專利名稱：脂蛋白中膽固醇的分別定量法和定量用試劑的制作方法
本申請是申請號為99810984.3，申請日為1999年7月30日，發明名稱為“脂蛋白中膽固醇的分別定量法和定量用試劑”的分案申請。
技術范圍本發明涉及對臨床診斷很重要的低密度脂蛋白(以下稱為LDL)中膽固醇(以下稱為LDL膽固醇)的定量方法及其所用的定量試劑。此外，本發明還涉及對臨床診斷很重要的高密度脂蛋白(以下稱為HDL)中膽固醇(以下稱為HDL膽固醇)和LDL膽固醇連續分別定量法及其所用的試劑盒。此外，本發明還涉及臨床診斷中很重要的HDL膽固醇和總膽固醇〔HDL、LDL、極低密度脂蛋白(以下稱為VLDL)和乳糜微粒(以下稱為CM)中的所有膽固醇〕的連續分別定量法及其所用的定量試劑盒。
背景技術：
HDL的作用是清除動脈壁上的膽固醇向肝臟運輸，被稱為“有益清道夫”；此外LDL的作用是向動脈壁等外周組織運輸膽固醇，被稱為“有害搬運工”。臨床檢驗中HDL膽固醇濃度、LDL膽固醇濃度和總膽固醇濃度被用作動脈硬化疾病等有關脂質的疾病的綜合判斷指標。
對于這些膽固醇濃度，可用對各膽固醇具有特異性的專用試劑分別定量，也可以將自動分析儀設定為分別定量，但人們希望對各膽固醇有更高的特異性。此外，還未知有在同一檢測系統中對HDL膽固醇、LDL膽固醇、總膽固醇等進行連續分別定量的簡單自動分析方法。
發明的公開本發明的目的在于提供LDL膽固醇的定量方法及其所用的定量試劑。
此外，本發明的目的還在于提供同一檢品中HDL膽固醇和LDL膽固醇的連續分別定量方法及其所用的定量試劑盒。此外，本發明的目的還在于提供同一檢品中HDL膽固醇和總膽固醇的連續分別定量方法及其所用的定量試劑盒。
本發明涉及以下的(1)～(27)。
(1)機體樣品中LDL膽固醇的定量方法，其特征在于在a)機體樣品、b)膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶(以下稱為CH酶類)和c)在使b)記載的CH酶類只作用于LDL膽固醇的試劑存在下，進行膽固醇的反應，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶而定量LDL膽固醇的濃度。
(2)根據(1)記載的定量方法，只作用于LDL膽固醇的CH酶類的試劑至少含有聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。
(3)根據(2)記載的定量方法，其中聚氧乙烯衍生物為聚氧乙烯烷基醚或聚氧乙烯烷基芳香醚。
(4)根據(2)或(3)記載的定量方法，其中聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物為通式(I)HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H(I)〔式中a、b和c相同或不同，表示1～200的整數〕所示的表面活性劑。
(5)機體樣品中HDL膽固醇和LDL膽固醇的分別定量方法，其特征在于在a)機體樣品、b)CH酶類和c)在使b)記載的CH酶類只作用于HDL膽固醇的試劑存在下，進行第1次膽固醇反應，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶而定量HDL膽固醇的濃度；接著d)加入使b)記載的CH酶類只作用于LDL膽固醇的試劑，進行第2次膽固醇反應，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶而定量LDL膽固醇的濃度。
(6)機體樣品中HDL膽固醇和LDL膽固醇的分別定量方法，其特征在于在
a)機體樣品、b)CH酶類和c)在使b)記載的CH酶類只作用于HDL膽固醇的試劑存在下，進行第1次膽固醇反應，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶而定量HDL膽固醇的濃度；接著加入d)CH酶類和e)加入使d)記載的CH酶類只作用于LDL膽固醇的試劑，進行第2次膽固醇反應，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶而定量LDL膽固醇的濃度。
(7)根據(5)或(6)記載的定量方法，其中使CH酶類只作用于LDL膽固醇的試劑，至少含有聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。
(8)根據(7)記載的定量方法，其中聚氧乙烯衍生物為聚氧乙烯烷基醚或聚氧乙烯烷基芳基醚。
(9)根據(7)或(8)記載的定量方法，其中聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物為通式(I)HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H(I)〔式中a、b和c相同或不同，表示1～200的整數〕所示的表面活性劑。
(10)機體樣品中HDL膽固醇和總膽固醇的分別定量方法，其特征在于在a)機體樣品、b)CH酶類和c)在使b)記載的CH酶類只作用于HDL膽固醇的試劑存在下，進行第1次膽固醇反應，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶而定量HDL膽固醇的濃度；接著d)加入使b)記載CH酶類作用于全部脂蛋白中的膽固醇的試劑，進行第2次膽固醇反應，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶而定量總膽固醇。
(11)機體樣品中HDL膽固醇和總膽固醇的分別定量方法，其特征在于在a)機體樣品、b)CH酶類和c)在使b)記載的CH酶類只作用于HDL膽固醇的試劑存在下，進行第1次膽固醇反應，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶而定量HDL膽固醇的濃度；接著加入d)CH酶類和e)使d)記載的CH酶類作用于全部脂蛋白的膽固醇的試劑，進行第2次膽固醇反應，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶而定量總膽固醇。
(12)根據(5)～(11)任一項記載的定量方法，其中使b)記載的CH酶類只作用于HDL膽固醇的試劑，為使HDL以外的脂蛋白凝聚的試劑。
(13)根據(12)記載的定量方法，使HDL以外的脂蛋白凝聚的試劑還含有不溶解凝聚脂蛋白的非離子性表面活性劑。
(14)根據(12)或(13)記載的定量方法，使HDL以外的脂蛋白凝聚的試劑為肝素或其鹽、磷鎢酸或其鹽、硫酸右旋糖酐或其鹽、聚乙二醇、硫酸環糊精或其鹽、硫酸寡糖或其鹽、或它們的混合物、與2價金屬鹽構成的試劑。
(15)根據(6)或(11)記載的定量方法，第1次膽固醇反應所用的CH酶類為化學修飾的酶，第2次膽固醇反應所用的CH酶類為未經化學修飾的酶。
(16)根據(10)～(15)任一項記載的定量方法，使CH酶類作用于全部脂蛋白中的膽固醇的試劑含有溶解脂蛋白的表面活性劑。
(17)由CH酶類和使CH酶類只作用于LDL膽固醇的試劑構成的LDL膽固醇定量用試劑。
(18)根據(17)記載的LDL膽固醇定量用試劑，其中使CH酶類只作用于LDL膽固醇的試劑至少含有聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。
(19)根據(18)記載的定量試劑，其中聚氧乙烯衍生物為聚氧乙烯烷基芳基醚。
(20)根據(18)或(19)記載的LDL膽固醇定量用試劑，其中聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物為通式(I)HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H(I)〔式中a、b和c相同或不同，表示1～200的整數〕所示的表面活性劑。
(21)分別定量HDL膽固醇和LDL膽固醇的試劑盒，由第1試劑和第2試劑構成，第1試劑為含有使HDL脂蛋白以外的脂蛋白凝聚的試劑和CH酶類的試劑，第2試劑為含有使CH酶類只作用于LDL膽固醇的試劑的試劑。
(22)根據(21)記載的試劑盒，使CH酶類只作用于LDL膽固醇的試劑含有聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。
(23)根據(21)記載的試劑盒，其中聚氧乙烯衍生物為聚氧乙烯烷基芳基醚。
(24)根據(21)或(22)記載的試劑盒，其中聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物為通式(I)HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H(I)〔式中a、b和c相同或不同，表示1～200的整數〕所示的表面活性劑。
(25)分別定量HDL膽固醇和總膽固醇的試劑盒，由第1試劑和第2試劑構成，第1試劑為含有使HDL脂蛋白以外的脂蛋白凝聚的試劑和CH酶類的試劑，第2試劑為含有使CH酶類只作用于LDL膽固醇的試劑的試劑。
(26)根據(25)記載的試劑盒，其中使CH酶類作用于全部脂蛋白中的膽固醇的試劑含有溶解脂蛋白的表面活性劑。
(27)根據(21)～(26)任一項記載的試劑盒，使HDL以外的脂蛋白凝聚的試劑為肝素或其鹽、磷鎢酸或其鹽、硫酸右旋糖酐或其鹽、聚乙二醇、硫酸環糊精或其鹽、硫酸寡糖或其鹽、或它們的混合物、與2價金屬鹽構成的試劑。
下面對本發明進行詳細的說明。
本發明涉及往含上述各種脂蛋白的機體樣品中加入使CH酶類只作用于LDL膽固醇的特定試劑(以下稱為試劑A)而定量LDL膽固醇的方法及其所用的試劑。
此外，本發明還涉及往含上述各種脂蛋白的機體樣品中加入使CH酶類只作用于HDL膽固醇的特定試劑(以下稱為試劑B)而定量HDL膽固醇，接著加入試劑A定量LDL膽固醇的分別定量方法及其所用的試劑盒。
此外，本發明還涉及往含上述各種脂蛋白的機體樣品中加入試劑B定量HDL膽固醇，接著加入使CH酶類作用于全部脂蛋白中的膽固醇的試劑(以下稱為試劑C)而定量總膽固醇的分別定量方法及其所用的試劑盒。
適用于本發明的機體樣品沒有特殊的限定，具體地說可以使用血液自身或血漿、血清等血液成分。
本發明中定量膽固醇的反應在水性介質、特別是緩沖液中進行。
作為緩沖液中所用的緩沖劑，例如有三(羥甲基)氨基甲烷、磷酸緩沖劑、硼酸緩沖劑和Good緩沖劑等。作為Good緩沖劑，例如有N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、N-(2-乙酰氨基)亞氨基二乙酸(ADA)、N，N-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-〔N，N-雙(2-羥乙基)氨基〕-2-羥基丙磺酸(DIPSO)、N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(以下稱為MES)、3-(N-嗎啉代)丙磺酸(以下稱為MOPS)、3-(N-嗎啉代)-2-羥基丙磺酸(MOPSO)、哌嗪-N，N’-雙(2-乙磺酸)(以下稱為PIPES)、哌嗪-N，N’-雙(2-羥基丙-3-磺酸)(POPSO)等。
緩沖液的pH為5～10，優選6～9。緩沖劑的濃度為5～500mM，優選20～200mM。
使CH酶類只作用于LDL膽固醇的試劑A是不使CH酶類作用于HDL、VLDL和CM中的膽固醇的試劑。試劑A即使在使后述HDL以外脂蛋白凝聚的試劑存在下也能夠使CH酶類只作用于LDL膽固醇。
作為該試劑A，例如有至少含有聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物的試劑。
作為聚氧乙烯衍生物，例如有聚氧乙烯烷基芳基醚和聚氧乙烯烷基醚等；作為該烷基，為碳數8以上、例如辛基、壬基等；作為該芳基，例如有苯基等。
作為具體的聚氧乙烯衍生物，例如有Nonion HS-210、Nonion HS-215、Nonion NS-208.5、Nonion HS-208(以上為日本油脂公司制造)、Emulgen L-40、Emulgen 911、Emulgen 810(以上花王公司制造)等市售品。聚氧乙烯衍生物的親水親油平衡值(以下稱為HLB)優選9～20。
作為聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，可以是聚氧乙烯和聚氧丙烯的無規共聚物、也可以是嵌段共聚物，例如通式(I)HO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H(I)〔式中a、b和c相同或不同，表示1～200的整數〕所示的化合物。
作為通式(I)所示的化合物，例如有Pluronic L-121、PluronicL-122、Pluronic L-101、Pluronic P-103、Pluronic F-108等市售品(均為旭電化公司制造)。此外，作為通式(I)所示化合物中聚丙二醇基團的分子量，優選2050以上，更優選2750以上，特別優選3250以上。聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物的HLB優選1～6。
聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物的使用濃度沒有特殊的限定，優選分別各自為0.001～10％，更優選0.1～5％，特別優選0.05～1％。
作為使CH酶類只作用于HDL膽固醇的試劑B，有使HDL以外的脂蛋白凝聚的試劑和HDL以外的脂蛋白的抗體等。
使HDL以外的脂蛋白凝聚的試劑，使用含有該脂蛋白的凝聚劑和/或2價金屬鹽的試劑。作為凝聚劑，有肝素或其鹽、磷鎢酸或其鹽、硫酸右旋糖酐或其鹽、聚乙二醇、硫酸環糊精或其鹽、硫酸寡糖或其鹽、或它們的混合物等；作為環糊精，有α～環糊精、β-環糊精、γ-環糊精等；作為寡糖，有甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖、甘露六糖、甘露七糖等；作為鹽，有鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鎂鹽等。作為2價的金屬鹽，有鎂鹽、鈣鹽、錳鹽、鎳鹽等。
作為凝聚劑，使用0.02～10mM分子量5000～20000的肝素或其鹽、0.1～10mM分子量4000～8000的磷鎢酸或其鹽、0.01～5mM分子量10000～500000的硫酸右旋糖酐或其鹽、0.1～20mM分子量1000～10000的硫酸右旋糖酐或其鹽、0.3～100mM分子量4000～25000的聚乙二醇(PEG)、0.1～50mM分子量1000～3000的硫酸環糊精或其鹽、0.1～50mM分子量400～3000的硫酸寡糖或其鹽、或它們的混合物。優選使用0.03～1mM分子量14000～16000的肝素或其鹽、0.1～3mM分子量5000～7000的磷鎢酸或其鹽、0.01～5mM分子量150000～250000的硫酸右旋糖酐或其鹽、0.1～10mM分子量1000～5000的硫酸右旋糖酐或其鹽、1.0～50mM分子量5000～22000的PEG、0.1～10mM分子量1000～2000的硫酸環糊精或其鹽、0.1～10mM分子量400～2000的硫酸寡糖或其鹽、或它們的混合物等。
作為2價金屬，有0.1～50mM的鎂鹽、鈣鹽、錳鹽、鎳鹽、鈷鹽等，優選0.1～50mM的鎂鹽。
使HDL以外的脂蛋白凝聚的試劑優選含有不溶解凝聚脂蛋白的非離子性表面活性劑。
作為不溶解凝聚脂蛋白的非離子性表面活性劑，有聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基芳基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽、烷基苯磺酸鹽等。其中，作為聚氧乙烯烷基醚，優選聚氧乙烯醚〔Emulgen 220(花王公司制造)〕；作為聚氧乙烯烷基芳基醚，優選市售品Emulgen B66等；作為聚氧乙烯-聚氧丙烯聚合物，優選市售品Plurconic F88(旭電化公司制造)等；優選聚氧乙烯烷基醚硫酸鈉〔作為市售品，有Emal 20C(花王公司制造)等〕；作為烷基苯磺酸鹽，優選十二烷基苯磺酸鈉。
不溶解凝聚脂蛋白的非離子性表面活性劑，只要不使CH酶類不能作用于LDL膽固醇，可以組合使用，優選單獨使用。所用濃度沒有特殊的限定，優選0.01～10％，特別優選0.1～5％。
HDL以外脂蛋白的抗體，有抗阿樸脂蛋白B抗體、抗阿樸脂蛋白C抗體、抗阿樸脂蛋白E抗體、抗β脂蛋白抗體等，單獨或組合使用。作為抗體，可以是多克隆抗體也可以是單克隆抗體。此外這些抗體可以是用酶或化學分解、修飾的。
作為使CH酶類作用于全部脂蛋白中的膽固醇的試劑C，例如有溶解全部脂蛋白的表面活性劑。
作為該表面活性劑，使用溶解HDL、LDL、VLDL和CM的脂蛋白的非離子性表面活性劑。具體地說，有作為市售品的Triton X-100等非離子表面活性劑、Emulgen 106、Emulgen 108、Emulgen 709等聚氧乙烯烷基醚等。這些表面活性劑可以單獨或組合使用。所用濃度沒有特殊的限定，優選0.01～10％，特別優選0.1～5％。
作為本發明所用的具有膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶和膽固醇脫氫酶活性的酶，例如有具水解膽固醇酯能力的微生物或動物來源的膽固醇酯酶和脂蛋白脂肪酶、氧化膽固醇生成過氧化氫的微生物來源膽固醇氧化酶、微生物或動物來源的膽固醇脫氫酶等。
這些酶根據特異的基質而使用。例如定量HDL膽固醇時優選使用對該膽固醇特異的酶，定量LDL膽固醇時優選使用對該膽固醇特異性的酶。為了進一步賦予這些酶特異性、穩定性，用聚乙二醇為主要成分的基團、水溶性寡糖殘基、磺丙基等對這些酶進行化學修飾。此外，也可使用基因工程所得的酶。
作為用于修飾酶的試劑(化學修飾劑)，為聚乙二醇上結合有可結合氨基的基團的化合物，例如聚乙二醇上結合有能夠和N-羥基琥珀酰亞氨基等氨基結合的基團的サンブライド VFM4101〔日本油脂公司制造〕等、具有聚烷撐二醇結構和酸酐結構的サンブライド AKM系列、同類的ADM系列、同類的ACM系列〔皆為日本油脂公司制造化學工學論文集，第20卷，第3號，459頁，1994年〕、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物上結合有能結合氨基的化合物、聚乙二醇單甲基丙烯酰單甲基醚和馬來酸酐的共聚物等。此外，可以使用作為聚氨酯化學修飾劑的活化聚氨酯P4000(Beringer Mannhaim公司制造，酶修飾規程手冊)、作為右旋糖酐化學修飾劑的右旋糖酐T40、活化TCT(同)、1，3-丙烷サルトン等。應用這些化學修飾劑，可以修飾酶、以聚乙二醇為主要成分的基團、以聚丙二醇為主要成分的基團、具有聚丙二醇和聚乙二醇共聚物的基團、結構中含糖的基團、磺丙基、聚氨酯基團等。
酶和上述化學修飾劑反應的方法應用《蛋白質的雜交》、稻田佑二著、共立出版社(1987年)等記載的方法。例如使用サンブラィド時，將酶溶解于pH8以上的HEPES緩沖液等緩沖液中，在0～50℃下加入0.01～500倍摩爾量的サンブライド，攪拌5～60分鐘。此反應液可以保持原樣或根據需要以超過濾膜除去低分子物后使用。
本發明中膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶和膽固醇脫氫酶的用量在反應液中分別優選0.01～200U/毫升，更優選0.1～100U/毫升。
在本發明中，HDL膽固醇定量時使用的CH酶類在LDL膽固醇或HDL以外的膽固醇或總膽固醇定量時也可以就這樣使用，也可以在LDL膽固醇或HDL以外的膽固醇或總膽固醇定量時加入新的相同或底物特異性不同的CH酶類。
HDL膽固醇定量時所用的CH酶類優選使用化學修飾的酶，LDL或HDL以外的脂蛋白中膽固醇或總膽固醇定量時優選使用沒有化學修飾的CH酶類。
在本發明的膽固醇反應中，在對反應特異性沒有影響的范圍內為了活化CH酶類可以使用常用的表面活性劑或膽酸類；此外，為了溶解球蛋白等可以使用各種鹽類。
作為活化CH酶類的表面活性劑，例如陰離子表面活性劑在0～5％的范圍內使用。作為膽酸，膽酸、去氧膽酸、牛磺膽酸、鵝去氧膽酸等在0～5％的范圍內使用。作為陰離子表面活性劑，有1-戊磺酸鹽、1-己磺酸鹽、1-庚磺酸鹽、1-辛磺酸鹽等烷基磺酸鹽在0～5％的范圍內使用。
作為鹽類，氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、氯化鎂、硫酸鎂、乙酸鎂、氯化鋰、硫酸鋰、氯化銨、硫酸銨、硝酸鎂、硝酸鈣等在0～100mM的范圍內使用。
膽固醇反應用膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶進行時，生成過氧化氫。生成的過氧化氫，例如可以在過氧化酶的存在下，用4-氨基安替比林和酚類、4-氨基安替比林和トリンダ-試劑或高敏感度的色素源進行定量。
作為酚類，例如有苯酚、4-氯苯酚、間甲酚、3-羥基-2，4，6-三碘苯甲酸(HTIB)等。
作為トリンダ-試劑(同仁化學研究所第19版總目錄、1994年)，有N-磺丙基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-間甲苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-磺丙基-間甲苯胺(TOPS)、N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N，N-二甲基-間甲苯胺、N，N-二磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-間甲氧基苯胺、N-乙基-N-磺丙基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺、N-磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-3，5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-間甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺等苯胺類或N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰基乙二胺(EMSE)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-乙酰基乙二胺等。
作為高敏感度的色素源，有特公昭60-33479所示的10-(N-甲基氨基甲酰基)-3，7-雙(二甲基氨基)吩噻嗪(MCDP)、特公平4-27839所示的雙〔3-雙(4-氯苯基)甲基-4-二甲基氨基苯基〕胺(BCMA)、特開昭62-296所示的化合物等。
作為這些色素源的濃度，優選0.01～10毫克/毫升。
膽固醇的反應，在底物氧化型輔酶NAD(P)存在下，應用膽固醇酯酶和膽固醇脫氫酶進行反應時，生成還原型輔酶NAD(P)H。NAD(P)H可以在300～500nm、優選330～400nm、特別優選約340nm下通過測定反應液的吸光度而定量。還有，NAD(P)H的定量可以通過加入黃遞酶、四唑鎓鹽使甲色素生色，然后對甲色素進行比色。
定量LDL膽固醇的反應在10～50℃下、優選30～40℃下進行，通常在37℃下、進行1～30分鐘，優選2～10分鐘。
分別定量時，定量HDL膽固醇的反應(以下稱為第1反應)在10～50℃下、優選30～40℃下進行，通常在37℃下、進行1～30分鐘，優選2～10分鐘；定量LDL膽固醇或總膽固醇的反應(以下稱為第2反應)在10～50℃下、優選30～40℃下進行，通常在37℃下、進行1～30分鐘，優選2～10分鐘。第2反應的開始可以是第1反應實質上終止后、第1反應進行中或完成了HDL定量的任一個時期。第2反應在添加了特異作用于LDL膽固醇的CH酶類的試劑A或作用于全部脂蛋白中膽固醇的CH酶類的試劑C和根據需要的CH酶類后開始。定量第2反應中產生的過氧化氫或還原型輔酶〔NAD(P)H〕的試劑可以是第1反應液中使用的，也可根據需要加入新的。
在本發明中，HDL膽固醇反應后進行LDL膽固醇的反應，分別定量HDL膽固醇和LDL膽固醇時，如上述的LDL膽固醇反應以添加試劑A引發；第1的HDL膽固醇反應，在添加上述不溶解HDL以外凝聚脂蛋白的非離子表面活性劑、即聚氧乙烯衍生物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物的任一個引發時，第2的LDL膽固醇反應，可以添加HDL膽固醇反應中所用的表面活性劑及試劑A組成的表面活性劑引發。
各脂蛋白中膽固醇的濃度根據使用樣品時各反應前后吸光度的差(ΔOD)和使用各種脂蛋白中膽固醇濃度已知的樣品時吸光度的差(ΔODstd)按下面的計算方法算出。
LDL膽固醇濃度可從ΔOD÷ΔODstd×(已知的LDL膽固醇濃度)求出。HDL膽固醇濃度例如可以從ΔOD÷ΔODstd×(已知的HDL膽固醇濃度)求出。還有，分別定量時，第1反應和第2反應生成的化合物相同、檢測方法相同時，總膽固醇濃度用第1反應前和第2反應后的吸光度差按ΔOD÷ΔODstd×(已知的總膽固醇濃度)算出。
作為本發明的LDL膽固醇定量試劑，為含有CH酶類、聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物的試劑。該LDL膽固醇定量試劑中可根據需要含有上述緩沖劑、凝聚HDL以外脂蛋白的試劑、定量膽固醇所用的表面活性劑、膽酸類、各種鹽類、過氧化酶等酶、4-氨基安替比林和トリンダ-試劑等色源等、NAD(P)等氧化型輔酶。
本發明的分別定量HDL膽固醇和LDL膽固醇的試劑盒，由第1試劑和第2試劑的試劑盒構成，例如第1試劑由含有HDL以外脂蛋白的凝聚劑和CH酶類的試劑構成，第2試劑由含有聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物的試劑構成。
此外，本發明的分別定量HDL膽固醇和總膽固醇的試劑盒，由第1試劑和第2試劑的試劑盒構成，例如第1試劑由含有HDL以外脂蛋白的凝聚劑和CH酶類的試劑構成，第2試劑由含有溶解全部脂蛋白(HDL、LDL、VLDL和CM)的非離子性表面活性劑的試劑構成。
本發明試劑盒的第1試劑或第2試劑中，可根據需要含有上述緩沖劑、定量膽固醇所用的表面活性劑、膽酸類、各種鹽類、過氧化酶等酶、4-氨基安替比林和トリンダ-試劑等色源等、NAD(P)等氧化型輔酶。
第2試劑中，可根據需要使用和第1試劑相同或不同來源的CH酶類。第1試劑中使用的CH酶類優選上述化學修飾的酶，第2試劑中使用的CH酶類優選使用沒有化學修飾的酶。
附圖的簡單說明

圖1表示本發明方法(圖中以DB HDL-C表示)所得的HDL膽固醇濃度和對照方法(L HDL-C方法，圖中以S HDL-C表示)所得的HDL膽固醇濃度的相關性。
圖2表示本發明方法(圖中以DB LDL-C表示)所得的LDL膽固醇濃度和對照方法(L LDL-C方法，圖中以S LDL-C表示)所得的LDL膽固醇濃度的相關性。
圖3表示本發明方法(圖中以DB-TC表示)所得的總膽固醇濃度和對照方法(L TC II方法，圖中以L TC II表示)所得的總膽固醇濃度的相關性。
圖4表示本發明方法(圖中以DB HDL-C表示)所得的HDL膽固醇濃度和對照方法(L HDL-C方法，圖中以S HDL-C表示)所得的HDL膽固醇濃度的相關性。
圖5表示本發明方法(圖中以本法表示)所得的LDL膽固醇濃度和對照方法(圖中以對照方法表示)Friedewald的計算式所得的LDL膽固醇濃度的相關性。
發明實施的最佳形式實施例1(HDL膽固醇和LDL膽固醇的定量)試劑1(pH＝7)MES(Nakalai Tesque公司制造) 20mM硫酸右旋糖酐(東京化成公司制造) 0.23毫克/毫升硫酸鎂(關東化學公司制造) 1.5毫克/毫升HDAOS(同仁化學公司制造) 0.23毫克/毫升4-氨基安替比林(埼京化成公司制造)0.13毫克/毫升聚乙二醇修飾的膽固醇酯酶(*1) 0.25U/毫升聚乙二醇修飾的膽固醇氧化酶(*2) 1.65U/毫升過氧化酶(東洋紡公司制造) 12.5U/毫升*150克膽固醇酯酶(天野制藥公司制造)溶于1升0.1M HEPES緩沖液(pH8.5)，在25℃下加入330克サンブライトVFM4101，攪拌2小時調制而成。
*250克膽固醇氧化酶(協和發酵工業公司制造)溶于1升0.1MHEPES緩沖液(pH8.0)，在15℃下加入10克サンブライトVFM4101，攪拌2小時調制而成。
試劑2(pH＝7)MES(Nakalai Tesque公司制造) 20mM膽固醇酯酶(脂蛋白脂肪酶、東洋紡公司制造)3U/毫升膽固醇氧化酶(協和發酵工業公司制造) 2U/毫升Pluronic L-121(旭電化公司制造) 0.7％
Emulgen L-40(花王公司制造) 0.5％氯化鈣(和光純藥公司制造) 0.1毫克/毫升作為樣品，使用健康人血清樣品30份，按下述操作定量樣品中HDL膽固醇和LDL膽固醇。往2.25毫升試劑1中加入30微升樣品，攪拌，隨后測定585nm的吸光度E1。接著在37℃下反應5分鐘后，測定相同吸收波長的吸光度E2。往其中再加入0.75毫升試劑2，攪拌，隨后測定585nm的吸光度E3。接著在37℃下反應5分鐘后測定相同吸收波長的吸光度E4。另一方面，膽固醇已知濃度的血清進行相同的操作，求出各吸光度E1std、E2std、E3std和E4std。
HDL膽固醇濃度從上述吸光度根據式(E2-E1)÷(E2std-E1std)×(已知HDL膽固醇濃度)求出。同樣地，LDL膽固醇濃度也從上述吸光度根據式(E4-E3)÷(E4std-E3std)×(已知LDL膽固醇濃度)求出。
此外，使用其它各膽固醇的個別定量用市售試劑盒Determiner LHDL-C(協和梅迪克斯公司制造)和Determiner L LDL-C(協和梅迪克斯公司制造)，定量各樣品中HDL膽固醇濃度、LDL膽固醇濃度。計算該市售試劑盒所得定量值和本發明方法所得定量值的相關系數，HDL膽固醇為0.997，LDL膽固醇為0.988。
圖1表示本發明方法(圖1中以DB HDL-C表示)所得的HDL膽固醇濃度和對照方法(L HDL-C方法，圖1中以S HDL-C表示)所得的HDL膽固醇濃度的相關性。此外，圖2表示本發明方法(圖2中以DB LDL-C表示)所得的LDL膽固醇濃度和對照方法(L LDL-C方法，圖2中以S LDL-C表示)所得的LDL膽固醇濃度的相關性。
實施例2(HDL膽固醇和LDL膽固醇的定量)試劑1(pH＝7)MES(Nakalai Tesque公司制造) 20mM磷鎢酸(和光純藥公司制造)7.5毫克/毫升硫酸鎂(和光純藥公司制造)1.5毫克/毫升TOOS(同仁化學公司制造) 0.5毫克/毫升
EmulgenB66(花王公司制造)10毫克/毫升4-氨基安替比林(京化成公司制造) 0.5毫克/毫升膽固醇酯酶(LPBP、旭化成公司制造)4U/毫升膽固醇氧化酶(rCO、Oriental酵母公司制造) 2U/毫升過氧化酶(東洋紡公司制造) 10U/毫升試劑2(pH＝7)MES(Nakalai Tesque) 50mM膽固醇酯酶(脂蛋白脂肪酶、東洋紡公司制造)3U/毫升膽固醇氧化酶(協和發酵工業公司制造) 2U/毫升Pluronic L-121(旭電化公司制造) 0.7％Emulgen L-40(花王公司制造) 0.5％氯化鈣(和光純藥公司制造)0.1毫克/毫升使用實施例1相同的樣品，除測定波長為555nm外，其它同實施例1一樣進行操作，定量HDL膽固醇和LDL膽固醇。計算市售試劑盒(上述Determiner L HDL-C和Determiner L LDL-C)所得定量值和本發明方法所得定量值的相關系數，HDL膽固醇為0.929，LDL膽固醇為0.911。
實施例3(HDL膽固醇和總膽固醇的定量)試劑1(pH＝7)MES(Nakalai Tesque)20mM硫酸右旋糖酐(東京化成公司制造) 0.23毫克/毫升硫酸鎂(關東化學社制造) 1.5毫克/毫升HDAOS(同仁化學公司制造) 0.23毫克/毫升4-氨基安替比林(京化成公司制造) 0.13毫克/毫升聚乙二醇修飾的膽固醇酯酶(*1) 0.25U/毫升聚乙二醇修飾的膽固醇氧化酶(*2) 1.65U/毫升過氧化酶 12.5U/毫升*1和實施例1的*1一樣調制*2和實施例1的*2一樣調制試劑2(pH＝6.75)MES(Nakalai Tesque) 30mMTriton X-100(Sigma公司制造) 1克/升膽固醇酯酶(東洋紡公司制造)2.4U/毫升膽固醇氧化酶(天野制藥公司制造)6.25U/毫升作為樣品，準備實施例1所用的健康人血清檢品30份，按下述操作定量HDL膽固醇和總膽固醇。
往2.25毫升試劑1中加入樣品30微升，攪拌，隨后測定585nm的吸光度E1。接著在37℃下反應5分鐘后，測定相同吸收波長的吸光度E2。往其中再加入0.75毫升試劑2，攪拌，隨后測定585nm的吸光度E3。接著在37℃下反應5分鐘后測定相同吸收波長的吸光度E4。另一方面，膽固醇已知濃度的血清進行相同的操作，求出各吸光度E1std、E2std、E3std和E4std。
HDL膽固醇濃度從上述吸光度根據式(E2-E1)÷(E2std-E1std)×(已知HDL膽固醇濃度)求出。同樣地，總膽固醇濃度也從上述吸光度根據式(E4-E1)÷(E4std-E1std)×(已知總膽固醇濃度)求出。
此外，使用其它各膽固醇的個別定量用市售試劑盒Determiner LHDL-C(協和梅迪克斯公司制造)和Determiner L TC II(協和梅迪克斯公司制造)，定量各樣品中HDL膽固醇濃度、總膽固醇濃度。計算該市售試劑盒所得定量值和本發明方法所得定量值的相關系數，HDL膽固醇為0.992，總膽固醇為0.999。
圖3表示本發明方法(圖3中以DB-TC表示)所得的總膽固醇濃度(毫克/dL)和對照方法(L TC II方法，圖3中以L TC II表示)所得的總膽固醇濃度(毫克/dL)的相關性。
圖4表示本發明方法(圖4中DB HDL-C表示)所得的HDL膽固醇濃度(毫克/dL)和對照方法(L HDL-C方法，圖4中以S HDL-C表示)所得的HDL膽固醇濃度(毫克/dL)的相關。
實施例4
試劑1(pH7.25)PIPES(Nakalai Tesque公司制造) 50mMHDAOS(同仁化學公司制造) 0.3毫克/毫升第2試劑(pH7.25)PIPES(Nakalai Tesque公司制造) 50mM膽固醇酯酶(脂蛋白脂肪酶，東洋紡公司制造) 5U/毫升膽固醇氧化酶(協和發酵工業公司制造)1U/毫升過氧化酶(東洋紡公司制造) 20U/毫升4-氨基安替比林(埼京化成公司制造)0.51毫克/毫升氯化鈣(和光純藥公司制造) 0.1毫克/毫升表面活性劑(表1記載的種類和濃度)作為樣品，使用以超離心法從人血清分離的HDL、LDL、VLDL和CM。還有，各脂蛋白的組分自福祉醫療技術振興會得到。該組分根據Adv.Lipid.Res，6(1968)〔血漿脂蛋白分析的實用方法，Hatch F和Lees R〕調制。還有，本實驗中所用的各脂蛋白中膽固醇濃度根據Determiner L TC II(協和梅迪克斯公司制造)定量的結果是，HDL為73毫克/dL，LDL為264毫克/dL，VLDL為84毫克/dL，CM為17毫克/dL。
將300微升第1試劑和4微升各樣品混合，在37℃下保溫5分鐘。測定此時的吸光度，接著加入100微升第2試劑進行反應，測定5分鐘后的吸光度。使用日立7070自動分析裝置，主波長600nm，副波長700nm。
作為樣品，用LDL組分所得反應前后的吸光度差為ALDL，用HDL組分所得反應前后的吸光度差為AHDL，用VLDL組分所得反應前后的吸光度差為AVLDL，用CM組分所得反應前后的吸光度差為ACM。
結果如表1所示。結果表示為AHDL/ALDL值、AVLDL/ALDL值和ACM/ALDL值。這些值越小就越表示為對LDL特異的定量條件。
表1

如表1所示，表面活性劑組合使用與表面活性劑單獨使用相比，膽固醇反應變為LDL膽固醇特異性。
實施例5第1試劑(pH6.75)MOPS(Nakalai Tesque公司制造) 50mM
HDAOS(同仁化學公司制造)0.3毫克/毫升第2試劑(pH6.75)MOPS(Nakalai Tesque公司制造)50mM膽固醇酯酶(脂蛋白脂肪酶，東洋紡織公司制造) 1U/毫升膽固醇氧化酶(協和發酵工業公司制造) 3U/毫升過氧化酶(東洋紡公司制造) 20U/毫升4-氨基安替比林(埼京化成公司制造) 0.51毫克/毫升氯化鈣(和光純藥工業公司制造) 0.1毫克/毫升表面活性劑(如表2記載的種類和濃度)除使用表2的表面活性劑外，和實施例4一樣實驗，求出ALDL、AHDL、AVLDL和ACM，算出AHDL/ALDL值、AVLDL/ALDL值和ACM/ALDL值。還有，本實驗中所用的各脂蛋白中膽固醇濃度根據Determiner L TC II(協和梅迪克斯公司制造)定量的結果是，HDL為81毫克/dL，LDL為263毫克/dL，VLDL為72毫克/dL，CM為14毫克/dL。
結果如表2所示。
表2

如表2所示，表面活性劑組合使用與表面活性劑單獨使用相比，
膽固醇反應變為LDL膽固醇特異性。
實施例6第1試劑(pH6.75)MOPS(Nakalai Tesque公司制造) 20mMHDAOS(同仁化學公司制造) 0.3毫克/毫升第2試劑(pH6.75)MOPS(Nakalai Tesque公司制造) 20mM膽固醇酯酶(脂蛋白脂肪酶，東洋紡織公司制造) 2U/毫升膽固醇氧化酶(協和發酵工業公司制造) 3U/毫升過氧化酶(東洋紡公司制造) 20U/毫升4-氨基安替比林(埼京化成公司制造) 0.51毫克/毫升氯化鈣(和光純藥工業公司制造) 0.1毫克/毫升表面活性劑(如表3記載的種類和濃度)除使用表3的表面活性劑外，和實施例4一樣實驗，求出ALDL、AHDL、AVLDL和ACM，算出AHDL/ALDL值、AVLDL/ALDL值和ACM/ALDL值。還有，本實驗中所用的各脂蛋白中膽固醇濃度根據Determiner L TC II(協和梅迪克斯公司制造)定量的結果是，HDL為85毫克/dL，LDL為252毫克/dL，VLDL為75毫克/dL，CM為19毫克/dL。
結果如表3所示。
表3

如表3所示，組合使用表面活性劑能夠特異性測定LDL膽固醇。
實施例7第1試劑(pH7.0)MOPS(Nakalai Tesque公司制造)10mMHDAOS(同仁化學公司制造) 0.3毫克/毫升第2試劑(pH7.0)
MOPS(Nakalai Tesque公司制造) 50mM膽固醇酯酶(脂蛋白脂肪酶，東洋紡織公司制造) 1U/毫升膽固醇氧化酶(協和發酵工業公司制造) 3U/毫升過氧化酶(東洋紡公司制造) 20U/毫升4-氨基安替比林(埼京化成公司制造) 0.51毫克/毫升氯化鈣(和光純藥工業公司制造) 0.1毫克/毫升表面活性劑(如表4記載的種類和濃度)除使用表4的表面活性劑外，和實施例4一樣實驗，求出ALDL、AHDL、AVLDL和ACM，算出AHDL/ALDL值、AVLDL/ALDL值和ACM/ALDL值。還有，本實驗中所用的各脂蛋白中膽固醇濃度根據Determiner L TC II(協和梅迪克斯公司制造)定量的結果是，HDL為79毫克/dL，LDL為273毫克/dL，VLDL為76毫克/dL，CM為16毫克/dL。
結果如表4所示。
表4

如表4所示，組合使用表面活性劑能夠特異性測定LDL膽固醇。
實施例8第1試劑(pH7.0)MOPS(Nakalai Tesque公司制造) 10mMHDAOS(同仁化學公司制造) 0.3毫克/毫升氯化鎂6水鹽(關東化學公司制造) 7毫克/dL右旋糖酐硫酸鈉(東京化成公司制造)0.7毫克/dL第2試劑(pH6.75)MOPS(Nakalai Tesque公司制造)50mM膽固醇酯酶(脂蛋白脂肪酶，東洋紡織公司制造) 1U/毫升膽固醇氧化酶(協和發酵工業公司制造) 3U/毫升過氧化酶(東洋紡織公司制造) 20U/毫升4-氨基安替比林(埼京化成公司制造) 0.51毫克/毫升氯化鈣(和光純藥工業公司制造)0.1毫克/毫升表面活性劑(如表5記載的種類和濃度)使用表5的表面活性劑，測定第2試劑添加隨后和添加5分鐘后的吸光度，此吸光度的差作為ALDL、AHDL、AVLDL和ACM以外，其它和實施例4一樣進行實驗，算出AHDL/ALDL值、AVLDL/ALDL值和ACM/ALDL值。還有，本實驗中所用的各脂蛋白中膽固醇濃度根據Determiner L TC II(協和梅迪克斯公司制造)定量的結果是，HDL為79毫克/dL，LDL為273毫克/dL，VLDL為76毫克/dL，CM為16毫克/dL。
結果如表5所示。
表5

如表5所示，組合使用表面活性劑能夠特異性測定LDL膽固醇。
實施例9第1試劑(pH7.0)MOPS(Nakalai Tesque公司制造) 10mMHDAOS(同仁化學公司制造) 0.3毫克/毫升氯化鎂6水鹽(關東化學公司制造)7毫克/dL右旋糖酐硫酸鈉(東京化成公司制造) 0.7毫克/dL第2試劑(pH7.0)MOPS(Nakalai Tesque公司制造) 50mM膽固醇酯酶(脂蛋白脂肪酶，東洋紡織公司制造)1U/毫升膽固醇氧化酶(協和發酵工業公司制造) 0.6U/毫升過氧化酶(東洋紡織公司制造) 20U/毫升4-氨基安替比林(埼京化成公司制造)0.51毫克/毫升氯化鈣(和光純藥工業公司制造) 0.1毫克/毫升表面活性劑(如表6記載的種類和濃度)除使用表6的表面活性劑外，和實施例8一樣實驗，求出ALDL、AHDL、AVLDL和ACM，算出AHDL/ALDL值、AVLDL/ALDL值和ACM/ALDL值。還有，本實驗中所用的各脂蛋白中膽固醇濃度根據Determiner L TC II(協和梅迪克斯公司制造)定量的結果是，HDL為82毫克/dL，LDL為70毫克/dL，VLDL為73毫克/dL，CM為14毫克/dL。
結果如表6所示。
表6

如表6所示，組合使用表面活性劑能夠特異性測定LDL膽固醇。
實施例10第1試劑(pH7.25)PIPES(Nakalai Tesque公司制造) 50mMHDAOS(同仁化學公司制造) 0.3毫克/毫升第2試劑(pH7.25)PIPES(Nakalai Tesque公司制造) 50mM膽固醇酯酶(脂蛋白脂肪酶，東洋紡織公司制造) 2U/毫升膽固醇氧化酶(協和發酵工業公司制造) 3U/毫升過氧化酶(東洋紡織公司制造)20U/毫升4-氨基安替比林(埼京化成公司制造) 0.51毫克/毫升氯化鈣(和光純藥工業公司制造) 0.1毫克/毫升Emulgen L-40(花王公司制造) 0.16％Pluronic L-121(旭電化公司制造) 0.2％作為樣品，使用患者血清樣品88份，按下述操作定量樣品中LDL膽固醇。將300微升第1試劑和4微升各樣品混合，在37℃下保溫5分鐘。測定此時的吸光度，接著加入100微升第2試劑進行反應，測定5分鐘后的吸光度。另一方面，對LDL膽固醇濃度已知的血清進行相同的操作，測定吸光度，定量樣品中的膽固醇。測定時使用日立7070自動分析裝置，主波長600nm，輔波長700nm。
另一方面，用市售的試劑盒Determiner L TC(協和梅迪克斯公司制造)測定總膽固醇，用デタミナHDL-C(協和梅迪克斯公司制造)測定HDL膽固醇，用Determiner L TC(協和梅迪克斯公司制造)測定中性脂肪，從下述的Friedewald公式求出LDL膽固醇濃度。計算本發明方法所得LDL膽固醇濃度和Friedewald公式求出的LDL膽固醇濃度的相關系數，為0.9767。
Friedewald計算式(LDL膽固醇濃度)＝(總膽固醇濃度)-(HDL膽固醇濃度)-(中性脂肪濃度)圖5表示本發明方法(圖5中以本法表示)所得的LDL膽固醇濃度和對照方法(圖5中以對照方法表示)所得的LDL膽固醇濃度的相關性。
工業實用性本發明提供了定量LDL膽固醇的方法和該方法所用的試劑盒。此外，本發明還提供了同一樣品中HDL膽固醇和LDL膽固醇或總膽固醇在同一系統內連續分別定量的方法和該方法所用的試劑盒。
權利要求
1.一種機體樣品中HDL膽固醇和總膽固醇的連續分別定量方法，其特征在于在a)機體樣品、b)CH酶類和c)使HDL以外的脂蛋白凝聚的試劑存在下，進行第1次反應，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶而定量HDL膽固醇的濃度；接著d)往全部脂蛋白的膽固醇中加入使CH酶類只作用于全部脂蛋白中膽固醇的試劑，進行第2次膽固醇反應，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶而定量總膽固醇。
2.根據權利要求1的方法，其中在完成第一次反應后進一步將CH酶類與試劑d)加入到反應混合物中。
3.根據權利要求1或2記載的定量方法，其中使HDL以外的脂蛋白凝聚的試劑還含有不溶解凝聚脂蛋白的非離子性表面活性劑。
4.根據權利要求1-3任一項的定量方法，其中使HDL以外的脂蛋白凝聚的試劑為二價金屬鹽或選自以下的至少一種肝素或其鹽、磷鎢酸或其鹽、硫酸右旋糖酐或其鹽、聚乙二醇、硫酸環糊精或其鹽和硫酸寡糖或其鹽。
5.根據權利要求2記載的定量方法，其中第1次膽固醇反應所用的CH酶類為經化學修飾的酶，第2次膽固醇反應所用的CH酶類為沒有經化學修飾的酶。
6.根據權利要求1-5任一項記載的定量方法，其中使CH酶類作用于全部脂蛋白中膽固醇的試劑是溶解全部脂蛋白的表面活性劑。
7.根據權利要求1-6任一項的方法，其中CH酶類是膽固醇脂酶和膽固醇氧化酶，通過在過氧化物酶存在的條件下使過氧化氫與色源反應以形成顏色并測定反應混合物的吸光度來確定過氧化氫的含量。
8.分別定量HDL膽固醇和總膽固醇的試劑盒，包括第1試劑和第2試劑，其中所述第1試劑含有使HDL脂蛋白以外的脂蛋白凝聚的試劑和CH酶類，第2試劑為含有使CH酶類作用于全部脂蛋白中膽固醇的試劑。
9.根據權利要求8記載的試劑盒，其中使CH酶類作用于全部脂蛋白中膽固醇的試劑是溶解所有脂蛋白的表面活性劑。
10.根據權利要求8或9的試劑盒，其中CH酶類是膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶，并且第一試劑還包括過氧化物酶和能夠在過氧化物酶存在的條件下通過與過氧化氫反應而產生顏色的色源。
11.用于連續分別定量HDL膽固醇和總膽固醇的試劑盒，包括第一試劑和第二試劑，其中所述第一試劑包括膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶、過氧化物酶、能夠在有過氧化物酶存在下通過與過氧化氫反應產生顏色的色源和用于使HDL以外的其它脂蛋白凝聚的試劑；所述第二試劑包含溶解所有脂蛋白的表面活性劑。
12.根據權利要求11的試劑盒，其中所述第二試劑還包括膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶。
13.根據權利要求12的試劑盒，其中用于第一試劑中的膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶是經化學修飾的膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶；用于第二試劑中的膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶是未經化學修飾的膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶。
14.根據權利要求11-13任一項的試劑盒，其中所述第一試劑還包括不溶解凝聚的脂蛋白的非離子表面活性劑。
15.根據權利要求8-14任一項記載的試劑盒，其中使HDL以外的脂蛋白凝聚的試劑為二價金屬鹽和選自以下的至少一種肝素或其鹽、磷鎢酸或其鹽、硫酸右旋糖酐或其鹽、聚乙二醇、硫酸環糊精或其鹽和硫酸寡糖或其鹽。
全文摘要
本發明提供了低密度脂蛋白中膽固醇的定量方法及其所用的定量試劑。此外，本發明還提供了高密度脂蛋白中膽固醇和低密度脂蛋白中膽固醇的連續分別定量方法及其所用的試劑盒以及高密度脂蛋白中膽固醇和總膽固醇的連續分別定量方法及其所用的定量試劑盒。
文檔編號C12Q1/60GK1544650SQ200410006750
公開日2004年11月10日 申請日期1999年7月30日 優先權日1998年9月18日
發明者杉內博幸 申請人:協和梅迪克斯株式會社