的DA11片段連接。將得到的 重組質粒命名為pEX18AP-DAll。
用pEX18AP-Mll轉化到DH5a大腸桿菌，然后進行藍白斑篩選。挑取陽性菌 株的單菌落進行搖菌培養，先進行PCR鑒定，鑒定引物如下
pWUA381 (上游引物)5， - GGAATTCTGTCACGCTTCCAAGTC -3， pWUA384 (下游引物)5， - GGGGTACCGGAAAGAAGCAGATGG -3， 結果見圖3。圖3中，1:陽性菌株的PCR產物，2: DNA分子量標準。 然后提取質粒并進行EcoRI和KpnI雙酶切鑒定。酶切鑒定的結果見圖4。圖4 中，1、 DNA分子量標準；2、重組質粒pEX18AP-DA11雙酶切產物的PCR結果。 將得到的含有重組質粒的菌株增殖，保存在-8(TC備用。 二、滅活冷休克蛋白編碼基因的布魯氏重組菌株獲得
在含有8mlTSB液體培養基的離心管中接種流產布魯氏菌2308標準菌株20 ul， 37。C培養48小時后，離心菌體并用預冷的三蒸水懸浮并轉入預冷的1. 5ml離心管 中，繼續離心洗滌3-4次。然后，加入適量的冷三蒸水懸浮菌液，取87ul菌液和 3ul質粒(pEX18AP-DAll)加入lmm的電極杯，將電極杯放入BIORAD電穿孔儀中，調 整儀器至Agr程序后，按Pulse鈕進行電擊。查詢電擊參數為2. 22KV。電擊后， 向電極杯中加入lml S0C培養液，轉入1.5ml離心管，室溫下靜置10rain，置于37 "C搖床復蘇12-18h。將轉化復蘇后的菌液涂布于TSB+A即(100ug/ul) 。 5-8天后 長出單個菌落。挑取單菌落至TSB液體培養基(無抗生素)37'C增殖48h，再將該 菌液稀釋10-IOO倍后，取100ul涂布于含有5y。蔗糖的TSA平板培養基。經過3-5 天后長出單菌落，將此菌落進行PCR鑒定，陽性菌株即為滅活冷休克蛋白編碼基因 的流產布魯氏菌的重組菌，將其命名為流產布魯氏菌重組菌BIDAll。 PCR鑒定用的引物如下
pWUA381 (上游引物)5， -GGAATTCTGTCACGCTTCCAAGTC -3， pWUA384 (下游引物)5， -GGGGTACCGGAAAGAAGCAGATGG -3，。 流產布魯氏菌重組菌BIDA11的PCR鑒定見圖6。圖6中，1、 DNA分子量標準； 2、流產布魯氏菌標準菌株2308的PCR產物；3、重組菌株BIDA11的PCR產物。
結果表明，獲得了通過雙交換滅活冷休克蛋白編碼基因的流產布魯氏菌 BIDAll。
實施例2、滅活冷休克蛋白的布魯氏菌重組菌的鑒定
試驗動物4-6周齡SPF級Balb/C雌鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限 公司，許可證編號為SCXK(京)2007-0001 。
一、毒力鑒定
將小鼠隨機分為三組，每組30只。具體接種方案如下第一組(試驗組)接種實施例l制備的流產布魯氏菌重組菌BIDAll，每只小
鼠腹腔接種劑量0. lml，內含107細菌。
第二組(對照組l):接種流產布魯氏菌標準菌株2308，每只小鼠腹腔接種劑 量O. lml，內含107細菌。
第三組(對照組2):接種流產布魯氏菌疫苗菌株S19，每只小鼠腹腔接種劑 量O. lml，內含107細菌。
分別于接種后第l、 2、 3、 4、 5和10周從每組小鼠中選5只，進行脾臟大小、 脾臟載菌量檢測評價。
脾臟重量隨時間的變化見圖7。其中，野生株表示接種流產布魯氏菌標準菌株 2308的實驗結果，S19表示接種流產布魯氏菌疫苗菌株S19的實驗結果，BIDA11 表示接種實施例1制備的流產布魯氏菌重組菌BIDA11的實驗結果。結果表明，流 產布魯氏菌重組菌BIDAll接種后，小鼠的脾臟與對照組1和2相比在感染早期腫 大顯著，但后期迅速下降。脾臟載菌量隨時間的變化見圖8。結果表明，流產布魯 氏菌重組菌BIDAll接種后，小鼠脾臟的載菌量與接種流產布魯氏菌疫苗株S19 (對 照組2)或接種流產布魯氏菌標準菌株2308 (對照組l)的小鼠相比有顯著降低， 表明該流產布魯氏菌重組菌BIDAll的毒力極低。
血清學檢測結果表明，接種流產布魯氏菌標準菌株2308、接種流產布魯氏菌疫 苗菌株S19或接種流產布魯氏菌重組菌BIDA11的小鼠血清通過布魯氏菌虎紅平板 凝集試驗抗原(中國獸醫藥品監察所制造，批號200801)檢測時，均能夠在2分鐘 內出現明顯的凝集反應，通過試管凝集試驗抗原(中國獸醫藥品監察所制造，批號 200603)檢測到的抗體效價達到1:100以上。
二、疫苗效力評價
將上述健康小鼠隨機分為三組，每組5只。三組小鼠分別注射流產布魯氏菌重 組菌株BIDAll、流產布魯氏菌疫苗菌株S19和PBS，具體如下
第一組(試驗組)接種實施例l制備的流產布魯氏菌重組菌株BIDAll，每只 小鼠腹腔接種劑量0. lml，內含107細菌。
第二組(疫苗對照組)接種流產布魯氏菌疫苗菌株S19，每只小鼠腹腔接種 劑量O. lml，內含107細菌。
第三組(空白對照組)接種0.01M pH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)，每只小鼠 腹腔接種劑量O. lml。
上述三組小鼠接種8周后，用流產布魯氏菌標準株2308進行攻毒保護試驗， 攻毒后兩周剖殺小鼠并采血，取脾臟稱重量并計算脾臟載菌量變化，評價免疫效力。 實驗設三次重復，脾臟的平均載菌量變化結果如圖9所示。圖中，對照組表示空白 對照組的實驗結果，S19表示疫苗對照組的實驗結果，BIDA11表示接種實施例1制 備的流產布魯氏菌的重組菌株BIDAll的實驗結果。小鼠體內攻毒結果表明，冷休 克蛋白編碼基因缺失的流產布魯氏菌重組菌BIDAll的毒力較小，無需滅活就可以 作為疫苗免疫動物，且免疫保護效力與現行疫苗菌株S19相當。
<160〉 2
<210〉 1
〈211〉 71
〈212〉 PRT <213〉人工序列
<400〉 1
Met Ala Gin Thr Gly Gin Val Lys Phe Phe Asn Thr Glu Lys Gly Phe 15 10 15
Gly Phe lie Lys Pro Asp Asp Gly Gly Ala Asp lie Phe Val His lie 20 25 30
Ser Ala Val Gin Ala Ser Gly Leu Pro Gly Leu Ala Asp Asn Gin Lys 35 40 45
Val Ser Tyr Glu Thr Glu Pro Asp Arg Arg Gly Lys Gly Pro Lys Ala 50 55 60
Val Asn lie Thr lie Thr Gly 65 70
〈210> 2
<211〉 216
<212〉 DNA <213>人工序列
〈400〉 2
atggc8C3ga ccgg3C3ggt cs33ttcttc aac3ccga肌33ggtttcgg tttc3tca^g 60
cccgatgatg gcggcgcgga catcttcgtg catatttctg cagttcaggc ttctggcctg 120
ccaggccttg ctgacaatca gaaggtttcc "tatgaaacgg aaccagatcg tcgtggaaaa 180
ggccccaagg ccgtgaacat caccattacc ggctga 21權利要求
1、流產布魯氏菌的重組菌，是將流產布魯氏菌(Brucella abortus)中的冷休克蛋白的編碼基因滅活得到的菌株。
2、 如權利要求1所述的重組菌，其特征在于所述冷休克蛋白是由序列表中 的序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質。
3、 如權利要求1或2所述的重組菌，其特征在于所述滅活是通過同源重組 實現的。
4、 如權利要求3所述的重組菌，其特征在于所述同源重組是將DNA片段DA11 導入所述流產布魯氏菌(5raceWa 實現的；所述DNA片段DAll從上游 至下游依次為同源臂DAll-1和同源臂DAll-2;所述同源臂DA11-1和同源臂DAll-2 能與所述流產布魯氏菌基因組中的冷休克蛋白編碼基因的上游序列和下游序列發 生同源重組，滅活所述冷休克蛋白的編碼基因。
5、 如權利要求4所述的重組菌，其特征在于所述同源臂DAll-l和同源臂 DAll-2的長度均為400-600bp。
6、 權利要求1至5中任一所述重組菌在制備布魯氏菌疫苗中的應用。
7、 一種布魯氏菌疫苗，其活性成分為權利要求1至5中任一所述的流產布魯 氏菌重組菌。
全文摘要
本發明公開了一種流產布魯氏菌的重組菌。本發明提供的流產布魯氏菌的重組疫苗菌，是將流產布魯氏菌(Brucella abortus)中的冷休克蛋白的編碼基因滅活得到的菌株。與出發菌株相比，本發明得到的菌株的毒力比現行疫苗S19小，無需滅活就可以作為疫苗免疫動物。使用本發明的菌株免疫小鼠，通過PCR方法可以將患病動物體內分離到的菌株是疫苗菌株還是野生菌株鑒定出來。本發明對布魯氏菌病疫苗的改造、診斷鑒別試劑的研制，開發布魯氏菌基因缺失標記疫苗和配套的鑒別診斷試劑，促進全球動物布魯氏菌病的根除和凈化具有十分重要的意義。
文檔編號C12N1/21GK101386833SQ200810224820
公開日2009年3月18日 申請日期2008年10月22日 優先權日2008年10月22日
發明者婕 任, 劉文娟, 劉文曉, 吳清民, 張春燕, 娜 李, 羽 楊, 牛建蕊, 真 王, 王曉夏, 茜 趙 申請人:中國農業大學