專利名稱：磷酸核糖焦磷酸合成酶1作為除草劑的靶標的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1(E.C.2.7.6.1)作為新的除草活性成分作用靶標的鑒定。本發明也涉及編碼具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的多肽的DNA序列SEQ-ID No.1，SEQ-ID No.3或者SEQ-IDNo.5或者其衍生物的一部分在建立鑒定具有除草作用活性的磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制劑的檢測系統中的用途。本發明也涉及鑒定可抑制植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的物質的方法或者檢測系統，以及使用此類方法或者這一檢測系統鑒定出的植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1的抑制劑。
植物能夠利用二氧化碳、水和無機鹽合成它們的細胞成分。
此過程只有通過利用合成有機物質的生物化學反應才可能進行。植物體內核苷酸是從頭合成的。作為核酸的成分，它們具有特別的重要性。通過與之共價結合，核苷酸活化碳水化合物進行多糖的生物合成。它們還活化用于脂類生物合成的頭部基團。核苷酸實際上參與了所有的代謝過程。三磷酸核苷，特別是ATP，驅動細胞中大部分能量依賴的反應。還發現腺嘌呤核苷是一些基本因子，如參與了大量細胞內反應的輔酶A、煙酰胺和黃素輔酶的一種組成成分。5’-三磷酸鳥苷(GTP)的偶聯水解決定了多種細胞內過程，如蛋白質翻譯、微管組裝、小泡轉運、信號轉導和細胞分裂所需反應的方向。而且，核苷酸也構成了甲基黃嘌呤類，如茜草科(Rubiaceae)和山茶科(Theaceae)植物中咖啡因和可可堿生物合成的起始代謝物。
由于植物依賴于有效的核苷酸代謝，可以設想參與核苷酸生物合成的酶可作為除草劑的合適靶標蛋白質。因此，現已有關于抑制植物從頭嘌呤生物合成的活性成分的描述。可以提到的一個例子是天然物質hydanthocidin，其在植物體內磷酸化后可抑制腺苷酸琥珀酸合成酶(ASS)。(Siehl等人，植物生理學(Plant Physiol.)110(1996)，753-758)。
磷酸核糖焦磷酸(PRPP)是植物新陳代謝中一個必需成分。其為嘌呤和嘧啶核苷酸，吡啶核苷酸輔酶NAD的從頭合成，以及已經合成的嘌呤、嘧啶和吡啶的再利用所必需。此外，PRPP也為組氨酸和色氨酸的合成所必需(參見Krath和Hove-Jensen，植物生理學119(1999)，497-505)。負責PRPP合成的酶是PRPP合成酶，其使核糖-5-磷酸和MgATP轉換成AMP和PRPP。一些生物體的磷酸核糖焦磷酸合成酶還需要Mg2+。真核生物經常具有超過一種的磷酸核糖焦磷酸合成酶。因而，例如，人類就具有功能冗余的三種形式同工酶。植物磷酸核糖焦磷酸合成酶，例如，在菠菜中就存在四種同工型，可被分為兩類，它們在位置和功能上是不同的，或者受植物細胞不同發育依賴調節機制的支配。例如，磷酸核糖焦磷酸合成酶2被運送至葉綠體中(Krath和Hove-Jensen，植物生理學119(1999)，497-505)。這也同在鼠耳芥屬(Arabidopsis)葉綠體中檢測到與嘌呤從頭生物合成有關的幾種酶的結果相吻合(Senecoff和Meager，植物生理學102(1993)，387-399；Ito等人，植物分子生物學(Plant Mol Biol.)26(1994)，529-533；Schnorr等人，植物雜志(Plant Journal)6(1994)，113-121)。在酵母中，已經證明4種磷酸核糖焦磷酸合成酶同工型具有不同的功能(Cater等人，酵母(Yeast)10(1994)，1031-1044)。與人、其它高等真核生物和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的磷酸核糖焦磷酸合成酶相反，對植物磷酸核糖焦磷酸合成酶僅有極少數的研究。在美國專利(US Patents)5,780,253和5,780,254中已經描述了鑒定植物嘌呤代謝抑制劑的一般方法。
從多種生物體中都已經分離出了編碼磷酸核糖焦磷酸合成酶1的基因。至于植物，已經從擬南芥(Arabidopsis thaliana)(登錄號X83764)和煙草中(Badur博士，Gttingen大學，1998)分離到了其全長DNA序列。
一種酶作為除草劑的靶標是否合適可以通過降低酶活性，例如在轉基因植物中利用反義技術降低酶活性來確定。如果將某種基因的反義DNA導入植物中導致植物生長減慢，就提示活性降低的酶是適合作為除草劑活性成分作用位點的。例如，在轉基因馬鈴薯中反義抑制乙酰乳酸合成酶(ALS)，如同使用ALS抑制性除草劑處理對照植物一樣，導致了類似的表現型(Hfgen等人，植物生理學107(1995)，469-477)。
本發明的一個目的是提供在植物中磷酸核糖焦磷酸合成酶1是合適的除草劑作用靶標的證據，以及產生一種有效、簡便的磷酸核糖焦磷酸合成酶1檢測系統以進行抑制劑-酶結合研究。
我們發現，通過分離編碼植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1的基因，構建植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1的反義構建體和使其在植物中表達，以及在細菌或真核細胞中功能性表達植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1，可以達到此目的。
為達到此目的，煙草(Nicotiana tabacum)和擬南芥編碼植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1的cDNA以及展葉劍葉蘚(Physcomitrella patens)的部分cDNA得到分離和測序，參見實施例1和實施例6，序列表SEQ-ID No.1、SEQ-ID No.3和SEQ-ID No.5。
攜帶有義和反義磷酸核糖焦磷酸合成酶1構建體的擬南芥和枯斑三生煙(Nicotiana tabacum cv.Samsun NN)煙草植株的性質得到非常仔細的分析。這些反義植物顯示了不同程度的生長延遲。轉基因植株以及第一、第二代后代植株在土壤中生長減慢。Northern雜交顯示，生長減慢的植株與野生型植株相比磷酸核糖焦磷酸合成酶1的RNA數量降低了，參見實施例5和圖3。此外，通過酶活性測定發現轉基因反義株系與野生型植株相比磷酸核糖焦磷酸合成酶1的活性值也降低了。磷酸核糖焦磷酸合成酶1表達水平和活性的降低與生長延遲相關。盡管在植物中極可能存在數種磷酸核糖焦磷酸合成酶的同工型，但是令人吃驚的是，發現導入一種磷酸核糖焦磷酸合成酶反義構建體就可觀察到生長減慢。這種清楚的關系第一次明確地證明磷酸核糖焦磷酸合成酶1可以作為除草劑活性成分的合適靶標蛋白質。
本發明的另一主題涉及通過高通量篩選來鑒定植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制劑的方法。因此，本發明涉及植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1，特別是煙草和擬南芥磷酸核糖焦磷酸合成酶1在適當的表達系統中的功能性表達，以及由此制備的酶在測定磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的體外檢測系統中的用途。
為了能夠發現有效的植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制劑，必須提供可以研究抑制劑-酶結合的合適檢測系統。例如，為此將磷酸核糖焦磷酸合成酶1 cDNA序列或者煙草或擬南芥磷酸核糖焦磷酸合成酶1 cDNA序列的合適片段克隆入表達載體(pQE，Qiagen)并在大腸桿菌(E.coli.)中超量表達。
但是，作為選擇，也可以在其它種類的細菌中、在酵母、真菌、藻類、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞中表達含有SEQ-ID No.1或者SEQ-ID No.3的DNA序列或者DNA亞序列，或者這些序列的衍生序列的表達盒。
本發明的另一主題涉及源自SEQ-ID No.1或SEQ-ID No.3、或者與這些序列之一雜交并編碼具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1生物活性的蛋白質的DNA序列的用途。
在表達盒的幫助下表達的植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1蛋白特別適合用于鑒定磷酸核糖焦磷酸合成酶1的特異性抑制劑。
至此，例如，將可以在待測活性成分存在或不存在的情況下測定磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的酶分析方法中利用植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1。通過比較兩種情況下的活性測定結果，可對待測活性成分的抑制性作用進行定性和定量的評價，參見實施例7。
根據本發明的檢測系統允許對大量的化合物進行快速、簡便的檢測以確定其除草特性。使用此方法，具有有效作用的物質可被特異性地和可重復地從大量的物質中篩選出來，以利于接下來對這些物質進行研究人員所熟悉的深入檢測。
本發明的另一個主題涉及通過克隆植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因并在合適的表達盒中超量表達—例如在昆蟲細胞中表達，裂解細胞并將細胞提取物直接，或濃縮，或分離磷酸核糖焦磷酸合成酶1后，應用于檢測系統以便在低分子量化合物存在的情況下測定酶活性以鑒定具有潛在除草劑作用的植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制劑的方法。
本發明的另一個主題涉及用以鑒定可抑制植物中磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的具有除草作用的活性物質的方法，該方法包括a)產生含有編碼具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的酶以及能夠超量表達具有酶活性的磷酸核糖焦磷酸合成酶1的額外DNA序列的轉基因植物、植物組織或植物細胞；b)對轉基因植物、植物細胞、植物組織或者植物器官和未轉化的植物、植物細胞、植物組織或者植物器官使用一種物質；c)在使用該化學物質之后，確定轉基因和未轉化植物、植物細胞、植物組織或者植物器官的生長或者存活能力；以及d)比較在使用該化學物質之后，轉基因和未轉化植物、植物細胞、植物組織或者植物器官的生長或者存活能力；當b)中使用的物質可抑制未轉化植物、植物細胞、植物組織或者植物器官的生長或者存活能力，但是基本上不抑制轉基因植物、植物細胞、植物組織或者植物器官的生長或者存活能力時，可以確認該物質具有除草劑活性并可抑制植物中的磷酸核糖焦磷酸合成酶1的酶活性。
本發明的另一個主題是可用以上描述的檢測系統鑒定的具有除草劑活性的化合物。
具有除草劑活性的磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制劑可作為落葉劑、干燥劑、除莖桿劑，特別是除雜草劑使用。雜草在最廣義上講應理解為是指生長在不希望它們出現的地點的所有植物。在根據本發明的檢測系統幫助下鑒定出的活性成分是以廣譜除草劑還是選擇性除草劑的形式起作用將尤其取決于使用的量。
例如，具有除草劑活性的磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制劑可用來清除下述雜草下列種屬的雙子葉雜草
白芥屬(Sinapis)、獨行菜屬(Lepidium)、拉拉藤屬(Galium)、繁縷屬(Stellaria)、母菊屬(Matricaria)、春黃菊屬(Anthemis)、牛膝菊屬(Galinsoga)、藜屬(Chenopodium)、蕁麻屬(Urtica)、千里光屬(Senecio)、莧屬(Amaranthus)、馬齒莧屬(portulaca)、蒼耳屬(Xanthium)、旋花屬(Convolvulus)、蕃薯屬(Ipomoea)、蓼屬(Polygonum)、田菁屬(Sesbania)、豚草屬(Ambrosia)、薊屬(Cirsium)、飛廉屬(Carduus)、苦苣菜屬(Sonchus)、茄屬(Solanum)、蔊菜屬(Rorippa)、節節菜屬(Rotala)、母草屬(Lindernia)、野芝麻屬(Lamium)、婆婆納屬(Veronica)、苘麻屬(Abutilon)、刺酸膜屬(Emex)、曼陀羅屬(Datura)、蓳菜屬(Viola)、鼬瓣花屬(Galeopsis)、罌粟屬(Papaver)、矢車菊屬(Centaurea)、車軸草屬(Trifolium)、毛茛屬(Ranunculus)、蒲公英屬(Taraxacum)。
下列種屬的單子葉雜草稗屬(Echinochloa)、狗尾草屬(Setaria)、黍屬(Panicum)、馬唐屬(Digitaria)、梯牧草屬(Phleum)、早熟禾屬(Poa)、羊茅屬(Festuca)、蟋蟀草屬(Eleusine)、臂形草屬(Brachiaria)、黑麥草屬(Lolium)、雀麥屬(Bromus)、燕麥屬(Avena)、莎草屬(Cyperus)、高梁屬(Sorghum)、冰草屬(Agropyron)、狗牙根屬(Cynodon)、雨久花屬(Monochoria)、飄拂草屬(Fimbristyslis)、慈姑屬(Sagittaria)、荸薺屬(Eleocharis)、蔍草屬(Scirpus)、雀稗屬(Paspalum)、鴨嘴草屬(Ischaemum)、尖瓣花屬(Sphenoclea)、龍爪茅屬(Dactyloctenium)、剪股穎屬(Agrostis)、看麥娘屬(Alopecurus)、阿披拉草屬(Apera)。
本發明的主題也涉及編碼擬南芥或煙草磷酸核糖焦磷酸合成酶1或其功能等價物的表達盒序列在建立鑒定具有除草劑活性的化合物的檢測系統中的用途。例如，該核苷酸序列可以是DNA或cDNA序列。
這樣的表達盒還包含控制編碼序列在宿主細胞中表達的調節核苷酸序列。按照優選的實施方案，根據本發明的表達盒包括上游(例如在編碼序列的5′末端)啟動子，和下游(例如在編碼序列的3′末端)聚腺苷酸化信號以及，如果適當的話，操作性地連接磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因編碼序列的其它調節元件，所述編碼序列位于啟動子和聚腺苷酸化信號之間。操作性連接應理解為是指啟動子、編碼序列、終止子以及，如果適當的話，其它調節元件均以一定的形式有序排列，以致每一調節元件都可象編碼序列得到表達時期望的那樣起作用。
根據本發明的這樣表達盒通過利用常規的，例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningALaboratory Manual)，冷泉港實驗室，冷泉港，NY(1989)和T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，基因融合實驗操作(Experiments with genefusions)，冷泉港實驗室，冷泉港，NY(1984)和Ausubel，F.M.等人，最新分子生物學實驗指南(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience(1987)所描述的重組和克隆技術將適當的啟動子同合適的磷酸核糖焦磷酸合成酶1 DNA序列和聚腺苷酸化信號相融合而得到。
本發明的主題也涉及編碼磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因的，以及依據DNA序列的總長度與SEQ-ID No.1，SEQ-ID No.3和SEQ-ID No.5具有40～100％同源性的功能上等價DNA序列的用途。
本發明的優選主題涉及編碼磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因的，以及依據DNA序列的總長度與SEQ-ID No.1，SEQ-ID No.3和SEQ-ID No.5具有60～100％同源性的功能上等價DNA序列的用途。
本發明的特別優選主題涉及編碼磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因的，以及依據DNA序列的總長度與SEQ-ID No.1，SEQ-ID No.3和SEQ-ID No.5具有80～100％同源性的功能上等價DNA序列的用途。
按照本發明，編碼磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因的功能上等價序列是保持有期望功能的(不論是否是衍生核苷酸序列)那些序列。因而，功能等價物包括此處所描述的序列的天然變體，也包括人工的核苷酸序列，例如通過化學合成并經改造過以適應植物密碼子使用的人工核苷酸序列。
功能等價物也應理解為尤其是指編碼磷酸核糖焦磷酸合成酶1并一直表現出期望功能的原始分離序列的天然或人工突變體。突變包括一個或多個核苷酸殘基的替代、添加、缺失、交換或者插入。因此，例如本發明也擴展至通過修飾核苷酸序列而得到的那些核苷酸序列。例如，此類修飾的目的可以是進一步界定包含在其中的編碼序列或引入其它的限制性酶切位點。
功能等價物也指那些與起始基因或起始片段相比較功能降低或增加了的變體。
此外，根據本發明的表達盒也可用于轉化細菌、藍細菌、酵母、絲狀真菌和藻類以產生足夠數量的磷酸核糖焦磷酸合成酶1。
本發明的另一個主題涉及煙草或擬南芥蛋白質，所述蛋白質的特征在于具有SEQ-ID No.2和SEQ-ID No.4的氨基酸序列，或者該蛋白質的具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的衍生物或部分，在建立鑒定具有除草劑活性的化合物的檢測系統中的用途。
本發明的主題也涉及具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的植物蛋白質的用途，所述蛋白質在氨基酸序列上與具有SEQ-ID No.2、SEQ-ID No.4或SEQ-ID No.6序列的煙草、擬南芥或展葉劍葉蘚磷酸核糖焦磷酸合成酶1有20～100％一致性，所述用途是指用以建立鑒定具除草劑活性的化合物的檢測系統。
優選地，還涉及具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的植物蛋白質的用途，所述蛋白質在氨基酸序列上與具有SEQ-ID No.2、SEQ-ID No.4或SEQ-ID No.6序列的煙草、擬南芥或展葉劍葉蘚磷酸核糖焦磷酸合成酶1有50～100％一致性，所述用途是指用以建立鑒定具除草劑活性的化合物的檢測系統。
特別優選的是具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的植物蛋白質的用途，所述蛋白質在氨基酸序列上與具有SEQ-ID No.2、SEQ-ID No.4和SEQ-ID No.6序列的煙草、擬南芥或展葉劍葉蘚磷酸核糖焦磷酸合成酶1有80～100％一致性，所述用途是指用以建立鑒定具除草劑活性的化合物的檢測系統。
在植物中，編碼磷酸核糖焦磷酸合成酶1的SEQ-ID No.1或SEQ-IDNo.3基因序列的超量表達導致植物對磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制劑的抗性增高。由此產生的轉基因植物也是本發明的主題。
重組表達的磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因的表達效率可通過，例如體外莖分生組織繁殖或萌芽測試來確定。此外，類型和水平已改變的磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因的表達和其對磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制劑抗性的作用情況，可利用測試植物通過溫室實驗來檢測。
本發明的主題還有用根據本發明的含有SEQ-ID No.1或SEQ-ID No.3 DNA序列的表達盒轉化的、通過額外表達SEQ-ID No.1或SEQ-ID No.3的DNA序列而對磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制劑產生耐受性的轉基因植物，以及此類植物的轉基因細胞、組織、器官和繁殖材料。特別優選的是轉基因農作物，例如大麥、小麥、黑麥、玉米、大豆、水稻、棉花、甜菜、canola、向日葵、亞麻、大麻、馬鈴薯、煙草、番茄、油菜籽、紫花苜蓿、萵苣，以及多種樹木、堅果和葡萄及豆類植物。
特別優選確保靶向質外體、原生質體、液泡、線粒體和內質網的序列，或由于缺少合適的操作性序列而確保表達產物保留在其形成的區室即細胞質中(Kermode，植物科學重要綜述(Crit.Rev.Plant Sci).15，4(1996)，285-423)的序列。
例如，植物表達盒可以整合入植物轉化載體pBinAR之中。
原則上，表達盒的合適啟動子可以是能夠控制外源基因在植物中表達的任何啟動子。優選使用尤其是植物啟動子或來源自植物病毒的啟動子。尤其優選的是使用花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子(Frank等人，細胞(Cell)21(1980)，285-294)。該啟動子包含有不同的轉錄效應因子識別序列，它們作為整體導致所導入基因的永久和組成型表達(Benfey等人，歐洲分子生物學雜志(EMBOJ.)，8(1989)，2195-2202)。
表達盒也可包含使外源磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因在植物中可以受控在特定時間點表達的化學誘導型啟動子。在文獻中描述過的和可以使用的這樣的啟動子有，尤其是PRP1啟動子(Ward等人，植物分子生物學，22(1993)，361-366)、水楊酸誘導型啟動子(WO95/19443)、苯磺胺誘導型啟動子(EP 388186)、四環素誘導型啟動子(Gatz等人，植物雜志(PlantJ.)，2(1992)，397-404)、脫落酸誘導型啟動子(EP 0335528)，或者乙醇或環己酮誘導型啟動子(WO93/21334)。
特別優選的啟動子還有那些確保表達發生在嘌呤或其前體進行生物合成的植物組織或器官中的啟動子。特別要提到的是那些確保葉特異性表達的啟動子。必須提到的啟動子是馬鈴薯胞質FBPase或馬鈴薯ST-LSI的啟動子(Stockhaus等人，歐洲分子生物學雜志，8(1989)，2445-245)。
在種子特異性啟動子的作用下，外源蛋白質可在轉基因煙草種子中穩定表達，直至占到種子全部可溶性蛋白質的0.67％(Fiedler和Conrad，生物工程技術(Bio/Technology)，10(1995)，1090-1094)。因此，根據本發明的表達盒可包含，例如，種子特異性啟動子(優選地，phasolin啟動子，USP啟動子或LEB4啟動子)，LEB4信號肽，待表達的基因和ER駐留信號(retention signal)。
編碼磷酸核糖焦磷酸合成酶1的插入核苷酸序列可以通過合成產生，或者取自天然序列，或者是包含合成的或天然的DNA成分的混合序列。一般來講，使用植物優選的密碼子來制備合成的核苷酸序列。植物優選使用的密碼子可通過研究在最感興趣的植物品種中具有最高表達頻率的蛋白質所使用的密碼子來確定。當制備表達盒時，可能需要操作多種DNA片段以獲得可在正確方向上順利閱讀和按正確讀碼框架拼接的核苷酸序列。為了將這些DNA片段彼此互相連接起來，可向片段增加銜接子或接頭。
其他合適的DNA序列是人工DNA序列，只要它們能造成期望的表達磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因的性質即可。此類人工DNA序列可通過，例如，從具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的蛋白質反翻譯來確定，或者它們可通過體外篩選而得出。特別合適的是按照宿主植物特異性密碼子使用反翻譯多肽序列所獲得的編碼DNA序列。特異性密碼子使用可容易地由熟悉植物遺傳學方法的技術人員利用計算機評價待轉化植物的其它已知基因而確定。
必須提到的根據本發明的其它合適的等價核苷酸序列是編碼融合蛋白質的序列，該融合蛋白質的組成成分是植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1多肽或者其功能上等價的部分。融合蛋白質的第二部分可以是，例如，具有酶活性的其它多肽、或者抗原性多肽的序列，在其幫助下可以檢測磷酸核糖焦磷酸合成酶1的表達情況(例如myc標簽或者His標簽)。但是，優選的是調節蛋白質序列，例如是可將磷酸核糖焦磷酸合成酶1蛋白質引導到期望的作用位點的信號或轉運肽。
有利地啟動子和終止子區域應當在轉錄的方向上裝備有包含1個或多個限制性位點的接頭或多接頭以便插入該序列。通常，接頭有1至10，大部分是1至8，優選地是2至6個限制性位點。一般來講，位于調節區域中間的接頭大小小于100bp，常常小于60bp，但至少有5bp。根據本發明的啟動子可以是宿主植物自身的，或者同源的，或者外來的，或者異種的啟動子。根據本發明，表達盒按5’-3’轉錄方向包含依照本發明的啟動子，任何序列和轉錄終止區。多種終止區可根據需要互相調換。
還可以進行提供適當限制性裂解位點或去除多余DNA或限制性裂解位點的操作。當適合出現插入、缺失或替代，例如轉換或顛換時，可以使用體外誘變、引物修復、限制性酶切或連接技術。在適當操作，例如限制性酶切、削平或補平粘性末端以產生平端的情況下可產生片段的互補末端以供連接。
優選的聚腺苷酸化信號是植物聚腺苷酸化信號，優選的是與根瘤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA聚腺苷酸化信號基本上符合的，特別是與Ti質粒pTiACH5的T-DNA的基因3(章魚堿合成酶)(Gielen等人，歐洲分子生物學雜志，3(1984)，835)聚腺苷酸化信號基本上符合的那些，或者其功能等價物。
為了利用編碼磷酸核糖焦磷酸合成酶1的DNA轉化宿主植物，將根據本發明的表達盒作為插入片段整合到重組載體中，所述載體DNA上包含其它功能調節信號，例如復制和整合所需的序列。適當的載體在，尤其是“植物分子生物學和生物工程技術方法(Methods in Plant MolecularBiology and Biotechnology)”(CRC出版社，第6/7章，71-119)一書中得到描述。
轉移外來基因到植物的基因組中術語稱為轉化。其利用以上描述的轉化和從植物的組織或植物細胞再生植物的方法進行瞬時或穩定轉化。適當的方法是利用聚乙二醇誘導的DNA攝入所進行的原生質體轉化，利用基因槍進行的生物轟擊方法、電穿孔、在含有DNA的溶液里浸泡干胚芽、微注射和農桿菌介導的基因轉移。上述提到的方法在，例如，B.Jenes等人，基因轉移技術，見轉基因植物(Transgenic Plants)，第一卷，工程化和應用，S.D.Kung和R.Wu主編，Academic Press(1993)，128-143，和Potrykus，植物生理學和植物分子生物學綜述年鑒(Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mole.Biol.)，42(1991)，205-225，中得到描述。優選地，將要表達的構建體克隆入適合轉化根瘤農桿菌的載體，例如pBin19中(Bevan等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.)，12(1984)，8711)。
同樣地，以根據本發明的表達盒轉化的農桿菌可按已知方式用于轉化植物，尤其是農作物例如谷類作物、玉米、大豆、水稻、棉花、甜菜、canola、向日葵、亞麻、大麻、馬鈴薯、煙草、番茄、油菜籽、紫花苜蓿、萵苣，以及多種樹木、堅果和葡萄及豆類植物，方式有例如通過將采下的葉片或葉的切片浸泡在農桿菌懸液中并接下來在合適的培養基中培養。
嘌呤的生物合成位點通常是葉組織，因此磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因在葉中特異性表達是有意義的。然而，很明顯嘌呤生物合成不一定限制在葉組織，也可在植物所有其余部分中以組織特異性的方式發生，例如在富含脂肪的種子中。
此外，組成型表達外源性的磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因是有益的。另一方面，也可能希望進行誘導型表達。
使用以上引用的重組和克隆技術，可以將根據本發明的表達盒克隆入適當的載體中，所述載體能夠使它們例如在大腸桿菌中擴增。適當的表達載體為，尤其是pBR332、pUC系列、M13mp系列和pACYC184。特別適合的載體為二元載體，其能夠在大腸桿菌和農桿菌兩者中復制。
本發明的另一主題涉及依據本發明的表達盒在轉化植物、植物細胞、植物組織或植物器官中的用途。該用途的優選目的是增加植物中磷酸核糖焦磷酸合成酶1的含量。
根據所選擇的啟動子，表達可特異性地發生在葉，種子或植物的其它部分。這樣的轉基因植物和它們的繁殖材料和它們的植物細胞、植物組織或植物器官是本發明的另一主題。
現在將通過下面的實施例來舉例說明本發明，實施例并不能限制本發明。
實施例所依據的重組方法普通克隆方法克隆方法，例如限制性酶切、DNA分離、瓊脂糖凝膠電泳、DNA片段純化、轉移核酸至硝酸纖維素或尼龍膜、DNA片段連接、轉化大腸桿菌細胞、細菌培養和重組DNA的序列分析按照Sambrook等人，冷泉港實驗室出版社(1989)；ISBN 0-87969-309-6所描述的方法進行操作。轉化根瘤農桿菌參照Hfgen和Willmtzer(核酸研究，16(1988)，9877)的方法進行操作。農桿菌使用YEB培養基培養(Vervliet等人，普通病毒學(Gen.Virol.)，26(1975)，33)。
重組DNA的序列分析重組DNA分子使用ABI激光熒光測序儀，按照Sanger法(Sanger等人，美國國家科學院學報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，74(1977)，5463-5467)進行測序。對多聚酶鏈式反應的片段進行了序列測定和檢查以避免在將要表達的構建體中有聚合酶引入的錯誤。
植物組織中總RNA的分析植物總RNA依照Logemann等人的方法，分析生物化學(AnalyticalBiochem.)，163(1987)，16)分離并利用含有甲醛的瓊脂糖凝膠分開(Lehrach等人，生物化學(Biochem.)16(1977)，4743)。在20×SSC(1.5M氯化鈉，150mM檸檬酸鈉)中毛細作用過夜轉移至尼龍膜(GeneScreen，NEN)。在雜交緩沖液(500mM磷酸鈉(pH7.2)，7％SDS，0.5％牛血清白蛋白，1mM EDTA)中預雜交2小時后，使用放射性標記的NtPrs1探針在65℃雜交16小時。然后，在下列條件下洗滌65℃下6×SSC，0.1％SDS中10分鐘，65℃下4×SSC，0.1％SDS中5分鐘。
除非有其它說明，使用的都是購自Fluka(Neu-Ulm)、Merck(Darmstadt)、Roth(Karlsruhe)、Serva(Heidelberg)和Sigma(Deisenhofen)公司的分析純級化學試劑。溶液使用由Milli-Q水純化系統(Millipore，Eschborn)制備的純化無致熱原的水，以下稱為H2O，配制。限制性內切酶、DNA修飾酶和分子生物學試劑盒購自AGS(Heidelberg)、Amersham(Braunschweig)、Biometra(Gttingen)、Roche(Mannheim)、Genomed(Bad Oeynnhausen)、New England Biolabs(Schwalbach/Taunus)、Novagen(Madison，Wisconsin，USA)、Perkin-Elmer(Weiterstadt)、Pharmacia(Freiburg)、Qiagen(Hilden)和Stratagene(Freiburg)。除非有其它說明，試劑均按生產廠商的說明書使用。
大腸桿菌菌株(XL-1 Blue)購自Stratagene。轉化植物使用的農桿菌菌株(含有質粒pGV3850kan的C58C1)參見Debleare等人，核酸研究，13(1985)，4777)所描述。
利用此克隆篩選克隆入λZAPII的枯斑三生煙的葉cDNA文庫。該cDNA文庫以2.5×105噬斑形成單位的滴度鋪平板并利用噬斑篩選方法進行分析(T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，NY 1989)。分離到12個噬菌體群并用于進行第二輪篩選，結果分離得到遺傳學上一致的噬菌體群用于體內切除。內切酶分析在不同的cDNA克隆間未見任何差別，挑選具有最大插入片段的4個克隆進行序列測定。序列資料顯示它們是編碼5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶的cDNA克隆。
cDNA克隆NtPrs1-參見SEQ-ID No.1-全長1251bp，在第21位有起始密碼子，第1089位有終止密碼子TAG。開放閱讀框架編碼包含356個氨基酸且分子量38.3kD的蛋白質。152bp的3’非翻譯區沒有聚腺苷酸化信號。在分析從cDNA克隆NtPrs1推導出的蛋白質序列-參見SEQ-IDNo.2-時，計算機分析在最初的36個氨基酸內鑒定出了葉綠體轉運肽。
如

圖1所示，cDNA文庫的構建包括提供具EcoR I/Not I接頭的各片段，然后將它們克隆入pBluescript多接頭的EcoR I限制性位點。因此，Not I切割位點不是pBluescript的原始成分。
A 質粒pBluescript SK的多克隆位點B NtPrs1 cDNA 1251bpC 質粒pBluescript SK的多克隆位點圖2顯示了在煙草中以反義方向表達NtPrs1 cDNA(1226bp)的表達盒。
A花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子，529bp，CaMV的6909至7437位核苷酸。
B自質粒pBluescript SK-NtPrs1作為BamH I片段分離的反義方向的NtPrs1 cDNA(1226bp)，包括NtPrs1編碼區1-1208位的堿基。
CTi質粒pTiACH5的T-DNA基因3(章魚堿合成酶，OCS)的聚腺苷酸化信號(192bp)。
此資料建立了降低的磷酸核糖焦磷酸合成酶1表達和煙草降低的生長之間的直接關系，因此證明磷酸核糖焦磷酸合成酶1可作為具除草作用的活性成分的合適靶標蛋白質。
接下來雜交信號通過磷光影像分析儀(phospho-imager)進行定量。與植物的表現型一致，在45-1株中NtPrs1合成酶mRNA的轉錄本積累顯著地降低了。植株33.4、14.5和30.4僅僅顯示mRNA轉錄本積累降低了，以及類似地，較不太明顯的生長表型。
為了產生cDNA文庫，從自生長9天的原絲體所提取的PolyA+ RNA起始，使用鼠白血病病毒反轉錄酶(Roche，Mannheim，德國)和Oligo-d(T)引物，進行第一鏈的合成。通過與DNA聚合酶I，Klenow酶，RNaseH在12℃(2小時)，16℃(1小時)，22℃(1小時)孵備進行第二鏈的合成。65℃作用(10分鐘)后終止反應并移至冰上。利用T4 DNA聚合酶(Roche，Mannheim)在37℃(30分鐘)作用補平雙鏈DNA，核苷酸通過酚/氯仿抽提去除然后經Sephadex G50層析。EcoR I銜接子(Pharmacia，Freiburg，德國)通過T4 DNA連接酶(Roche，12℃，16小時)連接到cDNA末端，進而利用多核苷酸激酶(Roche，37℃，30分鐘)進行磷酸化。DNA片段通過凝膠電泳得到分離，大于300堿基對的片段利用酚抽提進行分離并經Elutip-D柱(Schleicher和Schuell，Dassel，德國)得到濃縮。使用Gigapack Gold試劑盒(Stratagene，Amsterdam，荷蘭)按照廠家說明書操作將所得的雙鏈DNA連接入λZAPII。體內切除產生用于轉化大腸桿菌菌株XL-1 Blue的質粒DNA。來自單菌落的克隆利用液體培養基進行培養，提取質粒DNA用于測序反應。通過同源性比較，鑒定出編碼5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶的EST片段，見SEQ-ID No.5。
在細胞于裂解緩沖液(50mM磷酸二氫鈉，300mM氯化鈉，pH7.8)中超聲裂解后，使用18μg總蛋白質。按照生產廠商的說明(Qiagen)，利用由載體引入的His標簽可經親和色譜法進行進一步的純化。可利用PD-10柱(Pharmacia)和標準的濃縮方法，例如硫酸銨沉淀法更換蛋白質的緩沖液。所測量的是NADH在340nm處光吸收值的降低。結果表明，蛹蟲草菌素5′-三磷酸(其它高等真核生物的5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶抑制劑)也可以抑制植物5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶1的酶活性。
序列表<110>巴斯福股份公司<120>磷酸核糖焦磷酸合成酶1作為除草劑的靶標<130>BASF-OZ-0050/51207 PCT<140><141><160>6<170>PatentIn Vers. 2.0<210>1<211>1251<212>DNA<213>煙草<220><221>CDS<222>(22)..(1089)<400>1gcatccctct ctcttctcca c atg gca tct tta gct cta cct gga agc ttt51Met Ala Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ser Phe1 5 10tta gct acc agc aaa cct agt cct tgt aga tat gct gcc gga gac tca99Leu Ala Thr Ser Lys Pro Ser Pro Cys Arg Tyr Ala Ala Gly Asp Ser
15 20 25att gta aga tgt aat gtg gca gaa cca tta agt ttt aac aag gag aat147Ile Val Arg cys Asn Val Ala Glu Pro Leu Ser Phe Asn Lys Glu Asn30 35 40ggg aga tca aac atg cct ctt cag att aat ggc gac act tca ttt aac195Gly Arg Ser Asn Met Pro Leu Gln Ile Asn Gly Asp Thr Ser Phe Asn45 50 55aat ctt tgg aac gct aat caa gta aga aga ttt cca gtt cca cat gct243Asn Leu Trp Asn Ala Asn Gln Val Arg Arg Phe Pro Val Pro His Ala60 65 70cag att gat act aga ctc cgc att ttc tcc ggc act gcc aat cct gca291Gln Ile Asp Thr Arg Leu Arg Ile Phe Ser Gly Thr Ala Asn Pro Ala75 80 85 90ctt tct cag gaa ata gct tgc tac atg ggt ttg gaa ctt gga aag ata339Leu Ser G1n Glu Ile Ala Cys Tyr Met Gly Leu Glu Leu Gly Lys Ile95 100 105atg ata aaa cgt ttt gct gat ggc gaa atc tat gtc cag tta caa gag387Met Ile Lys Arg Phe Ala Asp Gly Glu Ile Tyr Val Gln Leu Gln Glu110 115 120agt gtt agg ggt tgt gat gta tat ctt gtc caa cct acg tgt ctc ctg435Ser Val Arg Gly Cys Asp Val Tyr Leu Val Gln Pro Thr Cys Leu Leu125 130 135cta atg aaa tct gat gga ctc ttg ata atg att gat gct tgc cgt aga483Leu Met Lys Ser Asp Gly Leu Leu Ile Met Ile Asp Ala Cys Arg Arg140 145 150gcc tca gcc aaa aat att act gca gtg att ccg tac ttt ggg tat gcc531Ala Ser Ala Lys Asn Ile Thr Ala Val Ile Pro Tyr Phe Gly Tyr Ala155 160 165 170cgt gct gat cgt aag act caa ggt cgt gaa tcg att gct gcc aaa ctt579Arg Ala Asp Arg Lys Thr Gln Gly Arg Glu Ser Ile Ala Ala Lys Leu175 180 185gta gca aac ctg att aca gaa gct ggt gca gat cga gtt ctt gct tgt627Val Ala Asn Leu Ile Thr Glu Ala Gly Ala Asp Arg Val Leu Ala Cys190 195 200gat ctt cat tct ggc cag tca atg ggt tac ttt gat att cca gtg gat675Asp Leu His Ser Gly Gln Ser Met Gly Tyr Phe Asp Ile Pro Val Asp205 210 215cat gta cat ggc cag cct gtc ata ctt gat tac ctt gcc agc aag act723His Val His Gly Gln Pro Val Ile Leu Asp Tyr Leu Ala Ser Lys Thr220 225 230atc tgc tct gat gat cta gtt gtg gta tct ccg gat gtt ggt ggg gtt771Ile Cys Ser Asp Asp Leu Val Val Val Ser Pro Asp Val Gly Gly Val235 240 245 250gca agg gca aga gct ttt gcc aaa aag tta tct gat gca cct cta gct819Ala Arg Ala Arg Ala Phe Ala Lys Lys Leu Ser Asp Ala Pro Leu Ala255 260 265att gtg gat aaa agg cgt cat ggg cac aat gtt gct gag gta atg aat867Ile Val Asp Lys Arg Arg His Gly His Asn Val Ala Glu Val Met Asn270 275 280ttg att ggc gat gtt agg gga aaa gtg gca gtt atg gtt gat gac atg915Leu Ile Gly Asp Val Arg Gly Lys Val Ala Val Met Val Asp Asp Met285 290 295att gat acg gct ggt act att gca aaa gga gct gcc ctt tta cat caa963Ile Asp Thr Ala Gly Thr Ile Ala Lys Gly Ala Ala Leu Leu His Gln300 305 310gga gcc agg gaa gtt tat gca tgc acc act cat gca gtt ttc agg gcg1011Gly Ala Arg Glu Val Tyr Ala Cys Thr Thr His Ala Val Phe Arg Ala315 320 325 330gct ttg agc ctt act ccg gat tgg gaa ttg att agt cct tcc tgt tca1059Ala Leu Ser Leu Thr Pro Asp Trp Glu Leu Ile Ser Pro Ser Cys Ser335 340 345ttg ctt gtt ttg aca ctg ttg tct gga act tgaagcagta tgttgatcag 1109Leu Leu Val Leu Thr Leu Leu Ser Gly Thr350 355atccaccaaa attttcgtcc agtaacaaag agagcatttt ctgttgtaca aatattttgt 1169gcggaatgtt acgttgtaaa tctttcaatc agtgacttgg atccatgtag tagatgagtt 1229ttttgattaa tatgaagttt ac 1251<210>2<211>356<212>PRT<213>煙草<400>2Met Ala Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ser Phe Leu Ala Thr Ser Lys Pro1 5 10 15Ser Pro Cys Arg Tyr Ala Ala Gly Asp Ser Ile Val Arg Cys Asn Val20 25 30Ala Glu Pro Leu Ser Phe Asn Lys Glu Asn Gly Arg Ser Asn Met Pro35 40 45Leu Gln Ile Asn Gly Asp Thr Ser Phe Asn Asn Leu Trp Asn Ala Asn50 55 60Gln Val Arg Arg Phe Pro Val Pro His Ala Gln Ile Asp Thr Arg Leu65 70 75 80Arg Ile Phe Ser Gly Thr Ala Asn Pro Ala Leu Ser Gln Glu Ile Ala85 90 95Cys Tyr Met Gly Leu Glu Leu Gly Lys Ile Met Ile Lys Arg Phe Ala100 105 110Asp Gly Glu Ile Tyr Val Gln Leu Gln Glu Ser Val Arg Gly Cys Asp115 120 125Val Tyr Leu Val Gln Pro Thr Cys Leu Leu Leu Met Lys Ser Asp Gly
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1.具有植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1編碼區的DNA序列SEQ-ID No.1、SEQ-ID No.3或SEQ-ID No.5在制備鑒定植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制劑的檢測系統中的用途。
2.權利要求1的DNA序列的用途，所述DNA序列可與SEQ-ID No.1、SEQ-ID No.3或SEQ-ID No.5DNA序列或者其部分序列、或者通過對所述的序列進行插入、缺失或替代產生的并編碼具有植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1生物活性的蛋白質的衍生物雜交。
3.權利要求1或2的DNA序列在導入原核或真核細胞中的用途，此序列任選地同控制元件相連接，該控制元件可確保在細胞中的轉錄和翻譯并導致造成植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1合成的可翻譯mRNA表達。
4.具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的蛋白質在制備用于鑒定抑制植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1的物質的檢測系統中的用途。
5.權利要求4的具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的蛋白質的用途，其中蛋白質包含如SEQ-ID No.2、SEQ-ID No.4或SEQ-ID No.6所示的氨基酸序列。
6.權利要求5的具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的蛋白質的用途，其中蛋白質包含SEQ-ID No.2或SEQ-ID No.4的至少100個氨基酸的氨基酸亞序列。
7.用于鑒定抑制植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的物質的方法，其包括，第一步，使用權利要求1、2或3中所提出的DNA序列產生磷酸核糖焦磷酸合成酶1，和第二步，在測試物質的存在下檢測植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性。
8.權利要求7的方法，其中植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1通過高通量篩選(HTS)步驟來測定。
9.鑒定可抑制植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1的具除草作用的活性物質的方法，該方法包括a)產生轉基因植物、植物組織或植物細胞，其包含有編碼具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的酶的額外DNA序列，并且能夠超量表達具有酶活性的磷酸核糖焦磷酸合成酶1；b)對轉基因植物、植物細胞、植物組織或植物器官和未轉化的植物、植物細胞、植物組織或植物器官使用一種物質；c)在使用該化學物質之后，確定轉基因和未轉化的植物、植物細胞、植物組織或者植物器官的生長或者存活能力；以及d)比較在使用該化學物質之后，轉基因和未轉化的植物、植物細胞、植物組織或者植物器官的生長或者存活能力；當未轉化植物、植物細胞、植物組織或者植物器官的生長或者存活能力受到抑制，但是轉基因植物、植物細胞、植物組織或者植物器官的生長或者存活能力基本上不受抑制時，證實b)中的物質具有除草劑活性并可抑制植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1的酶活性。
10.一種檢測系統，其基于權利要求1、2或3所述的SEQ-ID No.1、SEQ-ID No.3或SEQ-ID No.5或者其部分、或者衍生物的DNA序列的表達，用于鑒定植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制劑。
11.權利要求10的用于鑒定植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制劑的檢測系統，其包括將酶同待研究的測試物質一起孵育，在適當的反應時間后，測定酶的酶活性并同未受抑制的酶的活性相比較。
12.植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制劑。
13.使用權利要求10或11的檢測系統鑒定出的植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制劑。
14.權利要求12或13之一的用做除草劑的抑制劑。
全文摘要
本發明涉及植物來源的編碼具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1(E.C.2.7.6.1)活性的多肽的DNA序列在制備鑒定磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制劑的檢測系統中的用途。通過使用反義技術，本發明首次證明磷酸核糖焦磷酸合成酶1是除草劑的靶標。
文檔編號C12Q1/25GK1426480SQ01805753
公開日2003年6月25日 申請日期2001年1月30日 優先權日2000年2月28日
發明者A·賴因德, J·萊爾希爾, U·蘇恩瓦德, R·巴杜拉, R·博爾迪特 申請人:巴斯福股份公司