專利名稱：復合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及通過將外源基因轉移到真核細胞中的轉導方法，以及一系列與之相關的技術，而這些技術在醫學、藥理學、農業研究、林學和漁業以及營養學領域是有用的。
背景技術：
利用病毒載體、通過胞飲作用、電穿孔或基因槍等方法轉移裸露DNA的方法是將基因轉移到真核細胞中的方法。病毒載體可應用于包括基礎研究和臨床研究在內的廣泛的基因治療領域。例如，腺病毒載體適于靶細胞中大量目的基因的瞬時表達。由于其能穩定整合到宿主染色體中，逆轉錄病毒載體允許長期的穩定表達。因此，逆轉錄病毒在遺傳疾病的基因治療領域和轉基因動物生產領域很有開發潛力。
然而，按照應用了病毒載體的基因轉移方法，基因轉移是通過病毒感染來介導的，這樣，病毒的趨性就引起了一個問題。特別地，我們無法將一個基因轉移到一個在其表面不能表達病毒受體的細胞中。為了克服這個缺陷，我們開發了假型逆轉錄病毒載體。此假型逆轉錄病毒載體利用水泡性口炎病毒VSV-G的被膜糖蛋白，可感染大量宿主。此載體不僅可用于將一基因轉移到哺乳動物中，而且也可用于將基因轉移到魚、鳥、昆蟲、兩棲動物等中。已經進行了利用此載體來生產轉基因動物的嘗試。然而，由于逆轉錄病毒的性質決定了該載體只能將一個拷貝轉移到靶細胞中，另外從開始感染到整合到染色體上這一過程需要至少7個小時，這就使得此載體具有一些問題。
當利用裸露的DNA進行基因轉移時，利用大腸桿菌等就可很容易的制備該DNA，并且可對基因進行轉移，例如利用磷酸鈣轉染或陽離子脂質體轉染、電穿孔、基因槍或微注射技術介導來進行基因轉移。在這種情況下，一些DNA通過重組整合到了染色體中，但整合效率很低。因此，在絕大多數情況下，這些技術僅僅用于需要進行瞬時基因表達的情況中，不適于長期的穩定表達。然而，目前，通過微注射或類似方式對裸露DNA進行轉移的技術專門用于轉基因生物的生產。如上所述，鑒于基因與染色體的整合僅僅通過意外重組來完成，轉基因生物的生產效率相當低。因此，在目前條件下，轉基因生物的生產成本很高，并且耗時很大。
發明目的本發明的主要目的是提供通過基因轉移來轉導多種細胞的方法，此方法是在不顧及宿主范圍的情況下，利用逆轉錄病毒載體與染色體進行穩定整合的功能特性和用于基因轉移的組合物、以及該方法中選用的用于轉導的組合物來進行的。因此，有可能發明一種技術，利用其來生產多種轉基因生物并開發基因治療領域中的新穎載體。
發明概述作為深入研究的結果，本發明的發明者制備了一個重組的整合前復合物(rPIC)，將其轉移到靶細胞中，令人驚訝的發現，不管原始病毒的趨性如何，rPIC中含有的一個基因整合到了靶細胞的染色體中。在重組的逆轉錄病毒載體整合到宿主染色體中之前立即形成了rPIC。
此外，本發明的發明者開發了一個可用于將基因轉移到多種靶細胞中的復合物、產生該復合物的方法、將基因轉移到細胞中的方法以及在上述發現的基礎上利用此復合物轉化細胞的方法。這樣，完成了本發明。
本發明的概要如下。本發明的第一方面涉及一種復合物，其包含含有源自逆轉錄病毒的長末端重復和逆轉錄病毒中缺乏的核苷酸序列的雙鏈DNA、以及源于逆轉錄病毒的蛋白成分。
本發明的第二方面涉及制備第一方面中的復合物的方法。
本發明的第三方面涉及基因轉移方法，此方法包括將第一方面中的復合物轉移到細胞中。
本發明的第四方面涉及基因轉移方法，此方法包括將源自逆轉錄病毒的蛋白成分以及含有源自逆轉錄病毒的長末端重復和具有逆轉錄病毒中缺乏的核苷酸序列的DNA的雙鏈DNA轉移到細胞中。
本發明的第五方面涉及一種用于基因轉移的組合物，它含有第一方面的復合物。
本發明的第六方面涉及用于基因轉移的試劑盒，其可用于第三或第四方面中的基因轉移方法。
本發明的第七方面涉及用于將基因轉移到細胞中的試劑產品，此產品含有包裝材料和包含于包裝材料中用于基因轉移的試劑，其中，用于基因轉移的試劑包括本發明第一方面中的復合物和/或用于制備此復合物的試劑，以及其中，在粘貼到包裝材料上的標簽或粘貼到包裝材料上的說明中指明此基因轉移試劑可用于基因轉移，該轉移并不包含利用重組逆轉錄病毒感染目的細胞這一步。
本發明的第八方面涉及將基因轉移到細胞中的試劑產品，此產品含有包裝材料和包含于包裝材料中用于基因轉移的試劑，其中，此基因轉移試劑包括本發明第四方面的基因轉移方法中應用的試劑，以及其中，在粘貼到包裝材料上的標簽或粘貼到包裝材料上的說明中指明此基因轉移試劑可用于基因轉移，該轉移并不包含利用重組逆轉錄病毒感染目的細胞這一步。
本發明的第九方面涉及轉化細胞的方法，此方法包括將第一方面中的復合物轉移到細胞中。
本發明的第十方面涉及轉導細胞的方法，此方法包括利用第四方面中的方法來轉移基因。
本發明的第十一方面涉及用于轉導細胞的組合物，其中包括第一方面中的復合物。
本發明的第十二方面涉及用于轉導細胞的試劑盒，該轉導包含本發明第三或第四方面中的基因轉移方法。
本發明的第十三方面涉及用于轉導細胞的試劑產品，此產品含有包裝材料和包含于包裝材料中的用于轉導的試劑，其中，用于轉導的試劑包括本發明第一方面的復合物和/或用于制備此復合物的試劑，以及其中，在粘貼到包裝材料上的標簽或粘貼到包裝材料上的說明中指明此轉導試劑可用于轉導，該轉導并不包含利用重組逆轉錄病毒感染目的細胞這一步。
本發明的第十四方面涉及用于轉導細胞的試劑產品，此產品含有包裝材料和包含于包裝材料中的用于轉導的試劑，其中，用于轉導的試劑包括本發明第十方面的轉導方法中應用的試劑，以及其中，在粘貼到包裝材料上的標簽或粘貼到包裝材料上的說明中指明此轉導試劑可用于轉導，該轉導并不包含利用重組逆轉錄病毒感染目的細胞這一步。
發明詳述本發明的詳細描述如下。
本發明中的復合物是用于將基因轉移到靶細胞中的復合物。特別地，此復合物是包含至少一個含有源自逆轉錄病毒的長末端重復(LTR)和具有逆轉錄病毒中缺乏的核苷酸序列的DNA(也即與逆轉錄病毒起源不同的DNA)的雙鏈DNA、以及源于逆轉錄病毒的蛋白成分的復合物。此復合物具有與逆轉錄病毒不同的結構。特別的，本發明中的復合物不具感染性，因為其不含RNA基因組和逆轉錄病毒被膜，或因為其逆轉錄病毒RNA基因組和被膜缺乏感染能力。在一個實施方案中，此源自逆轉錄病毒的長末端重復及具有逆轉錄病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA是來源于重組逆轉錄病毒。利用此復合物，可將復合物中在源自重組逆轉錄病毒的雙鏈DNA中包含的基因、或具有逆轉錄病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA轉移到靶細胞中。正如此處所用的，重組逆轉錄病毒是指對天然逆轉錄病毒基因組的核苷酸序列進行了部分修飾的逆轉錄病毒。例如，重組逆轉錄病毒包括有外源基因插入的逆轉錄病毒、其病毒基因組中的一個基因或其部分經受缺失、取代、插入或添加的逆轉錄病毒。沒有與重組逆轉錄病毒相關的特定限制。它可以是親嗜性病毒或兼嗜性病毒、或假型病毒。例如，可以選用商業購買的重組逆轉錄病毒載體。
沒有與含有源自逆轉錄病毒的長末端重復(LTR)和含有逆轉錄病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的雙鏈DNA相關的特別限制。優選的，此雙鏈DNA含有兩個源自逆轉錄病毒的LTR及一個含有插入到兩LTR間的逆轉錄病毒所缺乏的核苷酸序列DNA。
沒有與含有逆轉錄病毒中缺乏的核苷酸序列的DNA相關的特別限制。可以選用任何DNA，只要其向細胞內的轉移是所需的。例如，可選用含有編碼蛋白如酶或生長因子的基因的DNA，或含有編碼反義核酸、核酶等的基因的DNA。
此DNA可含有適當的標記基因來對含有被轉移基因的細胞進行篩選。例如，能對細胞上的抗生素產生抗性的藥物抗性基因、使含有被轉移基因的細胞可以基于酶活性等而區別的報道基因等都可用做標記基因。
按照本發明，在適當的啟動子如逆轉錄病毒載體中的LTR啟動子或外源啟動子的控制下，待轉移到細胞中的基因可包含在本發明的復合物中的雙鏈DNA中。此外，為了完成外源基因的有效轉錄，雙鏈DNA可包含與啟動子或轉錄起始位點協同作用的另一調節元件(如一增強子序列或終止子序列)。此外，為了避免染色體位置效應，雙鏈DNA可包含絕緣體序列等。待轉移的外源基因可以是天然存在的或人工制備的。另外，可利用已知方法如連接反應來連接不同來源的DNA分子以獲得外源基因。
正如此處所用，源于逆轉錄病毒的蛋白成分指具有將病毒DNA整合到宿主DNA上的整合活性的蛋白成分。盡管沒有限制本發明的目的，例如，蛋白成分含有一種酶，此酶具有將源自逆轉錄病毒的、具有長末端重復的DNA整合到染色體中的活性(例如，源自逆轉錄病毒的整合酶)。此外，源自逆轉錄病毒的蛋白成分可含有另一種蛋白，此蛋白已知包含在整合前復合物(PIC)中，而此復合物是在利用逆轉錄病毒將一基因整合到染色體中之前形成的。這樣的蛋白的例子有逆轉錄酶、核酸結合蛋白、衣殼蛋白或基質蛋白。同樣，細胞內因子如非組蛋白蛋白HMG-1或BAF-1，或DNA依賴型蛋白激酶(DNA-PK)也可包括在內。按照本發明，源自逆轉錄病毒的蛋白成分可在源自逆轉錄病毒的天然蛋白成分中具有缺失、取代、插入或添加等修飾，只要其具有將病毒DNA整合到宿主染色體中的活性。
逆轉錄病毒感染了正在分裂和生長的細胞后，其病毒基因就整合到宿主細胞的染色體中。利用逆轉錄病毒將基因整合到染色體中要進行下列一系列步驟(1)通過受體將病毒顆粒附著到靶細胞表面上；(2)釋放核心以侵入到細胞質中；(3)利用核心中的逆轉錄酶合成cDNA；(4)利用RNA酶H活性和酶的DNA依賴型DNA合成活性來合成雙鏈DNA；(5)形成整合前復合物(PIC)；(6)將PIC轉運到核中；及(7)通過具有整合活性的酶的作用對宿主染色體進行穩定的整合。
將基因整合到染色體中時需要通過斷裂宿主核膜的方式將PIC轉運到宿主的核中。轉運是通過宿主細胞的G2/M期完成的。因此，PIC不能轉運到不是正在分裂的細胞核中，從而基因與染色體的整合也就不能完成。因此，如果逆轉錄病毒感染的細胞停止在G1期，不能轉運進核中的PIC就堆積在細胞質中。我們能從細胞質中制備堆積的PIC。
例如，利用上述機制，按照下述步驟可優選的制備本發明中的復合物。
利用重組逆轉錄病毒感染通過細胞周期調節劑如蚜棲菌素處理而停止在G1期的細胞。對感染后的細胞進行培養。正如此處所用的，此培養沒有限定在孵育細胞以增加細胞數目上，而還包括維持細胞在細胞周期停止的狀態中。感染后7-11小時的時間內，在細胞質中進行了逆轉錄、雙鏈DNA合成和重組整合前復合物(rPIC)形成過程。由于細胞周期停止在G1期，生成的rPIC沒有整合到染色體中，而是聚集在細胞質中。利用去污劑來降解細胞膜可很容易的提取聚集在細胞質中的rPIC。提取到的rPIC可用于本發明中的方法中。此外，利用已知的方法如離心或色譜可對提取到的rPIC進行純化。從而，純化得到的rPIC也可用于本發明中的方法中。
用于制備本發明中的復合物的培養細胞可以是任何能被所用的逆轉錄病毒感染的細胞。例如，可選用NIH/3T3細胞(ATCC CRL-1658)、HT-1080細胞(ATCC CCL-121)或293細胞(ATCC CRL-1573)。
利用適當的補充試劑如polybrene或WO95/26200或WO97/18318中描述的功能性物質，通過重組逆轉錄病毒可有效感染停止在G1期的細胞。纖連蛋白片段可用做功能性物質。特別的，優先選用RetroNectin(Takara Shuzo)。
重組逆轉錄病毒顆粒具有雙鏈DNA合成所必需的逆轉錄酶活性和DNA合成酶活性，并具有與染色體整合所必需的蛋白成分(如整合酶)。因此，本發明中的復合物也可通過向體外破壞后的重組逆轉錄病毒顆粒中添加脫氧核糖核苷酸并對此混合物進行孵育而制備得到。
具體地，重組逆轉錄病毒顆粒是在適當的條件下進行體外破壞的。將脫氧核糖核苷酸添加進去。隨后，在體外進行cDNA合成和雙鏈DNA的合成反應。合成的雙鏈DNA與蛋白成分(如整合酶)結合。從而，形成了rPIC。上述形成的rPIC可用于本發明的方法中。此外，利用已知的方法如離心或色譜可對形成的rPIC進行純化。從而，純化后的rPIC也可用于本發明中的方法中。
此外，在不選用病毒顆粒的情況下，可以通過分別制備源自逆轉錄病毒且含有LTR的雙鏈DNA和逆轉錄病毒中缺乏的核苷酸序列、以及源自逆轉錄病毒的蛋白成分，并將他們在體外混合就可制備得到本發明中的復合物。
對于含有源自逆轉錄病毒的LTR的并含有所用病毒中缺乏的核苷酸序列的DNA的雙鏈DNA，此處沒有特別的限制。例如，雙鏈DNA含有兩個源自逆轉錄病毒的LTR和具有插入到此兩LTR間的病毒缺乏的核苷酸序列的DNA。沒有對含有病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的大小進行特別限定。按照目的不同可選用任何大小的DNA。
對于制備含有一個源自逆轉錄病毒的LTR和具有病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的雙鏈DNA，此處沒有特別的限定。例如，構建一個質粒，此質粒含有包含源自逆轉錄病毒的LTR和具有逆轉錄病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的基因盒，培養經此質粒轉化過的宿主細胞(如大腸桿菌)，這樣就能從由培養物中分離到的質粒中制備大量的雙鏈DNA。如果構建的質粒的一個限制性酶(或多個限制性酶)切割位點位于含有源自逆轉錄病毒的LTR和具有病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的雙鏈DNA的兩側，通過限制性酶的作用就可以很容易制備得到目的雙鏈DNA。利用基因擴增方法如PCR，選用具有上述基因盒的質粒，也可通過擴增來制備含有源自逆轉錄病毒的LTR和具有病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的雙鏈DNA。
按照本發明，在源自選用的逆轉錄病毒的蛋白成分的制備方法上沒有特別限定。例如，可從病毒顆粒、利用基因工程或從包裝細胞來制備此蛋白成分。按照本發明，通過將編碼此蛋白成分的基因克隆到表達載體中，利用表達載體在大腸桿菌等宿主中表達此基因，這樣就可很容易制備得到源自所選用的逆轉錄病毒的蛋白成分(如整合酶)。
培養包裝細胞而得到的培養上清液中含有具有DNA整合活性的成分。因此，源自本發明所選用的逆轉錄病毒的蛋白成分可從培養上清液中制備。例如，對培養包裝細胞后得到的培養上清液進行超離心，就能制備得到含有此蛋白成分的蛋白復合物。此外，也可從包裝細胞提取物中獲得含有此蛋白成分的蛋白復合物。此外，可利用已知的方法從蛋白復合物中純化具有DNA整合活性的蛋白成分。這樣得到的純化的蛋白成分也可可用于本發明中。
對于選用的包裝細胞，此處沒有特別的限定。例如，優先選用BOSC23細胞等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，908392-8396(1993))。
在不選用病毒顆粒的情況下，可通過將含有源自逆轉錄病毒的LTR和病毒中缺乏的核苷酸序列的雙鏈DNA與源自逆轉錄病毒的蛋白成分混合來制備本發明中的復合物，其中雙鏈DNA和蛋白成分是按照上述方法在體外分別制得的。上述制備的復合物可用于本發明的方法中。此外，利用已知方法如離心或色譜法對復合物進行選擇性純化。純化后的復合物也可用于本發明中的方法中。
如上所述，如果復合物是在體外制備的，那么對于本發明的復合物中的雙鏈DNA大小沒有特別的限定。因此，利用此復合物，就可對8kb或更長的基因進行轉移，而這是利用逆轉錄病毒載體進行的基因轉移方法所辦不到的。
只要不妨礙復合物轉移到細胞中和DNA整合到染色體中，此復合物可含有另一元件。
本發明中的復合物不需要包裝在逆轉錄病毒顆粒中。
本發明中的復合物可用于制備后立即進行的基因轉移。另外，也可對其進行冷凍保存并在應用前解凍應用。對冷凍保存方法沒有特別的限定，例如，可利用干冰對此復合物進行迅速冷凍，隨后在-80℃下保存。
將上述制備的復合物轉移到靶細胞中，基因就可轉移到靶細胞的染色體中，或可對靶細胞進行轉導。
對將復合物轉移入靶細胞中的方法沒有特別的限定。例如，可利用已知方法，如其中應用了胞飲作用的方法(如陽離子脂質體法或磷酸鈣法)或穿孔法如電穿孔、基因槍或微注射等，對復合物進行轉移。如果利用穿孔法對復合物進行轉移，如WO96/17073中所述，那么在轉移后，在具有細胞粘附活性的物質存在下，通過培養靶細胞就可有效獲得被轉導的細胞。
通過將含有源自逆轉錄病毒的LTR和病毒缺乏的核苷酸序列的雙鏈DNA以及源自逆轉錄病毒的蛋白成分轉移進靶細胞中，就可將基因轉移到靶細胞的染色體中，或就可對靶細胞進行轉導。
關于含有源自逆轉錄病毒的LTR和病毒缺乏的核苷酸序列的雙鏈DNA及源自逆轉錄病毒的蛋白成分的轉移順序，此處沒有特別的限定。可首先對含有源自逆轉錄病毒的LTR和病毒缺乏的核苷酸序列的雙鏈DNA進行轉移，或可首先對源自逆轉錄病毒的蛋白成分進行轉移。此外，也可對它們同時進行轉移。對于將含有源自逆轉錄病毒的LTR和病毒缺乏的核苷酸序列的雙鏈DNA及源自逆轉錄病毒的蛋白成分轉移到靶細胞中的方法來講，此處沒有特別的限定。例如，可利用已知的方法如應用胞飲作用的方法(如陽離子脂質體法或磷酸鈣法)或穿孔法如電穿孔、基因槍或微注射來對它們進行轉移。如果利用穿孔法進行轉移，如WO96/17073中所述，那么在轉移后，在具有細胞粘附活性的物質存在下，通過培養靶細胞就可有效獲得被轉導的細胞。
關于本發明中的基因轉移法或轉導方法中選用的靶細胞的來源，此處沒有特別的限定。由于重組逆轉錄病毒的趨性，多種真核細胞可用做靶細胞而沒有任何限制，而本發明中的復合物就是源于此重組逆轉錄病毒。例如，真核生物如哺乳動物、鳥、魚、昆蟲或植物的細胞都可用做靶細胞。
此處對靶細胞的類型沒有特別限制。所有類型的細胞(包括，如干細胞如造血干細胞和胚胎干細胞，生殖細胞如卵子和精子，以及多種體細胞)可用做靶細胞。
靶細胞可以是培養后的細胞或單獨的生物體。可利用脊椎動物受精卵或生殖細胞系作為靶細胞來生產轉基因動物。
從病毒感染開始到基因整合到染色體中，利用逆轉錄病毒進行的傳統的基因轉移需要至少7個小時的時間。這是因為在細胞質中形成整合前復合物需要時間。在此時間內，靶細胞進行分裂，這樣就形成了嵌合體，其中產生了具有轉移基因的細胞和缺乏轉移基因的細胞。這種現象對于生產轉基因動物來說是一個大問題。
另一方面，按照本發明中的基因轉移方法，轉移后基因立即整合到染色體中。因此，不會形成這樣的嵌合體。從而，本發明中的基因轉移方法和轉導方法保證了有效生產轉基因生物體。
此外，按照利用逆轉錄病毒進行的傳統基因轉移，操作人員只能轉移一個基因拷貝到靶細胞中。另一方面，按照本發明中的轉移方法，通過調節待轉移的復合物的數量，我們能夠將多拷貝基因轉移進靶細胞中。
用于本發明中的基因轉移的組合物和用于本發明中的轉導的組合物可分別用于本發明中的基因轉移方法和基因轉導方法，并且它們含有本發明中的復合物或源自逆轉錄病毒的蛋白成分。此組合物可含有適當的緩沖物質、鹽等。此組合物也可額外的含有可促進基因轉移的任何物質。
用于本發明中的基因轉移的試劑盒和用于本發明中的轉導的試劑盒可分別用于本發明中的基因轉移方法和基因轉導方法。此組合物以包裝形式存在，并含有可用于方法中的試劑和說明，此說明可指導將本發明中的復合物、或本發明中源自逆轉錄病毒的蛋白成分及含有源自逆轉錄病毒的長末端重復和具有逆轉錄病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的雙鏈DNA轉移入細胞中。正如此處所用的，說明是指指導施行本發明中的方法的文件。例如，此說明可以是用來描述本發明中的基因轉移方法、本發明中的基因轉導方法、利用本發明中的復合物或利用該方法中源自逆轉錄病毒的蛋白成分進行的方法、推薦使用的反應條件等的打印文檔。這些說明包括小冊子或傳單形式的說明手冊、粘貼到試劑盒上的標簽、以及在含有試劑盒的包裝上的說明書。這些說明也包括通過電子媒體如互聯網公開或提供的信息。
本發明中的試劑盒可含有用于制備本發明中的復合物的細胞、用于培養細胞的培養基、試劑和/或培養容器、用于將復合物、源自逆轉錄病毒的蛋白成分、或含有源自逆轉錄病毒的長末端重量和具有逆轉錄病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的雙鏈DNA轉移進靶細胞的試劑。
利用此試劑盒，技術人員可很方便的施行本發明中的基因轉移方法和轉導方法。
用于本發明中的基因轉移或轉導的試劑產品是含有包裝材料質及包含在包裝材料質中、用于基因轉移或細胞轉導的試劑產品，其中，用于基因轉移或轉導的試劑含有復合物和/或制備此復合物的試劑，而此復合物含有包含源自逆轉錄病毒的長末端重復和具有逆轉錄病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的雙鏈DNA、以及源自逆轉錄病毒的蛋白成分，其中在粘貼到包裝材料上的標簽或粘貼到包裝材料上的說明中指明此用于基因轉移或轉導的試劑可用于基因轉移或轉導，該轉移或轉導不包括利用逆轉錄病毒來感染目的細胞這一步。
此外，本發明中用于基因轉移或轉導的試劑產品是包含有包裝材料和包含在包裝材料內用于基因轉移或轉導的產品，其中用于基因轉移或轉導的試劑含有具有源自逆轉錄病毒的蛋白成分的組合物，其中在粘貼到包裝材料上的標簽或粘貼到包裝材料上的說明中指明此用于基因轉移的試劑可用于基因轉移或轉導，該轉移或轉導不包括利用重組逆轉錄病毒來感染目的細胞這一步。
按照本發明，我們克服了與利用逆轉錄病毒載體進行的傳統基因轉移法相關的缺陷，也即宿主范圍的限制，我們可將基因轉移到所有真核細胞中。特別的，由于利用逆轉錄病毒進行的傳統的基因轉移涉及通過病毒受體感染這一步，宿主范圍就限制在依賴受體的存在。另一方面，不管受體存在與否，可利用已知的方法，如利用了胞飲作用的方法、穿孔法、基因槍或微注射對本發明中的復合物進行轉移。結果，可將基因轉移進多種細胞中而不受宿主范圍限制。此外，按照本發明，在轉移到靶細胞中之后，基因立即整合到染色體中。因此，在生產轉基因生物時，沒有形成具有與傳統方法相關的問題的嵌合體。從而可有效生產轉基因生物體。
按照利用病毒載體進行的傳統方法，制備待應用的病毒顆粒需要進行復雜的操作。此外，由于很難制備高滴度的病毒載體，所以傳統方法具有缺陷。另一方面，本發明中的復合物可在不使用病毒顆粒的情況下進行體外制備。這樣，可在很短的時間內制備大量的復合物而不需要進行復雜的操作。因此，相對于傳統方法，現在可更方便、更有效的對基因進行轉移。
如上所述，本發明是一優良的技術，它克服了與傳統技術相關的缺陷，并且本發明非常有用，例如，因為當本發明應用到任何基因治療時，我們可期待產生顯著的治療效用，而這些基因治療由于與傳統方法相關的限制而受到了限制。
實施例下列實施例更詳細的例解了本發明，但并沒有限制本發明的范圍。
實施例1制備重組整合前復合物(rPIC)1.制備ecoGFP病毒上清液通過將含有綠色熒光蛋白(GFP)基因和新霉素抗性基因的質粒導入包裝細胞GP+E-86中而得到了可產生ecoGFP病毒的細胞[Journalof Virology，621120-1124(1998)]。37℃下，在5％CO2存在條件下，在Dulbecco’s改良Eagle’s培養基(DMEM，Sigma)中對細胞進行培養，而此培養基補充有含有50單位/ml青霉素(Gibco)和50μg/ml鏈霉素(Gibco)的10％胎牛血清(Bio Whittaker)。在所有情況下，下文描述的方法中使用的DMEM含有50單位/ml青霉素(Gibco)和50μg/ml鏈霉素(Gibco)。如下所述制備ecoGFP病毒懸液。將生產細胞在10cm平板中培養到半匯合狀態。向其中加入7ml補充有10％胎牛血清的DMEM。在5％CO2存在條件下，32℃下培養24小時，利用0.45微米孔徑的濾膜(Millipore)來過濾培養物上清液以制備病毒上清液原液，將其保存在-80℃下待用。
2.確定病毒上清液的滴度利用NIH/3T3細胞(ATCC CRL-1658)、按照標準方法來確定病毒上清液的滴度(Journal of Virology，621120-1124(1988))。簡單來講，向6孔組織培養板(Iwaki Glass)的每個孔中添加2ml補充有包含5×104個NIH/3T3細胞的10％小牛血清(Gibco)的DMEM。此平板在5％CO2存在條件下，37℃孵育過夜。然后吸出培養基。對1ml病毒上清液進行梯度稀釋，并且在每孔中添加8μg/ml的hexadimethrine bromide(polybrene，Aldrich)。37℃下孵育4小時。進一步向其中添加1ml補充有10％小牛血清的DMEM，孵育此平板20小時。隨后，將培養基換做2ml補充有10％小牛血清的DMEM，而此小牛血清含有終濃度為0.5mg/ml的G418(Gibco)。繼續進一步進行孵育。以3-4小時的時間間隔更換含有G418的培養基。10-12天后，利用0.2％的亞甲藍的甲醇溶液對生長后的G-418抗性菌落進行染色并計數。一個孔中的菌落數乘以病毒上清液的稀釋比率，這樣就計算得到了1ml上清液中的感染性病毒顆粒數目(cfu/ml)，以此作為病毒的滴度。上述制備的ecoGFP病毒懸液的滴度為1×107cfu/ml。
3.制備rPIC在5％CO2存在條件下，在直徑10cm、含有10ml補充有10％小牛血清的DMEM的培養板中培養2×106個NIH/3T3細胞，培養溫度為37℃，時間為24小時。然后將培養基換為7ml補充有10％小牛血清的DMEM，其中10％小牛血清中含有2μg/ml的蚜棲菌素(Wako Pure ChemicalIndustries)。在5％CO2存在條件下額外孵育14小時，溫度為37℃。在添加蚜棲菌素14小時后吸出培養基。將2ml ecoGFP病毒懸液與3ml補充有10％小牛血清的DMEM混合，并且向其中添加終濃度分別為2μg/ml和8μg/ml的阿非迪霉素和polybrene，制得一種混合物，在5％CO2存在條件下，將此混合物添加到NIH/3T3細胞中開始利用病毒進行感染，溫度為32℃。起始感染3小時后，取出病毒懸液，并將培養基換為7ml補充有10％小牛血清的DMEM，而此10％小牛血清中含有2μg/ml的阿非迪霉素。在5％CO2存在條件下，額外孵育5小時(從病毒感染開始算為10小時)，溫度為32℃。在此時間段內，在病毒感染過的NIH/3T3細胞中進行了逆轉錄和DNA合成反應以形成rPIC。然而，由于阿非迪霉素的作用，NIH/3T3細胞的細胞周期停止在G1期，所以rPIC聚集在細胞質中，而沒有將逆轉錄病毒基因整合到染色體中。
按照下列步驟從細胞質中提取聚集的rPIC。簡單來講，感染后用5ml PBS對細胞進行10小時的洗滌，并分散在2ml胰蛋白酶-EDTA(BioWhittaker)中。向其中添加5ml補充有10％小牛血清的DMEM。用9ml緩沖液A(10mMTris、225mM KCl、5mM MgCl2、1mM DTT、20μg/ml抑酶肽、pH7.4)洗滌200xg離心5分鐘后得到的細胞沉淀。將在200xg下離心沉淀5分鐘得到的沉淀物懸浮在250μl緩沖液A中。向細胞懸液中添加1.25μl毛地黃皂苷DMSO溶液。25℃下，將混合物靜置5分鐘就可提取到細胞質部分。將提取物在1000xg下離心3分鐘。將上清液在5000xg下進一步離心3分鐘。將得到的上清液進行50μl等分，作為rPIC懸液，并在-80℃下保存。
4.檢測雙鏈DNA以上文3中描述的通過提取和冷凍保存得到的rPIC懸液的稀釋液作為模板，利用GFP基因特異性引物進行PCR來檢測源自重組逆轉錄病毒的GFP基因。將0.5μl TaKaRa Taq(5單位/μl，TaKaRa Shuzo)、5μl10×PCR緩沖液(TaKaRa Shuzo)、8μl1.25mM dNTP混合物、1μl模板、20pmol引物1(SEQ ID NO1)、20pmol引物2(SEQ IDNO2)及蒸餾水混合到50μl的體積制得PCR反應混合物，利用礦物油覆蓋此混合物，并在94℃下加熱1分鐘，隨后進行30個循環反應，每個循環由94℃下反應30秒、56℃下反應30秒以及72℃下反應30秒組成。反應后，在2％瓊脂糖凝膠上對10μl PCR反應混合物進行電泳以確定擴增片段。以rPIC稀釋液或以利用苯酚-氯仿提取而從rPIC中純化得到的DNA作為模板。以相同的方式，對從沒有病毒感染的NIH/3T3細胞提取到的片段進行PCT，作為陰性對照。結果，當以rPIC稀釋液或以利用苯酚-氯仿提取而從rPIC中純化得到的DNA作為模板進行PCR時，我們觀察到了源自GFP基因的316bp片段的擴增。因此，這表明上文3中制備的rPIC含有源自重組病毒的GFP基因。
實施例2將rPIC轉移到培養后的細胞中在5％CO2存在條件下，利用補充有10％小牛血清的DMEM和補充有10％胎牛血清的DMEM作為培養基來分別培養小鼠NIH/3T3細胞和人293細胞(ATCC CRL-1573)，培養溫度為32℃。通過胰蛋白酶消化來分離10cm平板中生長到匯合狀態的小鼠NIH/3T3細胞和人293細胞。用不含血清的DMEM分別洗滌這兩種細胞，并將他們懸浮在700μlDMEM中。將700μl細胞懸浮液和100μl實施例1中制備的rPIC置于0.4cm寬的電穿孔小杯(Bio-Rad)中，并在250V、975uF和室溫下，利用基因脈沖發生器II(Bio-Rad)進行電穿孔。將1/10體積的小鼠NIH/3T3細胞或1/4體積的人293細胞接種到明膠包被的10cm平板中(Iwaki Glass)。從電穿孔后開始，在含有0.5mg/ml G418的培養基中進行細胞培養。
電穿孔后7天，在熒光顯微鏡下對細胞進行觀察。在小鼠NIH/3T3細胞和人293細胞中都可觀察到發射綠色熒光的細胞。因此，這表明轉移后的GFP基因在源自鼠和人的細胞中都能表達。
在電穿孔后進一步持續培養兩周后，在G418選擇性培養基中就形成了抗新霉素(G418)菌落。用亞甲藍對這些菌落進行染色。分別觀察到46個小鼠NIH/3T3細胞抗性菌落和196個人293細胞抗性菌落。因此，這表明轉移后的基因得到了穩定表達。
上述結果表明，從僅能感染源自鼠的細胞的親嗜性病毒制得的rPIC也可用于將一基因穩定轉移到源自人的細胞中，而按照傳統方法，此基因是不能轉移到源自人的細胞中的，此外也表明，rPIC可用于對基因進行穩定轉移，而不必顧及宿主的范圍。
實施例3制備高滴度rPIC并確定rPIC的整合效率1.制備高滴度rPIC在4℃下，對250ml ecoGFP病毒上清液進行為時16小時的低速(2900xg)離心，并將沉淀物懸浮在5ml補充有10％小牛血清的DMEM中，這樣就制備得到高滴度的ecoGFP病毒懸液。病毒懸液的滴度為4×108cfu/ml。病毒懸液可用于感染M.O.I為200的NIH/3T3細胞。如實施例2中所描述的來制備高滴度rPIC。
2.確定rPIC的整合效率對293細胞的基因轉移是利用高滴度rPIC、通過電穿孔進行的。作為對照，通過電穿孔或利用含有GFP基因和新霉素抗性基因的質粒載體進行轉染來實施對293細胞的基因轉移。基因轉移后3天，利用流式細胞儀FACS Vantage(Becton Dickinson)來選擇性的收獲表達GFP的293細胞。在收獲后的293細胞中，表達GFP的細胞的比率為94.3％(利用rPIC轉移)、94.3％(通過電穿孔，利用質粒載體來轉移)和98.8％(通過轉染利用質粒載體來轉移)，這表明對具有瞬時轉移的基因的細胞進行了選擇性收獲。在G418+和G418-培養基中培養瞬時表達GFP的293細胞，培養時間為2周。按照下列公式[含有G418的平板中的菌落數]÷[不含G418的平板中的菌落數]，來計算長期、穩定的基因表達的效率，以此作為整合效率。整合效率為98.7％(利用rPIC轉移)、7.5％(通過電穿孔，利用質粒載體來轉移)和1.4％(通過轉染利用質粒載體來轉移)，這表明rPIC是一種可產生良好的整合效率的載體。
實施例4將rPIC轉移到鳉魚的受精卵中25℃下，在3L自來水中飼養由一條雄魚和一條雌魚組成的一對成熟medaka魚，光照時間為14小時，而黑暗時間為10小時。每天對他們喂養以TetraFin(TetraWerke)3-5次，設定TetraFin的量，以便在3-5分鐘內消耗完畢，并且隨后產卵。在產卵后立即收集卵，在8ppm亞甲藍水溶液中利用鑷子將它們單個分開，并用水溶液洗滌。在Superose6凝膠過濾柱(Amersham Pharmacia)上純化實施例3中制備的高滴度rPIC。將含有rPIC的5μl純化級分置于微注射吸管中(利用毛細管模型GD-1制得，Narishige)，在顯微鏡下將大約50pl rPIC懸液注射到每個單細胞階段的鳉受精卵中。96個受精卵接受了微注射，并將它們置于96孔平板中，這樣每個孔含有一個受精卵，25℃下將它們培養在8ppm亞甲藍水溶液中。產卵后8天開始孵化魚苗，此后開始將它們一條一條轉移到魚缸中。最后，總共孵化了47條魚苗。16條魚苗在孵化后立即制成標本，置于1.5ml的微管中，并在-20℃下保存。如下所述，從孵化的魚苗中提取基因組DNA，并利用PCR來檢測新霉素抗性基因。簡單來講，將100μl提取緩沖液(10mM Tris、100mMNaCl、10mM EDTA、39mM DTT、2％SDS、50μg/ml蛋白酶K、pH8)添加到每只含有一條魚苗的微管中。60℃下孵育微管1小時。將利用苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀后得到的基因組DNA溶解在50μl蒸餾水中。
利用1μl獲得的基因組DNA溶液作為模板，選用特異于新霉素抗性基因引物進行PCR以檢測轉移后的基因。TaKaRa Taq(TaKaRaShuzo)用于PCR反應。將0.5μl TaKaRa Taq、5μl10x PCR緩沖液(TakaRa Shuzo)、8μl dNTP混合物、1μl稀釋后的模板、20pmol引物3(SEQ ID NO1)、20pmol引物4(SEQ ID NO2)及蒸餾水混合至50μl的體積，制得PCR反應混合物，利用礦物油覆蓋此混合物，并在94℃下加熱1分鐘，隨后進行30個循環反應，每個循環由94℃下反應30秒、56℃下反應30秒以及72℃下反應30秒組成。在2％瓊脂糖凝膠上對10μl PCR反應混合物進行電泳以確定擴增片段。結果，在利用微注射進行rPIC轉移過的16條鳉魚中全部檢測到了轉移后的基因。因此，基因轉移效率是100％。受精后1小時，鳉魚的受精卵處于單細胞階段。在其后35分鐘內，此受精卵分裂一次。如果VSV-G逆轉錄病毒載體用于分裂很快的細胞中，那么基因只能在高級發育階段進行整合，因為逆轉錄過程限制了整合速率。此外，僅僅通過意外重組才能使質粒載體整合到宿主染色體中。另一方面，因為rPIC是在整合到NIH/3T3細胞基因組前立即提取出來的，所以需要在能造成高整合效率的階段對其進行制備。因此，在細胞分裂的早期將rPIC整合到基因組中是我們所期望的。結果表明，rPIC是可應用于多種對象的載體，例如，其可作為生產轉基因動物的載體。
實施例5利用BOSC23細胞上清液將基因轉移進培養后的細胞中包裝細胞BOSC23含有待轉移的逆轉錄病毒gag-pol基因和親嗜性env基因。37℃下，在5％CO2存在條件下，在補充有10％胎牛血清的Dulbecco’s改良Eagle’s培養基中培養BOSC23細胞，而此10％胎牛血清含有50單位/ml的青霉素和50μg/ml的鏈霉素。
BOSC23細胞在10cm平板中生長到半匯合狀態。將培養基換為5ml補充有10％胎牛血清的新鮮DMEM。37℃下，在5％CO2存在條件下，對其進行為期24小時的培養。
利用孔徑為0.45微米(Millipore)的濾膜對培養物上清液進行過濾，并在4℃、30,000rpm下超速離心2小時。
利用DMEM洗滌產生的沉淀，并在4℃、30,000rpm下重新超速離心2小時。將產生的沉淀懸浮在50μl DMEM中。向其中添加含有SDS的試劑。將此混合物在99℃下離心5分鐘，隨后對蛋白進行電泳(SDS-PAGE)。
結果，我們確定了沉淀物中含有gag蛋白(p30，p15)。
這些結果表明在BSOC23細胞培養上清液中存在含有gag-pol-env蛋白的蛋白復合物。我們期望此蛋白復合物由于其env蛋白的功能而具有感染細胞的能力。利用BOSC23細胞的培養上清液中的蛋白復合物進行試驗，檢驗其將質粒DNA整合到培養后細胞的基因組中的能力。
1.制備BOSC23細胞上清液樣品按照下述步驟可獲得BOSC23細胞上清液樣品。BOSC23細胞在10cm平板中生長到半匯合狀態。將培養基換為10ml補充有10％胎牛血清的新鮮DMEM。利用孔徑為0.45微米(Millipore)的濾膜對在32℃、5％CO2存在條件下培養24小時后得到的培養上清液進行過濾。
2.利用BOSC23細胞上清液樣品進行基因轉移利用補充有10％小牛血清的DMEM作為培養基，在5％CO2存在條件下，對小鼠NIH/3T3細胞進行培養，培養溫度為37℃。利用LipofectAMINE2000(Gibco)，將在逆轉錄病毒LTR間含有GFP基因和新霉素抗性基因的逆轉錄病毒載體質粒pDON-AI-rsGFP轉染到在10cm平板中生長到半匯合狀態的小鼠NIH/3T3細胞中。在37℃、5％CO2存在的條件下，在10ml補充有小牛血清的DMEM中培養小鼠NIH/3T3細胞以制備檢驗樣品。將編碼rsGFP的基因整合到逆轉錄病毒載體pDON-AI中，從而構建pDON-AI-rsGFP，其中rsGFP是從rsGFP編碼質粒pQBI25(Takara Shuzo)制得的。培養5小時后，將培養基從檢測樣品中吸出。向其中添加4ml上文1中制備的BOSC23細胞上清液樣品。進一步向其中添加8μg/ml的Hexadimethrine bromide(polybrene，Aldrich)。在32℃下培養16小時。培養16小時后，將BOSC23細胞上清液樣品吸出，向其中添加10ml補充有10％小牛血清的DMEM，并在37℃、5％CO2存在的條件下培養24小時。24小時培養后，對細胞進行收獲。將20,000個細胞接種到6cm、明膠包被的平板中。在補充有10％小牛血清的DMEM中培養細胞，其中的10％小牛血清中含有經濃度為0.5mg/ml的G418(Gibco)。14天后，利用0.2％亞甲藍的甲醇溶液對生長后的G418抗性菌落進行染色并計數。此外，作為對照，將500個細胞接種到6cm、明膠包被的平板中，在37℃、5％CO2存在的條件下，在不含G418的正常培養基中培養14天。隨后，利用0.2％亞甲藍的甲醇溶液對生長后的菌落進行染色并計數。
作為對照，通過轉染進行基因轉移后5小時，將培養基吸出，向其中添加正常的培養基，并在37℃、5％CO2存在的條件下進行培養。
40小時后，對細胞進行收獲。將20,000個細胞接種到6cm、明膠包被的平板中。在補充有10％小牛血清的DMEM中培養細胞，其中的10％小牛血清中含有終濃度為0.5mg/ml的G418(Gibco)。14天后，利用0.2％亞甲藍的甲醇溶液對生長后的G418抗性菌落進行染色并計數。此外，作為對照，將500個細胞接種到6cm、明膠包被的平板中，在37℃、5％CO2存在的條件下，在正常培養基中培養14天。隨后，利用0.2％亞甲藍的甲醇溶液對生長后的菌落進行染色并計數。
按照下列公式[含有G418的平板中的菌落數]÷[不含G418的平板中的菌落數]，來計算長期的基因表達的效率(整合效率)。對檢測樣品進行確定得到的整合效率是5.00％，然而對照組的整合效率僅為0.76％。這些結果表明，將質粒載體轉移到細胞中，隨后利用BOSC23細胞上清液樣品感染轉移后的細胞，由于BOSC23細胞上清液樣品中含有gag-pol-env蛋白的蛋白復合物的作用，質粒載體可以大約高于對照組7倍的效率整合到宿主細胞的基因組中。這些結果表明，具有LTR和逆轉錄病毒結構蛋白的質粒載體在靶細胞中形成了一個復合物。
工業實用性本發明提供了在不必顧及宿主范圍的情況下，有效的進行基因轉移的方法。按照本發明中的基因轉移方法，由于轉移后的基因是立即整合到宿主染色體中的，所以此方法可保證有效生產轉基因生物。
序列表文字SEQ ID NO1用于擴增GFP基因的一部分的PCR引物。
SEQ ID NO2用于擴增GFP基因的一部分的PCR引物。
SEQ ID NO3用于擴增neor基因的一部分的PCR引物。
SEQ ID NO4用于擴增neor基因的一部分的PCR引物。
1/2序列表<110>寶生物工程株式會社<120>復合物<130>662777<150>JP<151>2000-09-20<160>4<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴增GFP基因的一部分的PCR引物<400>1caccctcgtg accaccctga c 21<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列
2/2<220><223>用于擴增GFP基因的一部分的PCR引物<400>2caccttgatg ccgttcttct gctt24<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴增neor基因的一部分的PCR引物<400>3gcttgatccg gctacctgcc catt24<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴增neor基因的一部分的PCR引物<400>4gccacagtcg atgaatccag aaaa2權利要求
1.包含含有源自逆轉錄病毒的長末端重復和具有逆轉錄病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的雙鏈DNA、以及源自逆轉錄病毒的蛋白成分的復合物。
2.權利要求1中的復合物，其中含有源自逆轉錄病毒的長末端重復和具有逆轉錄病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的雙鏈DNA是源自重組逆轉錄病毒。
3.權利要求2中的復合物，其中重組逆轉錄病毒可通過利用重組逆轉錄病毒感染易被重組逆轉錄病毒感染的細胞來獲得。
4.權利要求3中的復合物，其中易被重組逆轉錄病毒感染的細胞的細胞周期處于停止狀態。
5.權利要求1中的復合物，其可通過將含有源自逆轉錄病毒的長末端重復和具有逆轉錄病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的分離雙鏈DNA與源自逆轉錄病毒的分離蛋白成分相混合獲得。
6.權利要求1中的復合物，其中源自逆轉錄病毒的蛋白成分是源自包裝細胞的培養上清液和/或源自包裝細胞的提取物。
7.權利要求1中的復合物，其中源自逆轉錄病毒的蛋白成分包括一種酶，此酶具有將一種含有源自逆轉錄病毒的長末端重量的DNA整合到染色體DNA中的活性。
8.制備復合物的方法，此方法包括(a)利用含有源自逆轉錄病毒的長末端重量和逆轉錄病毒所缺乏的核苷酸序列的重組逆轉錄病毒來感染易被重組逆轉錄病毒感染的細胞；(b)培養在(a)步感染的細胞；并且(c)從(b)步培養的細胞中收集包含源自重組逆轉錄病毒的雙鏈DNA和源自逆轉錄病毒的蛋白成分的復合物。
9.權利要求8中的方法，其中易被重組逆轉錄病毒感染的細胞的細胞周期處于停止狀態。
10.制備復合物的方法，此方法包括(a)破壞含有源自逆轉錄病毒的長末端重復和逆轉錄病毒所缺乏的核苷酸序列的重組逆轉錄病毒顆粒以制備含有病毒成分的混合物；(b)向在步驟(a)中制備的混合物中添加脫氧核糖核苷酸以制備源自重組逆轉錄病毒的雙鏈DNA，以形成含有該雙鏈DNA和源自逆轉錄病毒的蛋白成分的復合物；并且(c)收集步驟(b)中形成的復合物。
11.制備復合物的方法，此方法包括(a)分離含有源自逆轉錄病毒的長末端重復和具有逆轉錄病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的雙鏈DNA；(b)分離源自逆轉錄病毒的蛋白成分；(c)將在前面步驟中獲得的雙鏈DNA和源自逆轉錄病毒的蛋白成分混合以形成復合物；并(d)收集前一步形成的復合物。
12.權利要求11中的方法，其中源自逆轉錄病毒的蛋白成分是包裝細胞的培養上清液和/或包裝細胞的提取物。
13.權利要求8、10和11中任一項的方法，其中源自逆轉錄病毒的蛋白成分包括一種酶，此酶具有將一種含有源自逆轉錄病毒的長末端重量的DNA整合到染色體DNA中的活性。
14.一種將基因轉移到細胞中的方法，此方法包括將一種復合物轉移到細胞中，而此復合物包含含有源自逆轉錄病毒的長末端重復和具有逆轉錄病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的雙鏈DNA、以及源自逆轉錄病毒的蛋白成分。
15.權利要求14中的方法，其中此復合物是通過權利要求8、10和11中任一項的方法獲得的。
16.一種將基因轉移到細胞中的方法，此方法包括將源自逆轉錄病毒的蛋白成分及含有源自逆轉錄病毒的長末端重復和具有逆轉錄病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的雙鏈DNA轉移進細胞中。
17.權利要求16中的方法，其中源自逆轉錄病毒的蛋白成分是源自包裝細胞的培養上清液。
18.權利要求16中的方法，其中源自逆轉錄病毒的蛋白成分包括一種酶，此酶具有將一種含有源自逆轉錄病毒的長末端重量的DNA整合到染色體DNA中的活性。
19.用于將基因轉移到細胞中的組合物，此組合物含有源自逆轉錄病毒的蛋白成分。
20.權利要求19中的組合物，其中源自逆轉錄病毒的蛋白成分與含有源自逆轉錄病毒的長末端重復和具有逆轉錄病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的雙鏈DNA形成復合物。
21.權利要求20中的組合物，其中此復合物可以通過權利要求8、10和11中任一項的方法獲得。
22.權利要求19中的組合物，其進一步含有具有源自逆轉錄病毒的長末端重量的載體。
23.權利要求22中的組合物，其中的載體是用于制備重組逆轉錄病毒的載體。
24.權利要求22中的組合物，其中的載體是質粒載體。
25.權利要求19中的組合物，其中源自逆轉錄病毒的蛋白成分是源自包裝細胞的培養上清液和/或包裝細胞的提取物。
26.權利要求19中的組合物，其中源自逆轉錄病毒的蛋白成分包括一種酶，此酶具有將一種含有源自逆轉錄病毒的長末端重量的DNA整合到染色體DNA中的活性。
27.用于將基因轉移至細胞內的試劑盒，其中含有用于將基因轉移至細胞內的組合物，而此組合物含有源自逆轉錄病毒的蛋白成分。
28.用于將基因轉移至細胞內的試劑盒，它用于將基因轉移至細胞內的方法中，它以包裝形式存在，并且它含有說明，此說明指導將包含含有源自逆轉錄病毒的長末端重量和具有逆轉錄病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的雙鏈DNA及源自逆轉錄病毒的蛋白成分的復合物轉移入細胞中。
29.用于將基因轉移至細胞內的試劑盒，它用于將基因轉移至細胞的復合物的方法中，它以包裝形式存在，并且它含有說明，此說明指導將源自逆轉錄病毒的蛋白成分及含有源自逆轉錄病毒的長末端重量和具有逆轉錄病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的雙鏈DNA轉移至細胞中。
30.用于將基因轉移至細胞中的試劑產品，它含有包裝材料及包含在包裝材料中、用于基因轉移的試劑，其中，用于基因轉移的試劑含有一種復合物和/或制備此復合物的試劑，而此復合物含有包含源自逆轉錄病毒的長末端重量和具有逆轉錄病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的雙鏈DNA、以及源自逆轉錄病毒的蛋白成分，并且其中在粘貼到包裝材料上的標簽或粘貼到包裝材料上的說明中指明此用于基因轉移的試劑可用于基因轉移，該基因轉移不包括利用逆轉錄病毒來感染目的細胞這一步。
31.用于將基因轉移至細胞中的試劑產品，它含有包裝材料和包含在包裝材料中、用于基因轉移的試劑產品，其中用于基因轉移的試劑含有源自逆轉錄病毒的蛋白成分，其中在粘貼到包裝材料上的標簽或粘貼到包裝材料上的說明中指明，此用于基因轉移的試劑可用于基因轉移，該基因轉移不包括利用重組逆轉錄病毒來感染目的細胞這一步。
32.權利要求30或31中的產品，其中源自逆轉錄病毒的蛋白成分包括一種酶，此酶具有將一種含有源自逆轉錄病毒的長末端重量的DNA整合到染色體DNA中的活性。
33.一種轉導細胞的方法，此方法包括將一種復合物轉移到細胞中，此復合物包含含有源自逆轉錄病毒的長末端重量和具有逆轉錄病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的雙鏈DNA、以及源自逆轉錄病毒的蛋白成分。
34.權利要求33中的方法，其中此復合物是通過權利要求8、10和11中任一項的方法獲得的。
35.一種轉導細胞的方法，此方法包括將源自逆轉錄病毒的蛋白成分及含有源自逆轉錄病毒的長末端重量和具有逆轉錄病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的雙鏈DNA轉移至細胞中。
36.權利要求35中的方法，其中源自逆轉錄病毒的蛋白成分是源自包裝細胞的培養上清液和/或包裝細胞的提取物。
37.權利要求35中的方法，其中源自逆轉錄病毒的蛋白成分包括一種酶，此酶具有將一種含有源自逆轉錄病毒的長末端重復的DNA整合到染色體DNA中的活性。
38.一種用于轉導細胞的組合物，此組合物含有源自逆轉錄病毒的蛋白成分。
39.權利要求38中的組合物，其中源自逆轉錄病毒的蛋白成分與含有源自逆轉錄病毒的長末端重量和具有逆轉錄病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的雙鏈DNA形成復合物。
40.權利要求38中的組合物，其中此復合物是通過權利要求8、10和11中任一項的方法獲得的。
41.權利要求38中的組合物，其進一步含有一種載體，而此載體可用于制備含有源自逆轉錄病毒的長末端重量和具有逆轉錄病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的雙鏈DNA。
42.權利要求41中的組合物，其中的載體是用于制備重組逆轉錄病毒的載體。
43.權利要求41中的組合物，其中的載體是質粒載體。
44.權利要求38中的組合物，其中源自逆轉錄病毒的蛋白成分是源自包裝細胞的培養上清液和/或包裝細胞的提取物。
45.權利要求38中的組合物，其中源自逆轉錄病毒的蛋白成分包括一種酶，此酶具有將一種含有源自逆轉錄病毒的長末端重復的DNA整合到染色體DNA中的活性。
46.用于轉導細胞的試劑盒，其含有用于轉導含有源自逆轉錄病毒的細胞的組合物。
47.用于轉導細胞的試劑盒，其含有說明，此說明指導將一種復合物轉移至細胞內，而此復合物包含含有源自逆轉錄病毒的長末端重量和具有逆轉錄病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的雙鏈DNA及源自逆轉錄病毒的蛋白成分，而此逆轉錄病毒可用于轉導細胞的方法。
48.用于轉導細胞的試劑盒，它用于轉導細胞的方法中，它以包裝形式存在，并且它含有說明，此說明指導將源自逆轉錄病毒的蛋白成分及含有源自逆轉錄病毒的長末端重量和具有逆轉錄病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的雙鏈DNA轉移入細胞中。
49.用于轉導細胞的試劑產品，它含有包裝材料及包含在包裝材料中、用于轉導的試劑產品，其中，用于轉導的試劑包括一種復合物和/或制備此復合物的試劑，而此復合物含有包含源自逆轉錄病毒的長末端重量的雙鏈DNA和源自逆轉錄病毒的蛋白成分，其中在粘貼到包裝材料上的標簽或粘貼到包裝材料上的說明上指明此用于轉導的試劑可用于轉導，該轉導包括利用逆轉錄病毒來感染目的細胞這一步。
50.用于轉導細胞的試劑產品，它包含包裝材料和包含在包裝材料內用于轉導的試劑，其中用于轉導的試劑含有源自逆轉錄病毒的蛋白成分，其中在粘貼到包裝材料上的標簽或粘貼到包裝材料上的說明中指明此用于轉導的試劑可用于轉導，該轉導不包括利用重組逆轉錄病毒來感染有益細胞這一步。
51.權利要求49或50中的產品，其中源自逆轉錄病毒的蛋白成分包括一種酶，此酶具有將一種含有源自逆轉錄病毒的長末端重復的DNA整合到染色體DNA中的活性。
52.權利要求14或16中的方法，其中的基因被轉移到真核細胞中。
53.權利要求14或16中的方法，其中的基因被轉移到源自真核細胞的培養細胞中。
54.權利要求14或16中的方法，其中的基因被轉移到真核生物個體中。
55.權利要求14或16中的方法，其中的基因被轉移到脊椎動物受精卵中。
56.權利要求14或16中的方法，其中的基因被轉移到脊椎動物的生殖系中。
57.權利要求33或35中的方法，其中對真核細胞進行了轉導。
58.權利要求33或35中的方法，其中對源自真核細胞的培養細胞進行了轉導。
59.權利要求33或35中的方法，其中對真核生物個體進行了轉導。
60.權利要求33或35中的方法，其中對脊椎動物的受精卵進行了轉導。
61.權利要求33或35中的方法，其中對脊椎動物的生殖系進行了轉導。
全文摘要
包含其中含有源自逆轉錄病毒的末端重量并含有逆轉錄病毒中缺乏的堿基序列的DNA的雙鏈DNA、以及源于逆轉錄病毒的蛋白成分的復合物。
文檔編號C12N15/867GK1447858SQ01814549
公開日2003年10月8日 申請日期2001年9月18日 優先權日2000年9月20日
發明者蝶野英人, 松村肇, 上野充博, 加藤郁之進 申請人:寶生物工程株式會社