專利名稱：生理傳感器和基質定量方法
技術領域：
本發明涉及能迅速且簡便地定量試樣中的特定成分的生理傳感器、和基質的定量方法。
背景技術：
以往，作為不進行試樣液的稀釋或攪拌就能簡易地定量試樣液中的特定成分的方式，已經提出了各種生理傳感器方案。作為生理傳感器之一例，例如，如下的傳感器是已知的(參照特開2000-39416號公報)。
這種生理傳感器是在絕緣性基板上用絲網印刷等方法形成由測定極、對極和參照極組成的電極系，并在這個電極系上緊接著形成一個含有氧化酶和電子傳遞質的酶反應層的。
如果在這個生理傳感器的酶反應層上滴下含有基質的試樣液，酶反應層就會溶解而使酶和基質反應，從而使電子傳遞質還原。酶反應結束后，使還原的電子傳遞質發生電化學氧化，從此時得到的氧化電流值，就能求出試樣液中的基質濃度。
這種先有技術生理傳感器中，為了測定血液、血漿、或血清等試樣液中的膽固醇濃度，含有能使酯型膽固醇脫酯化的膽固醇酯酶和能使游離型膽固醇氧化的膽固醇氧化酶(即cholesterol oxidase)2種酶。
然而，血液、血漿、或血清等測定試樣，由于具有中性附近的pH緩沖能力，因而對于含有能使膽固醇氧化的酶和膽固醇酯酶的生理傳感器來說未必是較好的pH條件。
本發明鑒于這樣的問題點，查明了包含能使膽固醇氧化的酶和膽固醇酯酶的生理傳感器的最佳pH和較好緩沖劑，目的在于提供具有高應答性的高性能生理傳感器。
發明公開按照本發明的生理傳感器具備絕緣性的基板、在所述基板上形成的包含測定極和對極的電極系、組合于所述基板上并在與基板之間形成從試樣供給口把試樣液導入所述電極系中的試樣供給路的覆蓋部件、和設置于所述試樣供給路內的試劑層，所述試劑層包含能使膽固醇氧化的酶、膽固醇酯酶、電子傳遞質、和在酸性pH范圍內有緩沖能力的緩沖劑。
按照本發明的基質定量方法是使用具備絕緣性的基板、在所述基板上形成的包含測定極和對極的電極系、組合于所述基板上并在與基板之間形成從試樣供給口把試樣液導入所述電極系中的試樣供給路的覆蓋部件、和設置于所述試樣供給路內而含有能使膽固醇氧化的酶、膽固醇酯酶、和電子傳遞質的試劑層的生理傳感器的基質定量方法，包含使待測試樣與在酸性pH范圍內有緩沖能力的緩沖劑混合的前處理步驟、把用所述前處理步驟得到的溶液供給所述生理傳感器的步驟、和用所述生理傳感器進行所述待測試樣中的基質定量的步驟。
本發明，就另一個觀點而言，提供配備所述生理傳感器、以及在所述生理傳感器的測定極與對極之間施加電壓的電壓施加手段和檢測在施加了電壓的所述測定極與對極之間流過的電流的電流檢測手段的測定系統。
附圖簡要說明

圖1是用來證實本發明的生理傳感器中緩沖劑使用效果的生理傳感器斜視圖。
圖2是在相同生理傳感器中用馬來酸作為緩沖劑時的應答特性顯示圖。
圖3是在相同生理傳感器中用琥珀酸作為緩沖劑時的應答特性顯示圖。
圖4是在相同生理傳感器中使用各種緩沖劑時的應答特性顯示圖。
圖5是本發明的一個實施例中生理傳感器除去試劑層的分解斜視圖。
圖6是相同生理傳感器的縱剖視圖。
圖7是本發明的另一個實施例中生理傳感器的縱剖視圖。
圖8是本發明的又另一個實施例中生理傳感器的縱剖視圖。
圖9是本發明的又另一個實施例中生理傳感器除去試劑層的分解斜視圖。
圖10是相同生理傳感器的縱剖視圖。
圖11是本發明的實施例中測定系統的回路構成示意框圖。
發明最佳實施形態按照本發明的生理傳感器，其特征在于具備絕緣性的基板、在所述基板上形成的包含測定極和對極的電極系、在所述電極系上形成的親水性高分子層、組合于所述基板上并在與基板之間形成從試樣供給口把試樣液導入所述電極系中的試樣供給路的覆蓋部件、和設置于所述試樣供給路內的試劑層，所述試劑層包含能使膽固醇氧化的酶、膽固醇酯酶、電子傳遞質、和在酸性pH范圍內有緩沖能力的緩沖劑。
本發明的生理傳感器，由于試劑層含有在酸性pH范圍內有緩沖能力的緩沖劑，因而，即使在待測試樣液是在中性附近有緩沖能力的血液、血漿、或血清的情況下，使試劑層溶解于試樣中的反應系的pH也能在酸性范圍內調制。因此，既能提高酶的反應性，也能提高傳感器的應答性。而且，即使反應系的基質濃度是高濃度的，也能在一定時間內得到充分的應答值，因而測定時間可以縮短。進而，伴隨著傳感器應答性的提高，S/N比也提高了，即測定精度提高了。此外，如果試劑層含有緩沖劑，則溶液的展開和干燥所形成的試劑層就會平滑化。當試劑層是通過從其試劑的水溶液的干燥形成的時，試劑結晶的粗大化等會使試劑層變得有凹凸。尤其當含有電子傳遞質鐵氰化鉀時更為顯著。若試劑層含有緩沖劑，就沒有這樣的凹凸，也就能得到平滑的試劑層。其理由盡管不一定是喜歡拘泥于這里所述的理論，但可以認為是由于緩沖劑使通過其溶液的干燥而生成的結晶更細的緣故。
向傳感器供給試樣液而使試劑層溶解于試樣液中時，如果試劑層有凹凸，則在試樣液與試劑層的凹凸部之間有空氣存在，因而在溶解了試劑層的試樣液中會產生氣泡。如果在試樣液中有氣泡產生，就不能使試樣液順利地在試樣供給路中移動，從而給測定帶來障礙。通過使試劑層平滑化，如上所述的不如意就能消解、進而，由于使試劑層平滑化，因而可以減少試樣供給路內的體積或高度，從而實現試樣液的微量化。
在此，緩沖劑較好選自下列組成的一組琥珀酸，琥珀酸鹽，D-酒石酸，檸檬酸，檸檬酸鹽，酞酸，酞酸鹽，反式海葵素酸，甲酸，3，3-二甲基戊二酸，苯乙酸鈉，乙酸，乙酸鹽，二甲胂酸鈉，馬來酸，馬來酸鹽，磷酸，磷酸鹽，咪唑，2，4，6-三甲基吡啶，三乙醇胺，三(羥甲基)氨基甲烷(以下用Tris表示)，2-嗎啉代乙磺酸(以下用MES表示)，N-(2-乙酰胺基)亞氨基二乙酰乙酸(以下用ADA表示)，哌嗪-N，N′-二(2-乙磺酸)(以下用PIPES表示)，N-2-(乙酰胺基)-2-氨基乙醇磺酸(以下用ACES表示)，N，N-二(2-羥基乙基)-2-氨基乙磺酸(以下用BES表示)，3-嗎啉代丙磺酸(以下用MOPS表示)，N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(以下用TES表示)，N-2-羥基乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(以下用HEPES表示)，和氯乙酸。
這些當中，從溶解性充分高這樣的觀點來看，較好的是琥珀酸鉀、琥珀酸鈉等琥珀酸鹽，磷酸一氫二鉀、磷酸二氫一鉀、磷酸一氫二鈉，磷酸二氫一鈉等磷酸鹽，乙酸鉀、乙酸鈉等乙酸鹽，酞酸氫鉀、酞酸鈉，酞酸鉀等酞酸鹽，馬來酸氫鈉、馬來酸鉀、馬來酸鈉等馬來酸鹽。如果使用這些琥珀酸、琥珀酸鹽、磷酸、磷酸鹽、馬來酸、馬來酸鹽、酞酸、酞酸鹽，則應答值的提高特別顯著，可以得到應答線性優異的生理傳感器。就能得到良好生理傳感器保存特性這一點而言，更好的琥珀酸。
上述緩沖劑由于易溶于水中，因而添加試樣液時含有緩沖劑的層立即溶解于試樣液中，可以順利地進行酶反應和電極反應。
上述緩沖劑必要時也可以用鹽酸、乙酸等酸或NaOH、KOH等堿調制得在預定pH范圍內有緩沖能力，再添加到生理傳感器的試樣供給路內。
從應答線性的提高和在一定時間內得到足夠高的應答值這樣的觀點來看，較好的pH是4～6.5，更好的pH是4～5.5。
由于有時待測試樣也有緩沖作用，因而也可以向生理傳感器中添加2種以上的緩沖劑。作為緩沖劑的組合，較好的是琥珀酸與馬來酸的混合物，琥珀酸與磷酸的混合物，馬來酸與Tris的混合物等。
上述緩沖劑的添加量，對于以作為試樣液的血液0.04～20μl為測定對象的一次性類型的傳感器來說，從緩沖劑含有層的有效平滑化和降低空白值這樣的觀點來看，較好在每一個傳感器5～1000nmol的范圍內。這里所謂空白值系指對基質濃度為0的待測試樣例如水的應答值。進而，從提高含有緩沖劑的試劑層的溶解性和降低空白值這樣的觀點來看，更好的是每一個傳感器20～500nmol。為了提高測定速度，使從向傳感器供給試樣到得到應答值的測定所需時間短于4分鐘左右的較好酶量是每一個傳感器膽固醇酯酶0.1～10U、膽固醇氧化酶0.03～3U。
在本發明的較好實施方案中，所述膽固醇氧化酶和所述膽固醇酯酶是與所述電子傳遞質彼此分開擔持的。按照這種實施方案，可以得到空白值低的生理傳感器。進而，能防止保存引起的應答值增加，因而可以得到保存特性優異的生理傳感器。
在本發明的另一個較好實施方案中，所述緩沖劑是與所述膽固醇氧化酶或膽固醇酯酶混合擔持的。按照這種實施方案，能使膽固醇氧化酶或膽固醇酯酶含有層平滑化，因而向傳感器供給待測試樣時可以防止氣泡混入。
在本發明的又一個較好實施方案中，所述緩沖劑是與所述電子傳遞質混合擔持的。按照這種實施方案，能使電子傳遞質含有層平滑化，因而可以防止待測試樣供給時氣泡混入。
在本發明的較好實施方案中，所述緩沖劑是與所述膽固醇氧化酶、所述膽固醇酯酶和所述電子傳遞質分開擔持的，而且在所述試樣供給路內，也擔持在比所述膽固醇氧化酶、所述膽固醇酯酶和所述電子傳遞質更靠近所述試樣供給口的位置。按照這種實施方案，供給生理傳感器中的待測試樣首先使緩沖劑溶解，從而有使待測試樣的pH迅速調到酸性側這樣的效果。
在本發明的另一個較好實施方案中，在所述試樣供給路內還有過濾器。用血液作為試樣時，這種過濾器可以過濾血球成分，從而防止血球成分對電極產生的影響。所述過濾器在試樣供給路內如果處在靠近試樣供給口的位置，則能有效地除去試樣中的血球成分，因而更好。
所述過濾器若設定于試樣供給路內靠近試樣供給口的位置，則當用血液作為試樣時，可以更有效地防止酶或電子傳遞質等試劑或電極與血球成分接觸。
作為過濾器，可以使用玻璃過濾器、濾紙、纖維素纖維等。
作為本發明的生理傳感器要測定的對象，可以列舉體液。作為體液，可以列舉血液、血漿、血清、淋巴液、細胞間質液、汗中任何一種。具體地說，血液、血漿、和血清中所含膽固醇的一部分是作為結合了脂肪酸的膽固醇酯存在的。本發明的生理傳感器含有膽固醇酯酶，借助于其酶作用，使膽固醇酯轉化成游離的膽固醇，而膽固醇氧化酶等又會使其氧化。
本發明，就另一種觀點而言，提供一種配備所述生理傳感器、以及在所述生理傳感器的測定極與對極之間施加電壓的電壓施加手段和檢測施壓了電壓的所述測定極與對極之間流過的電流的電流檢測手段的測定系統。
本發明的較好測定系統進一步具有能顯示所述電流檢測手段檢測的電流或將所述電流轉換成諸如膽固醇值的顯示部。
本發明進一步提供一種基質定量方法，即一種用具備絕緣性的基板、在所述基板上形成的包含測定極和對極的電極系、在所述電極系上形成的親水性高分子層、組合于所述基板上并在與基板之間形成從試樣供給口把試樣液導入所述電極系中的試樣供給路的覆蓋部件、和設置于所述試樣供給路內的試劑層、所述試劑層包含能使膽固醇氧化的酶、膽固醇酯酶、和電子傳遞質的生理傳感器的基質定量方法，包含使在酸性pH范圍內有緩沖能力的緩沖劑與待測試樣混合的前處理步驟、將所述前處理步驟得到的溶液供給所述生理傳感器的步驟，和用所述生理傳感器進行所述待測試樣中的基質定量的步驟。
如果采用這種方法，用前處理步驟就能將待測試樣的pH迅速調整到酸性范圍，因而提高了酶的反應性，從而提高傳感器的應答性。
本發明提供一種酶試劑，包含在酸性pH范圍內有緩沖能力的緩沖劑和酶，所述酶是至少能使膽固醇氧化的酶和膽固醇酯酶。只要將這種酶試劑添加到生理傳感器中，就能得到應答性提高了的生理傳感器。
本發明中，作為能使膽固醇氧化的醇，可以列舉膽固醇氧化酶和膽固醇脫氫酶。
作為電子傳遞質，可以使用鐵氰化鉀、對苯醌及其衍生物、吩嗪硫酸二甲酯、亞甲基藍、二茂鐵及其衍生物等。這些當中較好的是在空氣能進行穩定的氧化還原的鐵氰化鉀。
親水性高分子可以防止含有能使膽固醇氧化的酶、膽固醇酯酶、電子傳遞質、緩沖劑等試劑的試劑層從電極系表面或基板表面上剝離。進而，親水性高分子還具有能防止所述試劑層表面開裂的效果，從而有效提高了生理傳感器的可靠性。作為這樣的親水性高分子，可以列舉羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、乙基羥乙基纖維素、羧甲基乙基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚賴氨酸等聚氨基酸、聚苯乙烯磺酸、明膠及其衍生物、丙烯酸及其鹽的聚合物、甲基丙烯酸及其鹽的聚合物、淀粉及其衍生物、無水馬來酸或其鹽的聚合物、瓊脂糖凝膠及其衍生物。尤其，從能達到充分的粘度的觀點來看，較好的是羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、和聚乙烯基吡咯烷酮。
本發明也意圖提供能以微量試樣量得到高精度測定值的生理傳感器。為了這樣的目的，采用了如下所述結構的傳感器。具體地說，較好的是從試樣供給口到空氣孔的試樣供給路的尺寸為寬0.4～4mm、高0.05～0.5mm、長2～10mm。更好的傳感器是試樣供給路的尺寸為寬0.5～2mm、高0.05～0.2mm、長3～5mm，試樣量為0.075～2μl。
以下用實施例說明本發明，但本發明并非只限定于這些。
實施例1圖1顯示用來證實在本發明的生理傳感器中使用能給出酸性溶液的緩沖劑的效果的生理傳感器的斜視圖。在由聚對苯二甲酸乙二醇酯組成的電絕緣性基板1上，用絲網印刷法印刷銀糊狀物，形成引線2和3。隨后在基板1上印刷含有樹脂粘結劑的導電性碳糊狀物，形成測定極4。這個測定極4與引線2接觸。進而，在這個基板上印刷絕緣性糊狀物，形成絕緣層6。絕緣層6覆蓋測定極4的外周部，借此使測定極4的露出部分的面積保持恒定。然后，在基板1上印刷含有樹脂粘結劑的導電性碳糊狀物，使之與引線3接觸，形成環狀的對極5。測定極4和對極5形成了電極系。
為了確定使用了能使膽固醇氧化的酶和膽固醇酯酶的生理傳感器的最佳pH和較好緩沖劑，用所述傳感器進行了以下實驗。
首先配制含有膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶、和一種緩沖劑的水溶液。然后，配制含有鐵氰化鉀、和Triton X-100的水溶液。用人血清作為測定試樣。緩沖劑是從琥珀酸、馬來酸、磷酸、和Tris中選擇一種。為了得到對應于膽固醇濃度0mg/ml的應答值，用水代替人血清。
上述3種溶液在試管內攪拌、混合。所得到的混合溶液中各種試劑和測定對象膽固醇的濃度如下膽固醇酯酶200單位(U)/ml膽固醇氧化酶1000U/ml
緩沖劑100mM鐵氰化鉀300mMTriton X-1002％(重量)膽固醇0～116mg/dl在上述混合溶液中，血清中所含酯型膽固醇借助于膽固醇酯酶進行脫酯化。這種脫酯化的膽固醇和從一開始血清中就含有的膽固醇，借助于膽固醇氧化酶進行氧化。同時，溶液中的鐵氰化鉀被還原成亞鐵氰化鉀。
其次，向圖1中所示電極系上滴加10μl(微升)上述混合液。從3種溶液混合起20秒后，以對極為基準在測定極上施加500mV電壓。此時，溶液中所含的亞鐵氰酸根離子被氧化，在測定極與對極之間有電流流過。施加電壓5秒后測定在測定極與對極之間流過的電流值。最后，由于血清有緩沖能力，因而實測了混合溶液的pH。
用馬來酸作為緩沖劑之一例，測定以各種總膽固醇濃度配制的混合溶液的應答電流值。以混合溶液的總膽固醇濃度為橫座標、以應答電流值為縱座標作圖，制作了傳感器的應答特性圖。將其顯示在圖2中。其結果，在溶液的pH處于酸性范圍內的情況下，得到了應答值越高、應答越好的直線性。而且，在pH處于酸性范圍內的情況下，可以在一定時間內得到應答的直線性，因而，通過酸性緩沖劑的添加，可以實現測定時間的縮短。
然后，把用琥珀酸作為緩沖劑時傳感器的應答特性圖表示在圖3中。其結果，在pH 4或5的任何一種情況下應答值都高，都能得到應答更好的直線性。而且，應答直線的斜率提高引起的S/N比提高即測定精度提高，也是所希望的。
琥珀酸、馬來酸、磷酸、和Tris分別用于緩沖劑時的結果顯示在圖4中。從此圖清楚地看出傳感器的pH依賴性。在混合液的pH調整到酸性范圍內的情況下，可以看出能得到更高的應答值。另一方面，在混合液的pH高于8的情況下，可以看出空白應答(對應于膽固醇為0mg/dl的電流應答值)較高，是不適合的。最佳pH是4～6.5、更好的是4～5.5。
本實驗中使用的酶的較好pH是膽固醇酯酶在pH 6.5以下、膽固醇氧化酶在pH 7附近。因此，這些結果表明，把試樣液的pH調節到更靠近膽固醇酯酶的較好pH的pH，就能得到更高的應答值。
實施例2用圖5和圖6說明本實施例。圖5是本實施例中的生理傳感器除去了試劑層的分解斜視圖，圖6是其縱剖視圖。基板1有與圖1同樣的電極系。組合于此基板上的覆蓋部件由有狹縫8的隔板7和有空氣孔10的蓋板9組成。在如后所述那樣形成各試劑層后，具有如圖5的點劃線所示那樣的位置關系、通過在基板1上連接隔板7和蓋板9，便裝配成生理傳感器。這種生理傳感器在隔板7的狹縫8部分形成了試樣供給路。在傳感器端部的狹縫8的開放端部8a成為進入試樣供給路的試樣供給口。這里使用的基板1的尺寸是寬6mm、長30mm。從試樣供給口到空氣孔的試樣供給路的內容積尺寸是寬2.0mm、高0.1mm、長5.0mm。
在形成了電極系的基板上，滴加親水性高分子之一的羧甲基纖維素(以下用CMC表示)的0.5％(重量)水溶液4μl，在50℃干燥15分鐘，形成了CMC層11。然后，在這個CMC層11上形成包含緩沖劑之一的琥珀酸和電子傳遞質之一的鐵氰化鉀的電子傳遞質·緩沖劑層12。電子傳遞質·pH緩沖劑層12的制作方法如下。首先，向調整到pH 5的琥珀酸濃度20mM的緩沖液中添加、溶解鐵氰化鉀，使其達到75mM。然后，這種含鐵氰化鉀的琥珀酸緩沖液4μl滴加到CMC層11上之后，在50℃干燥15分鐘。
另一方面，在裝配了隔板7和蓋板9的蓋板部件中，在成為試樣供給路的狹縫8中面對蓋板9的一側上滴加含有膽固醇酯酶900U/ml、膽固醇氧化酶400U/ml、以及作為表面活性劑的Triton X-100 1.6％(重量)和膽酸鈉30mM的水溶液0.5μl，冷凍干燥，形成了酶·表面活性劑層13。把形成了酶·表面活性劑層13的蓋板部件，和形成了CMC層11與電子傳遞質·緩沖劑層12的基板1裝配在一起，就完成了生理傳感器。
若將待測試樣導入傳感器內，就會使電子傳遞質·pH緩沖劑層12中所含的琥珀酸溶解，并將傳感器內溶液的pH調整到酸性范圍。因此，酶的活性提高了，達到了提高傳感器應答性的效果。而且，由于能在一定時間內得到充分的應答，因而能達到縮短測定時間這樣的效果。又，由于電子傳遞質·pH緩沖劑層12中所含的琥珀酸使層12本身變得平滑，因而能達到防止氣泡混入到電極系上這樣的效果。進而，由于酶和電子傳遞質是彼此分開擔持的，因而能得到空白值低的生理傳感器。由于酶和電子傳遞質是彼此分開擔持的，因而能得到保存特性優異的生理傳感器。即，保存后的生理傳感器也顯示出與剛制作后的生理傳感器同等的應答值，而且空白值增加及其它因素引起的保存后的應答值不當增加受到了抑制。
生理傳感器內的酶或鐵氰化鉀，只要無損于本發明的效果，就可以配置在各種位置上。例如，鐵氰化鉀也可以配置在試樣供給路內的CMC層上以外的場所。
本實施例中，使用Triton X-100和膽酸鈉作為表面活性劑，但也可以使用其它辛基硫葡糖苷、Lubrol、膽酸、脫氧膽酸鈉、毛地黃皂苷、十二烷基麥芽糖苷、蔗糖-月桂酸酯、牛磺脫氧膽酸鈉、聚氧亞乙基-對叔辛基苯基醚等表面活性劑。
作為使伴隨酶反應而還原的電子傳遞質氧化的電流的測定方法，可以有兩種方式，即僅測定極與對極的二極方式，和再加一個參照極的三極方式。
實施例3本實施例的生理傳感器顯示于圖7中。首先，在基板1上，同實施例2一樣進行，形成了CMC層11。其次，向調整到pH 5的馬來酸緩沖液中添加膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶、鐵氰化鉀、Triton X-100、和膽酸鈉，制成一種水溶液。此水溶液中各試劑的濃度是馬來酸，200mM；膽固醇酯酶，900U/ml；膽固醇氧化酶，400U/ml；鐵氰化鉀，600mM；Triton X-100，1.6％(重量)；膽酸鈉，30mM。這種水溶液0.5μl滴加到CMC層11上、冷凍干燥，形成了酶·表面活性劑·電子傳遞質·緩沖劑層14。
本實施例中，CMC以外的全部試劑是一次滴加、干燥的，因而有制作方法最容易這樣的優點。而且，若將待測樣品導入傳感器內，則酶·表面活性劑·電子傳遞質·緩沖劑層14中所含的馬來酸就會溶解，并將傳感器內溶液的pH調整到酸性范圍。因此，酶的活性提高了，從而達到了提高傳感器應答性的效果。
實施例4本實施例的生理傳感器顯示在圖8中。在形成了電極系的基板1上，同實施例2一樣進行，形成了CMC層11。然后在CMC層11上，滴加含有Triton X-100 0.16％(重量)、膽酸鈉3mM、和鐵氰化鉀75mM的水溶液5μl后，在50℃干燥15分鐘，形成了表面活性劑·電子傳遞質層15。
另一方面，在試樣供給路內的蓋板9一側，滴加含有膽固醇酯酶900U/ml、膽固醇氧化酶400U/ml、和緩沖劑之一的磷酸20mM的水溶液0.5μl后冷凍干燥，形成了酶·緩沖劑層16。
如果把待測試樣導入傳感器內，則酶·緩沖劑層16中所含的磷酸就會溶解，并使傳感器內溶液的pH調整到酸性范圍。因此，酶的活性提高了，從而達到了提高傳感器的應答性的效果。而且，酶·緩沖劑層16中所含的磷酸使層16本身變得平滑，因而達到了防止氣泡混入到電極系上這樣的效果。進而，酶和電子傳遞質是彼此分開擔持的，因而空白值低、能防止保存引起的應答值增加，從而得到了保持特性優異的生理傳感器。
實施例5用圖9和圖10說明本實施例。圖9是本實施例中生理傳感器除去試劑層的分解斜視圖，圖10是該生理傳感器的縱剖視圖。
基板21同實施例1一樣進行，使之具有與引線22連接的測定極24、與引線23連接的對極25和絕緣層26。在基板21上，同實施例2一樣進行，以能覆蓋電極系的方式形成CMC層32。然后，在CMC層32上滴加鐵氰化鉀75mM水溶液5μl后，在50℃干燥15分鐘，形成了電子傳遞質層33。
另一方面，在裝配了隔板27和蓋板29的覆蓋部件一側，在試樣供給路內的蓋板29上滴加含有膽固醇酯酶900U/ml、膽固醇氧化酶400U/ml、以及作為表面活性劑的Triton X-100，1.6％(重量)和膽酸鈉30mM的水溶液0.5μl之后冷凍干燥，形成了酶·表面活性劑層34。進而，在試樣供給路內，在酶·表面活性劑層34的上游設置用于過濾待測試樣中所含固體成分的過濾器31。
過濾器31在諸如待測試樣為血液的情況下起到將血球過濾和防止血球成分對電極產生的影響的作用。如圖10中所示，在試樣供給路中，如果過濾器31在靠近試樣供給口的位置，則能更有效地除去試樣中的血球成分，因而較好。過濾器31若設定于試樣供給路內靠近試樣供給口的位置，則用血液作為試樣時，能更有效地防止血球成分對電子傳遞質層33、酶·表面活性劑層34或電極的接觸。作為過濾器，可以使用玻璃過濾器、濾紙、纖維素纖維等三維連接的多孔體。這種多孔體借助于毛細管作用使血液向電極系一側移動，由于血漿與血球的流動阻力差異而具有過濾血球的作用。
按照點劃線所示位置關系連接基板21、隔板27、和蓋板29時，過濾器31連接在基板21表面與31′的部分。基板21上的傳感器端部21a成分通向試樣供給路的試樣供給口。在此供給的試樣吸收于過濾器31中，借助于毛細管作用向電極系移動。緩沖劑琥珀酸包含在位于酶·表面活性劑層34和電子傳遞質層33的上一側的過濾器31內。作為琥珀酸的含有方法，采用的是把過濾器31配置在預定位置之后，向過濾器31中滴加琥珀酸水溶液、再冷凍干燥的方法。
本實施例中，由于在試樣供給路內琥珀酸位于酶和鐵氰化鉀的上游，因而待測試樣首先使琥珀酸溶解，從而將待測試樣的pH迅速調整到酸性范圍。因此，生理傳感器內酶的活性提高了，從而達到了提高傳感器應答性的效果。
實施例6圖11是顯示本發明的一個實施例中測定系統的回路構成的框圖。測定裝置40有通過生理傳感器41的測定極引線42和對極引線43在兩電極間施加受控電壓的電壓施加裝置44，和測定在傳感器的測定極與對極間流過的電流的電流測定器45。測定的電流值在顯示部46上顯示。顯示部46也能把測定的電流值換算成諸如膽固醇再顯示。
產業上利用的可能性按照如上所述的本發明，添加緩沖劑使生理傳感器內反應系的pH調整到酸性范圍，可以提高生理傳感器的應答值，并得到更加良好的應答直線性。而且，可以在一定時間內得到足夠高的應答值，因而能實現測定時間的縮短。進而，緩沖劑能使含有緩沖劑的試劑層變得平滑，因而供給待測試樣時可以防止氣泡混入。
權利要求
1.一種生理傳感器，其特征在于具備絕緣性的基板、在所述基板上形成的包含測定極和對極的電極系、組合于所述基板上并在與基板之間形成從試樣供給口把試樣液導入所述電極系中的試樣供給路的覆蓋部件、和設置于所述試樣供給路內的試劑層，所述試劑層包含能使膽固醇氧化的酶、膽固醇酯酶、電子傳遞質、和在酸性pH范圍內有緩沖能力的緩沖劑。
2.權利要求1記載的生理傳感器，其中，所述緩沖劑選自下列組成的一組琥珀酸、琥珀酸鹽、檸檬酸、檸檬酸鹽、酞酸、酞酸鹽、馬來酸、馬來酸鹽、磷酸、和磷酸鹽。
3.權利要求2記載的生理傳感器，其中，所述緩沖劑在pH4～6.5的范圍內有緩沖能力。
4.權利要求3記載的生理傳感器，其中，所述緩沖劑的量是每一個傳感器5～1000nmol。
5.權利要求4記載的生理傳感器，其中，所述緩沖劑的量是每一個傳感器20～500nmol。
6.權利要求1記載的生理傳感器，其中，所述能使膽固醇氧化的酶和膽固醇酯酶是與所述電子傳遞質彼此分開擔持于所述試樣供給路內的。
7.權利要求1記載的生理傳感器，其中，所述緩沖劑是與所述能使膽固醇氧化的酶或膽固醇酯酶混合擔持的。
8.權利要求1記載的生理傳感器，其中，所述緩沖劑是與所述電子傳遞質混合擔持的。
9.權利要求1記載的生理傳感器，其中，所述緩沖劑是與所述能使膽固醇氧化的酶、所述膽固醇酯酶和所述電子傳遞質分開擔持的，而且在所述試樣供給路內擔持于比所述能使膽固醇氧化的酶、所述膽固醇酯酶和所述電子傳遞質更靠近試樣供給口的位置。
10.權利要求1記載的生理傳感器，在所述試樣供給路內還有過濾器。
11.權利要求10記載的生理傳感器，其中，所述過濾器就在靠近試樣供給口的位置。
12.權利要求10記載的生理傳感器，其中，所述過濾器擔持了所述緩沖劑。
13.權利要求1記載的生理傳感器，其中，所述能使膽固醇氧化的酶是膽固醇氧化酶。
14.權利要求1記載的生理傳感器，其中，測定對象是體液。
15.權利要求14記載的生理傳感器，其中，所述體液是血液、血漿、淋巴液、或細胞間質液。
16.一種測定系統，其中配備一個具備絕緣性的基板、在所述基板上形成的包含測定極和對極的電極系、組合于所述基板上并在與基板之間形成從試樣供給口把試樣液導入所述電極系中的試樣供給路的覆蓋部件、和設置于所述試樣供給路內的試劑層，所述試劑層包含能使膽固醇氧化的酶、膽固醇酯酶、電子傳遞質、和在酸性pH范圍內有緩沖能力的緩沖劑的生理傳感器，以及在所述測定極與對極之間施加電壓的電壓施加手段和檢測在施加了電壓的所述測定極與對極之間流過的電流的電流檢測手段。
17.權利要求16記載的測定系統，還有一個顯示部，以顯示所述電流檢測手段檢測的電流或使所述電流變換的值。
18.一種基質定量方法，即一種使用一個具備絕緣性的基板、在所述基板上形成的包含測定極和對極的電極系、組合于所述基板上并在與基板之間形成從試樣供給口把試樣液導入所述電極系中的試樣供給路的覆蓋部件、和設置于所述試樣供給路內的試劑層，所述試劑層包含能使膽固醇氧化的酶、膽固醇酯酶、電子傳遞質、和在酸性pH范圍內有緩沖能力的緩沖劑的生理傳感器的基質定量方法，包含使在酸性pH范圍內有緩沖能力的緩沖劑與待測試樣混合的前處理步驟、將所述前處理步驟得到的溶液供給所述生理傳感器的步驟，和用所述生理傳感器進行所述待測試樣中的基質定量的步驟。
19.一種酶試劑，包含在酸性pH范圍內有緩沖能力的緩沖劑和酶，且所述酶至少是能使膽固醇氧化的酶和膽固醇酯酶。
20.權利要求19記載的酶試劑，其中，所述緩沖劑選自下列組成的一組琥珀酸、琥珀酸鹽、檸檬酸、檸檬酸鹽、酞酸、酞酸鹽、馬來酸、馬來酸鹽、磷酸、和磷酸鹽。
全文摘要
本發明提供一種具有高應答性、包含膽固醇氧化酶和膽固醇酯酶的生理傳感器。這種生理傳感器具備絕緣性基板、在所述基板上形成的包含測定極和對極的電極系、組合于所述基板上并在與基板之間形成從試樣供給口把試樣液導入所述電極系中的試樣供給路的覆蓋部件、和設置于所述試樣供給路內的試劑層,所述試劑層包含膽固醇氧化酶、膽固醇酯酶、電子傳遞質、和在酸性pH范圍內有緩沖能力的緩沖劑。
文檔編號C12Q1/26GK1374518SQ02106768
公開日2002年10月16日 申請日期2002年3月7日 優先權日2001年3月7日
發明者渡邊基一, 長谷川美和, 山本智浩, 吉岡俊彥, 南海史朗 申請人:松下電器產業株式會社