專利名稱：一種能自行裂解成具抗菌和修復功能多肽的融合蛋白的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種由抗菌肽、凝血酶蛋白切割序列以及成纖維細胞生長因子組成的融合蛋白的構建、達和應用。
背景技術：
抗生素的發現是醫學史上的一個里程碑，但是隨著抗生素的大量使用，也使得致病菌的抗藥性大大提高，更為嚴重的是，現在還出現了抗生素抗性的超級菌，幾乎所有的抗生素對它們都沒有作用。而抗菌肽則可以解決這些問題。
到目前為止，人類已發現并合成大量的抗菌肽，其中以昆蟲抗菌肽為代表。實驗表明，這些抗菌肽不僅對細菌、真菌有廣譜抗菌能力，而且對病毒、原蟲以及腫瘤細胞也有作用。此外，由于作用機制獨特，抗菌肽無致畸病作用，無蓄積毒性、難產生抗藥性以及對高等動物正常細胞無害等特點，抗菌肽可能成為抗生素的新來源。
昆蟲抗菌肽可分為抗細菌肽、抗真菌肽和既抗細菌又抗真菌的抗菌肽。
根據氨基酸組成和結構特征，已研究的抗細菌肽分為四類，即形成兩性分子α-螺旋的抗細菌肽類、有分子內二硫橋的抗細菌肽類、富含脯氨酸的抗細菌肽類以及富含甘氨酸的抗細菌多肽類。
1.形成兩性分子α-螺旋的抗細菌肽類，以天蠶素類(Cecropins)為代表。這類抗細菌肽分子內有兩性分子的α-螺旋結構，但不含半胱氨酸、不具二硫橋。目前，從昆蟲體內發現了20多種Cecropin及其類似物。最著名的1981年Boman等首先分離出Cecropin A和B，次年又分離出Cecropin D。Cecropin的抗菌譜包括革蘭氏陽性和陰性菌。
2.有分子內二硫橋的抗細菌肽類，與Cecropin相似，這類抗細菌肽分子內也形成兩性分子的α-螺旋結構，但在這種肽分子中含有半胱氨酸，并形成分子內二硫橋。以昆蟲防御素(insect defensins)為代表。目前，除了雙翅目昆蟲外，幾乎所有目中都發現了昆蟲防御素。昆蟲防御素主要對革蘭氏陽性菌起作用。
3.富含脯氨酸的抗細菌肽類，以apidaecins和abaecin為代表。這是80年代末才發現的一類新型昆蟲抗菌肽。有15個-34個氨基酸殘基組成，其中脯氨酸含量在25％以上。這類抗細菌肽分子只對革蘭氏陰性菌起作用。
4.富含甘氨酸的抗細菌多肽類，以attacins和sarcotoxins II為代表。有研究表明，attacins只對少數種類、處于生長中的革蘭氏陰性菌起作用。
昆蟲抗真菌肽主要分為AFP、holotricin3和drosomycin。AFP是從麻蠅中分離出的一種抗真菌肽，起在蒸餾水和鹽溶液中有較強的殺菌能力；holotricin3從鞘翅目昆蟲幼蟲中分離得到，富含甘氨酸和組氨酸；drosomycin由果蠅的幼蟲和成蟲經細菌誘導所得，具廣譜抗真菌活性。
既抗細菌又抗真菌的昆蟲抗菌肽，分為metchnikowin和thanatin，其中以死亡素(thanatin)為著名代表。死亡素是刺肩蝽成蟲經誘導產生的一種抗菌肽，該抗菌肽對革蘭氏陽性菌、陰性菌以及真菌都有很強的抗菌活性。
抗菌肽的結構與功能是密切相關的。許多來自于不同物種的抗菌肽，其一級結構有不少相似之處。如肽的N端半分子富含親水的氨基酸殘基，C端則含較多的疏水氨基酸殘基。目前新型雜合抗菌肽的設計主要集中在天蠶素(Crocepin)、蜂毒素(Melittin)和蛙皮素(Magainin)。有研究表明，Cecropin A及蛙皮素對革蘭氏陽性菌和陰性菌均有殺死作用，對正常的真核細胞(如人的正常細胞)則沒有殺傷作用。而蜂毒素是一種高效的殺菌蛋白，比前兩者都好，但它對真核細胞有害。于是，Song等按照這幾種抗菌肽的一級結構設計出一種雜合蛋白，既具有強殺菌效果，又對正常的真核細胞無害，還能殺死癌細胞。
目前，比較清楚的是昆蟲抗細菌肽的作用機制，包括細胞膜電勢依賴通道的形成，抑制細胞呼吸，抑制細胞外膜蛋白的合成以及抑制細胞壁的形成。現行的抗菌肽殺菌模型是通過以下3個步驟1.抗菌肽的多聚體與細胞膜相互吸引使抗菌肽結合到膜上；2.抗菌肽的疏水C端插入膜中，而形成兩親α-螺旋的N端留在膜界面上，3.兩親α-螺旋插入質膜，在質膜上形成較大的孔洞，從而使細菌死亡。
現時利用基因工程方法大量生產昆蟲抗菌肽比較困難，主要問題是1.抗菌肽提取純化技術。這是限制抗菌肽生產成本的主要因素；2.表達系統載體。動物源的抗菌肽在來源上十分有限，必須要通過基因工程的方法對抗菌肽進行表達。由于大部分抗菌肽對表達載體都有抗殺作用，一般選擇酵母菌或者使抗菌肽以融合蛋白的形式表達，但這樣又增加了后加工的難度；3.抗菌肽的穩定性和免疫反應問題。
成纖維細胞生長因子(Fibroblast growth factor，FGFs)，共有十幾種，其中主要包括酸性成纖維細胞生長因子(acidic Fibroblast Growth Factor，aFGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bovine FibroblastGrowth Factor，bFGF)兩種，是一類對來源于中胚層和神經外胚層的多種類型的細胞具有廣泛的生物學活性的細胞生長因子。其中，aFGF在臨床上具有廣泛的應用前景，可用于創傷修復、心腦血管疾病治療(如心肌缺血、腦中風等)、神經系統疾病(如帕金森氏癥、阿爾茨海默病等)治療等。
1.aFGF的主要生理功能(1)aFGF可以直接參與新生血管的形成。aFGF對血管內皮細胞有較強的趨化作用和促增殖作用，并刺激血管內皮細胞產生膠原酶和纖維蛋白溶解酶原激活物(t-PA)，進一步降解基底膜，同時誘導毛細血管內皮細胞形成管腔樣結構；(2)促進表皮細胞的增殖。體內體外實驗表明，在燒傷創面應用aFGF后，免疫組化染色及顯微鏡觀察顯示，aFGF組的表皮細胞和全厚層皮膚組織的DNA含量高于生理鹽水對照組，S期細胞數也明顯高于對照組，表明aFGF可促進表皮細胞的有絲分裂，，從而促進表皮細胞的增殖，加速創面的愈合；(3)aFGF對中胚層及神經外胚層細胞的分化有明顯的刺激作用。成神經細胞的分裂受aFGF的調節，分裂過程中出現軸突突起生長出生長錐、神經遞質合成、遞質小泡的轉運等神經元特征。
aFGF與肝素及肝素類硫酸蛋白多糖有很強的親和力，又名肝素結合生長因子1。它在沒有肝素及肝素類硫酸蛋白多糖存在的條件下，在生理溫度下是以非折疊的形式存在的，非常不穩定。實驗證明，肝素及肝素類硫酸蛋白多糖與HAFGF結合后，不但能穩定HAFGF的分子構型，阻止其降解，降低熱、酸、蛋白水解酶及氧化劑對其活性的影響，還能增強其生物學活性20-100倍，延長其生物作用。
2.aFGF基因的突變研究以及活性檢測aFGF的氨基酸序列中有三個半胱氨酸殘基(Cys)，分別位于第31、98、132位，其中第31、98位Cys在aFGF和bFGF中是一致的，而第132位Cys是aFGF獨有的。與許多含Cys的胞外蛋白一般都通過形成二硫鍵來穩定結構不同，aFGF的Cys殘基間不形成二硫鍵。用中性氨基酸如絲氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala)取代Cys，不僅對aFGF的分子結構及生物學活性的影響很小，還能增加aFGF對熱、酸及某些蛋白酶降解的穩定性。Harper JW等曾對AFGF的一些氨基酸殘基進行修飾，研究修飾后的AFGF活性的變化，發現第133位的賴氨酸(Lys)甲基化后，AFGF與肝素及細胞表面受體的親和力、促分裂活性均下降，表明Lys-133及其周圍的結構，參與AFGF與肝素及跨膜受體的相互作用。
本發明可以解決融合蛋白分離純化和獲得大量抗菌肽的方法。由于抗菌肽是一類小分子肽，分離純化極其困難，而成纖維細胞生長因子可以通過肝素凝膠柱層析純化回收，因此，本發明(融合蛋白)可以通過肝素凝膠柱層析純化回收，從而獲得融合蛋白的純品。本發明還有另一個優點是解決難于獲得大量抗菌肽的問題。因為抗菌肽對表達載體，如大腸桿菌等有殺傷作用，要大量獲得抗菌肽極其困難。而通過實驗證明，抗菌肽與成纖維細胞生長因子融合后，其殺菌活性大大減少甚至消失，因此通過融合蛋白獲得大量的抗菌肽是一個很好的辦法。此外，本發明不需酶切或者化學方法裂解融合蛋白。由于人和哺乳動物的血液中含有各種凝血酶因子，因此，本發明(融合蛋白)在使用時會被凝血酶切割，自動裂解成有功能的抗菌肽和成纖維細胞生長因子。
發明內容
利用PCR技術構建編碼含有抗菌肽、凝血酶切割序列和成纖維細胞生長因子的融合蛋白基因，克隆到畢赤酵母中間載體pPICZαA中，并轉化至畢赤酵母(Pichiapastoris)。從轉化子中篩選獲得高表達量重組子，通過高密度發酵和肝素凝膠層析獲得純的融合蛋白。該融合蛋白可以應用到治療哺乳動物的創傷、燒傷、燙傷的修復以及防止細菌和真菌感染。
具體實施例方式實施例一天蠶素(cecropin)及酸性成纖維細胞生長因子(acidic fibroblast growth factor)融合蛋白的表達設計并合成引物F1(SEQ ID NO22)、F2(SEQ ID NO23)、R1(SEQ ID NO24)和R2(SEQ IDNO25)。其中F1和R1兩條引物含有不同的DNA限制性內切酶酶切位點，分別為XhoI和XbaI。而F1的5‘端在限制性內切酶酶切位點之后有信號序列，用以引導融合蛋白在宿主細胞中的分泌并在翻譯后切除。引物F2的5’端和R1的3‘端含有凝血酶蛋白切割位點的核苷酸序列(SEQ ID NO26)。用兩對引物(F1R2和F2R1)分別以含天蠶素基因及酸性成纖維細胞因子(1-154a.a)基因的質粒為模板進行PCR反應，獲得的產物再作為模板，用引物F1和R1進行PCR反應。將最終的PCR產物克隆和測序。用XhoI和XbaI雙酶切并連接到同時用XhoI和XbaI消化產生的pPICZαA載體上。通過電穿孔法轉化到畢赤酵母細胞中，隨后在含有100μl/ml Zeocin抗性的YPD培養基中選擇。從而獲得穩定表達融合蛋白的克隆。通過aFGF抗體的Western雜交測定并用SDS-PAGE證實蛋白表達水平，其顯示約21KD蛋白產物。
實施例二天蠶素及酸性成纖維細胞生長因子缺失改構體(19-154a.a)融合蛋白的表達設計并合成引物F3(SEQ ID NO27)，其3‘端含有凝血酶蛋白切割位點的核苷酸序列。用兩對引物(F1R2和F3R1)分別以含天蠶素基因及酸性成纖維細胞因子(19-154a.a)基因的質粒為模板進行PCR反應，獲得的產物再作為模板，用引物F1和R1進行PCR反應。將最終的PCR產物克隆和測序。用XhoI和XbaI雙酶切并連接到同時用XhoI和XbaI消化產生的pPICZαA載體上。通過電穿孔法轉化到畢赤酵母細胞中，隨后在含有100μl/ml Zeocin抗性的YPD培養基中選擇。從而獲得穩定表達融合蛋白的克隆。通過aFGF抗體的Western雜交測定并用SDS-PAGE證實蛋白表達水平，其顯示約19KD蛋白產物。
實施例三天蠶素及酸性成纖維細胞生長因子缺失改構體(27-154a.a)融合蛋白的表達設計并合成引物F4(SEQ ID NO28)，其3‘端含有凝血酶蛋白切割位點的核苷酸序列。用兩對引物(F1R2和F4R1)分別以含天蠶素基因及酸性成纖維細胞因子(27-154a.a)基因的質粒為模板進行PCR反應，獲得的產物再作為模板，用引物F1和R1進行PCR反應。將最終的PCR產物克隆和測序。用XhoI和XbaI雙酶切并連接到同時用XhoI和XbaI消化產生的pPICZαA載體上。通過電穿孔法轉化到畢赤酵母細胞中，隨后在含有100μl/ml Zeocin抗性的YPD培養基中選擇。從而獲得穩定表達融合蛋白的克隆。通過aFGF抗體的Western雜交測定并用SDS-PAGE證實蛋白表達水平，其顯示約18KD蛋白產物。
實施例四天蠶素及酸性成纖維細胞生長因子突變體(aFGF-Ser-2-3)融合蛋白的表達用兩對引物(F1R2和F2R1)分別以含天蠶素基因及酸性成纖維細胞因子突變體(1-154a.a)基因的質粒為模板進行PCR反應，獲得的產物再作為模板，用引物F1和R1進行PCR反應。將最終的PCR產物克隆和測序。用XhoI和XbaI雙酶切并連接到同時用XhoI和XbaI消化產生的pPICZαA載體上。通過電穿孔法轉化到畢赤酵母細胞中，隨后在含有100μl/ml Zeocin抗性的YPD培養基中選擇。從而獲得穩定表達融合蛋白的克隆。通過aFGF抗體的Western雜交測定并用SDS-PAGE證實蛋白表達水平，其顯示約18KD蛋白產物。
實施例五天蠶素雜合肽(Cecropin AD)及酸性成纖維細胞生長因子(1-154a.a)融合蛋白的表達設計并合成引物R3(SEQ ID NO29)，其3‘端含有凝血酶蛋白切割位點的核苷酸序列。用兩對引物(F1R3和F2R1)分別以含天蠶素雜合肽基因及酸性成纖維細胞因子(1-154a.a)基因的質粒為模板進行PCR反應，獲得的產物再作為模板，用引物F1和R1進行PCR反應。將最終的PCR產物克隆和測序。用XhoI和XbaI雙酶切并連接到同時用XhoI和XbaI消化產生的pPICZαA載體上。通過電穿孔法轉化到畢赤酵母細胞中，隨后在含有100μl/ml Zeocin抗性的YPD培養基中選擇。從而獲得穩定表達融合蛋白的克隆。通過aFGF抗體的Western雜交測定并用SDS-PAGE證實蛋白表達水平，其顯示約21KD蛋白產物。
實施例六天蠶素雜合肽(Cecropin AD)及堿性成纖維細胞生長因子(base fibroblast growth factor)融合蛋白的表達設計并合成引物F5(SEQ ID NO29)和R4(SEQ ID NO30)，其中F5的5‘端含有凝血酶蛋白切割位點的核苷酸序列，而R4的5’端則含有XbaI酶切位點。用兩對引物(F1R3和F5R4)分別以含天蠶素雜合肽基因及堿性成纖維細胞因子基因的質粒為模板進行PCR反應，獲得的產物再作為模板，用引物F1和R4進行PCR反應。將最終的PCR產物克隆和測序。用XhoI和XbaI雙酶切并連接到同時用XhoI和XbaI消化產生的pPICZαA載體上。通過電穿孔法轉化到畢赤酵母細胞中，隨后在含有100μl/ml Zeocin抗性的YPD培養基中選擇。從而獲得穩定表達融合蛋白的克隆。通過aFGF抗體的Western雜交測定并用SDS-PAGE證實蛋白表達水平，其顯示約22KD蛋白產物。
實施例七非洲爪蟾蛙皮素(magainin)及堿性成纖維細胞生長因子融合蛋白的表達設計并合成引物F6(SEQ ID NO31)和R5(SEQ ID NO32)，其中F6的5‘端含有XhoI限制性內切酶酶切位點，而R5的5’端則含有凝血酶蛋白切割位點的核苷酸序列。用兩對引物(F6R5和F5R4)分別以含蛙皮素基因及堿性成纖維細胞因子基因的質粒為模板進行PCR反應，獲得的產物再作為模板，用引物F6和R4進行PCR反應。將最終的PCR產物克隆和測序。用XhoI和XbaI雙酶切并連接到同時用XhoI和XbaI消化產生的pPICZαA載體上。通過電穿孔法轉化到畢赤酵母細胞中，隨后在含有100μl/mlZeocin抗性的YPD培養基中選擇。從而獲得穩定表達融合蛋白的克隆。通過aFGF抗體的Western雜交測定并用SDS-PAGE證實蛋白表達水平，其顯示約22KD蛋白產物。
實施例八甘藍夜蛾防御素(defensin)及堿性成纖維細胞生長因子融合蛋白的表達設計并合成引物F7(SEQ ID NO33)和R6(SEQ ID NO34)，其中F7的5‘端含有XhoI限制性內切酶酶切位點，而R6的5’端則含有凝血酶蛋白切割位點的核苷酸序列。用兩對引物(F7R6和F5R4)分別以含蛙皮素基因及堿性成纖維細胞因子基因的質粒為模板進行PCR反應，獲得的產物再作為模板，用引物F7和R4進行PCR反應。將最終的PCR產物克隆和測序。用XhoI和XbaI雙酶切并連接到同時用XhoI和XbaI消化產生的pPICZαA載體上。通過電穿孔法轉化到畢赤酵母細胞中，隨后在含有100μl/mlZeocin抗性的YPD培養基中選擇。從而獲得穩定表達融合蛋白的克隆。通過aFGF抗體的Western雜交測定并用SDS-PAGE證實蛋白表達水平，其顯示約22KD蛋白產物。
實施例九刺肩蝽死亡素(thanatin)及堿性成纖維細胞生長因子融合蛋白的表達設計并合成引物F8(SEQ ID NO35)和R7(SEQ ID NO36)，其中F8的5‘端含有XhoI限制性內切酶酶切位點，而R7的5’端則含有凝血酶蛋白切割位點的核苷酸序列。用兩對引物(F8R7和F5R4)分別以含蛙皮素基因及堿性成纖維細胞因子基因的質粒為模板進行PCR反應，獲得的產物再作為模板，用引物F8和R4進行PCR反應。將最終的PCR產物克隆和測序。用XhoI和XbaI雙酶切并連接到同時用XhoI和XbaI消化產生的pPICZαA載體上。通過電穿孔法轉化到畢赤酵母細胞中，隨后在含有100μl/mlZeocin抗性的YPD培養基中選擇。從而獲得穩定表達融合蛋白的克隆。通過aFGF抗體的Western雜交測定并用SDS-PAGE證實蛋白表達水平，其顯示約22KD蛋白產物。
實施例十果蠅抗真菌肽(anti-fungal peptide)及堿性成纖維細胞生長因子融合蛋白的表達設計并合成引物F9(SEQ ID NO37)和R8(SEQ ID NO38)，其中F9的5‘端含有XhoI限制性內切酶酶切位點，而R8的5’端則含有凝血酶蛋白切割位點的核苷酸序列。用兩對引物(F9R8和F5R4)分別以含蛙皮素基因及堿性成纖維細胞因子基因的質粒為模板進行PCR反應，獲得的產物再作為模板，用引物F9和R4進行PCR反應。將最終的PCR產物克隆和測序。用XhoI和XbaI雙酶切并連接到同時用XhoI和XbaI消化產生的pPICZαA載體上。通過電穿孔法轉化到畢赤酵母細胞中，隨后在含有100μl/mlZeocin抗性的YPD培養基中選擇。從而獲得穩定表達融合蛋白的克隆。通過aFGF抗體的Western雜交測定并用SDS-PAGE證實蛋白表達水平，其顯示約22KD蛋白產物。
實施例十一融合蛋白的純化及細胞活性測定將發酵的上清首先過CM-Sepherose FF離子交換柱，用含0.01M-1M氯化鈉的磷酸鹽緩沖溶液進行梯度洗脫，收集洗脫蛋白質溶液。再過肝素親和層析柱，用含0.06M-3M氯化鈉的磷酸鹽(10Mm-50mM)緩沖溶液進行梯度洗脫，收集洗脫峰溶液，即得融合蛋白純品。將人3T3腫瘤細胞培養至對數生長階段，按每孔7000-8000個細胞的比例接入到96孔細胞培養板上，加入含10％小牛血清的1640培養基，37℃培養24小時。去培養基，換入含0.4％的1640培養基繼續培養24小時。去培養基，加入含不同濃度不同種類的缺失突變aFGF蛋白，同時以純化的野生型樣品作陽性對照，加入PBS溶液作為空白對照。培養24-48小時后每孔各加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，繼續培養4-6小時。去培養基，加入100μl二甲基亞砜(DMSO)溶液，室溫放置0.5小時，放入酶標儀中用A570測量。
實施例十二融合蛋白的抑菌實驗在平皿上鋪一層含1.5％瓊脂粉的LB培養基作為底基。待底基凝固后，配制含0.7％瓊脂粉的LB培養基，等溫度降至45度時加入正處于對數生長期的大腸桿菌K12D31，充分混勻，迅速倒到平皿中。待凝固后，用打孔器在固體培養基中打孔。然后在孔中加入適量的融合蛋白。37度過夜培養，以相同濃度的抗菌肽、人酸性成纖維細胞生長因子以及無菌水作為對照。結果發現，抗菌肽能抑制周邊細菌的生長，而融合蛋白、人酸性成纖維細胞生長因子以及無菌水都不能抑制細菌的生長，這說明該融合蛋白不能抑制細菌的生長，可以利用酵母甚至大腸桿菌作為表達載體來擴大生產。
實施例十三用凝血酶切割融合蛋白并將切割產物進行抑菌圈和促細胞分裂活性實驗在緩沖條件下(0.05MHepes，0.25M NaCl，5mM CaCl2，pH7.5)，加入20微克的融合蛋白，37度水浴。分別在0.5、1.0、6、12、24小時取樣，并進行SDS-PAGE電泳。余樣按照實施例十一和十二中方法進行促細胞分裂活性和抑菌圈實驗。SDS-PAGE電泳發現，融合蛋白在水浴0.5小時后開始分解，隨著時間的延長，分解得越明顯。抑菌圈實驗證明，分解后的抗菌肽有抑菌活性，但沒有野生型的高。而促細胞分裂活性則與野生型的人酸性成纖維細胞生長因子沒有顯著性差異。
實施例十四融合蛋白修復受傷哺乳動物皮膚以及抗菌實驗采用常規的方法使正常健康的白兔或者白鼠皮膚受損，如擦傷、創傷等，滴入一定量的綠膿桿菌、金葡萄菌或者大腸桿菌等，再滴加500～2000ng的融合蛋白，飼養1-10天，以加無菌水為對照，觀察實驗結果。結果發現，加入融合蛋白的皮膚在第二天開始結枷，沒有細菌感染的跡象，而對照組則有細菌感染的現象。加入融合蛋白后，動物受傷的皮膚在4-7天內痊愈，而對照組則需6-14天。
權利要求
1.表達一種融合蛋白，它包括(a)抗菌肽蛋白序列；(b)凝血酶蛋白切割位點；(c)成纖維細胞生長因子蛋白序列。
2.權利要求1中所述的融合蛋白，其中所述的抗菌肽蛋白序列、凝血酶蛋白切割位點和成纖維細胞生長因子蛋白序列從融合蛋白的N端到C端依次編碼。
3.權利要求1中所述的融合蛋白，其中所述的抗菌肽蛋白序列可以是抗細菌肽、抗真菌肽或者既抗細菌又抗真菌的抗菌肽以及它們的變異體。
4.權利要求1中所述的融合蛋白，其中所述的凝血酶蛋白切割位點指通過蛋白酶或者其它蛋白剪切劑優先剪切的氨基酸序列，有用的蛋白酶切割位點包含SEQ ID NO1和SEQ ID NO41所示的氨基酸序列。
5.權利要求1中所述的融合蛋白，其中所述的成纖維細胞生長因子可以是酸性成纖維細胞生長因子(包含SEQ ID NO2所示的氨基酸序列)或者是堿性成纖維細胞生長因子(包含SEQ ID NO3所示的氨基酸序列)以及它們的變異體(包含SEQ ID NO4～20所示的氨基酸序列)。
6.權利要求1中所述的融合蛋白經過不同的凝血酶蛋白切割可以裂解成兩種蛋白，而兩種蛋白的N端或者C端分別含有不同數量的組成凝血酶蛋白切割序列的氨基酸殘基。其中蛋白酶切割序列1(SEQ IDNO1)時，產生的抗菌肽蛋白的C端含有3個氨基酸(KLV)，而成纖維細胞生長因子蛋白的N端也含有3個氨基酸(PRS)；而蛋白酶切割序列II(SEQ IDNO41)時，產生的抗菌肽蛋白的C端含有4個氨基酸(Ile-Glu/Asp-Gly-Arg)，而成纖維細胞生長因子蛋白的N端則不含任何氨基酸。
7.權利要求3和權利要求5中所采用的術語“變異體”，不僅指全長蛋白，而且還分別指特定變異體和等位變異體，以及其它天然產生或者非天然產生的變異體。例如由常規的基因工程方法產生的的氨基酸突變體、個別氨基酸化學修飾突變體以及具有野生型蛋白生物活性片段等。它們與本文所公開的抗菌肽或者成纖維細胞生長因子天然產生的蛋白質序列至少有60％相似或50％相同，更優選的至少75％相似或者55％相同和最優選的80％相似或60％相同。
8.回收蛋白方法，可以通過肝素瓊脂糖凝膠柱或者分子篩回收整個融合蛋白；也可以人工加入凝血酶(哺乳動物或者人)切割融合蛋白，從而獲得具有抗菌活性的抗菌肽和皮膚修復功能的成纖維細胞生長因子，最后采用常規的純化方法分別回收兩種蛋白，例如采用肝素瓊脂糖凝膠柱或者分子篩等。
9.本發明(融合蛋白)的組合物通過任何合適的給藥方式給予哺乳動物或人，用以治療創傷、燒傷、燙傷等疾病，以及可以防止和治療細菌或者真菌感染。
10.權利要求11中所述的給藥方式為直接給予體表局部組織部位；所述的組合物是指包含部分水或生理上可匹配的液體懸浮液或溶液。
全文摘要
所公開的內容為一種抗菌肽、凝血酶蛋白切割序列以及成纖維細胞生長因子的融合蛋白序列。所述的抗菌肽可以是抗細菌肽、抗真菌肽、同時抗細菌和真菌肽以及基因工程雜合肽。而成纖維細胞生長因子可以是酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)或者堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)。可以將編碼上述融合蛋白的核苷酸序列插入到合適的表達載體中并在畢赤酵母(Pichia pastoris)中進行表達。哺乳動物體內的各種凝血酶能特異性識別該融合蛋白中的凝血酶切割序列并切割融合蛋白，使得該融合蛋白能裂解為具有抗菌功能得抗菌肽和修復功能的成纖維細胞生長因子。所公開的內容還有使用這種融合蛋白治療哺乳動物的創傷、燒傷、燙傷的修復以及防止細菌和真菌的感染。
文檔編號C12N15/62GK1504573SQ0314034
公開日2004年6月16日 申請日期2003年9月1日 優先權日2003年9月1日
發明者李校堃, 蘇志堅, 鄭青, 黃亞東, 吳曉萍, 許華, 何峰, 馮雅, 劉太勝, 李校 申請人:廣州暨南大學醫藥生物技術研究開發中心, 廣州暨南大學醫藥生物技術研究開發中