專利名稱：硒納豆酶及其制備方法
技術領域：
本發明涉及硒納豆酶及其制備方法。更具體地說，涉及用Bacillus subtilis Natto接種硒大豆，通過發酵得到硒納豆酶。
納豆是日本的傳統食品，它通過將大豆蒸煮后發酵而得到。由于納豆是用對人體有益的菌株發酵而得到的，因此，它富含各種對人體有益的成分，是一種醫食同源的食品，長期以來，在日本一直作為民間傳統的高級營養品。從納豆中提取出來的納豆激酶(Nattokinase，NK)是一種安全性極好的高效價的纖維蛋白溶解酶，目前已作為口服、注射同樣有效的溶栓劑使用。納豆酶主要通過溶解血栓中的纖維蛋白，間接增加t-PA活性，以及激活尿激酶原(pro-UK)活性，使之轉化為尿激酶等途徑，進行血栓性疾病的治療。

發明內容
本發明的目的是，提供一種能降低無機硒毒性和擴大納豆酶應用范圍的的硒與納豆酶的復合體。即，用生物轉化合成法，通過生物的滲透、加合、吸收等轉化合成步驟，將已知具有抗癌、抗氧化活性的硒(Selenium)元素(羅海吉等，硒的生物學作用及其意義，微量元素與健康研究，第17卷第2期第70頁，2000年)接入納豆酶體，使其成為富硒酶體。
即，本發明提供一種制備硒納豆酶的方法，該方法包括以下步驟
(1)將大豆在硒源液中浸漬，蒸煮后得到硒大豆；(2)將Bacillus Subtilis Natto菌株接種于上述硒大豆進行發酵。
在本發明的方法中，可直接使用未經馴化的Bacillus Subtilis Natto菌株，但本發明者發現，將Bacillus Subtilis Natto用硒進行馴化培養后使用，菌苔的形態更好，菌數更多。
在本發明的方法中，即可以采用固體發酵法將硒大豆發酵，也可以采用液體發酵法進行發酵。但采用液體發酵法，可以使菌絲物在液體中析出，從而可得到純度更高的硒納豆酶。
此外，在本發明的方法的較佳實施方式中，所用硒源為亞硒酸鈉。
本發明還提供用上述制備方法得到的硒納豆酶。
由于納豆酶接入了硒元素，成為富集硒元素的硒酶復合物，因而可發揮硒酶的協同作用。而且，將硒元素接入酶體，使無機硒得以變成了生物硒。已知生物硒與無機硒相比，其吸收率和生物利用率會顯著提高，并可大大降低其原來的毒性(徐承水，微量元素與疾病，微量元素與健康研究，第16卷第4期第64頁，1999年；陳小霞等，藻類對微量元素的生物富集及其機理探討，食品與發酵工業，第25卷第4期第56頁，1999年)。同時將硒元素接入納豆酶中也擴大了納豆酶的治病防病的應用范圍，具有一藥多用的特點。和納豆酶一樣，硒納豆酶(Selem′Nattokinase，SNK)具有注射、口服同等有效、半衰期長(8天)的優點，且無毒副作用。
具體實施例方式
下面就本發明的上述各步驟中的具體操作作詳細說明。
首先，對菌種進行馴化。具體操作如下(1)菌苔的培養將由中國科學院北京微生物研究所購得的Bacillus SubtilisNatto(ASI.1086)用滅菌生理水溶解，接種于下述Bpy培養基中，在37℃斜面培養24-48小時。Bpy培養基牛肉膏 5克 葡萄糖5克酵母膏 5克瓊脂 10-20克蛋白胨 10克 去離子水 添加至1000mL氯化鈉 5克pH 7.0-7.6(2)移種取斜面菌苔，接種于硒源培養基中，在37℃孵育12-18小時，進行菌種馴化，由此得到第一代菌種。上述硒源培養基通過在標準硒液1.0ml中添加上述Bpy培養基至總體積為1000ml而制得。
(3)母發酵劑的接種取上述第一代菌管菌苔，種于下述母發酵劑，混勻，在37℃孵育24-48小時。母發酵劑牛肉膏5克 木糖5克酵母膏5克 標準硒液1.0ml大豆蛋白胨10克 去離子水添加至1000mL氯化鈉5克 pH 7.0-7.6(4)子發酵劑的接種在Bacillus Subtilis Natto的生長達到對數期中段之前(此時，Bacillus Subtilis Natto菌苔的形態比較整齊、規則)，取母發酵劑的培養物，按5％的量移種于其組成與上述母發酵劑相同的子發酵劑，混勻，在37℃孵育18-30小時。由此得到可用于硒大豆發酵的含有Bacillus Subtilis Natto的發酵劑。將其置于0℃以下的冰箱中待用。
用過篩法選取粒徑為6.0-6.5mm的小粒豆，去除砂石、鐵屑等異物，并剔除有破損或霉爛、有斑點的豆粒。
然后，將精選過的大豆于18-26℃在相當于大豆重量的1/2的標準硒液(標準硒液的配制將亞硒酸鈉溶解在水中，使硒濃度為100mg/L)中浸漬，直至浸漬液被吸干為止。然后再添加與大豆相同重量的標準硒液，繼續在18-26℃浸漬，通常當繼續浸漬約2.5-3.5小時后，浸漬液幾乎被吸干，豆體膨脹、有軟感且稍有裂隙，豆體的硒離子與水溶液水溶液中的硒離子達到平衡。此時終止浸漬。
將通過上述步驟而得到的硒大豆放入高壓釜中，在110℃、0.1-0.11MPa的高壓蒸氣中蒸煮、滅菌30分鐘。然后取出豆粒，使其冷卻至約40-50℃以下后，用噴霧法將上述含有Bacillus Subtilis Natto的發酵劑噴灑在硒大豆表面，迅即混勻，置于恒溫箱中，在溫度為30-34℃、pH為5-8、相對濕度為60-85％、氧容量＞70％、高峰＜50℃的條件下固體發酵。通常反應進行約18-25小時后，BacillusSubtilis Natto的生長達到對數期中段，有明顯的粘絲物形成。此時中斷反應，并迅即降溫。
然后，通過高壓粉碎、凍干、調理、制粉等步驟，得到富含硒納豆酶(纖溶酶)的粉劑。
在液體發酵中，發酵后篩除豆粒，將液體減壓濃縮、凍干，可得到純度更高的硒納豆酶粉末。對硒納豆酶粉劑的纖溶活性的定性鑒定參照Arch.Biochem.Biophys.，1957，40346和Biochem.Biophys.Acta.，1957，24279-82，用纖維蛋白平板法對硒納豆酶粉劑的纖溶活性進行定性鑒定。即，將上述硒納豆酶粉劑用Tris緩沖液作適當稀釋，加到1滴人血形成的血凝塊的試管內。加入了上述硒納豆酶樣品的血凝塊在60分鐘內全溶，而加入了作為對照的生理鹽水的血凝塊不溶。對硒納豆酶粉劑的纖溶活性的定量鑒定參照Arch.Biochem.Biophys.，1957，40346和Biochem.Biophys.Acta.，1957，24279-82，用纖維蛋白平板法對硒納豆酶粉劑的纖溶活性進行定量鑒定。即，測活平板含有纖維蛋白原、凝血酶和瓊脂糖。將其在玻璃平皿中快速混合，放于水平位置，使其凝固，形成約1.5mm厚的纖維蛋白板。將上述硒納豆酶粉劑用Tris緩沖液稀釋后，點樣10μL于標定圓孔中，另以同樣方法用尿激酶(UK)作對照。在37℃孵育箱中放置18小時。取出測定纖維蛋白溶解面積，求出硒納豆酶相對于尿激酶的纖溶活性單位(μ)。
在上述硒納豆酶溶纖活性的定性、定量試驗中，使用了不同批次的三批硒納豆酶粉劑作為樣品。具體結果見表1。
表1

用本發明的上述制備方法得到的硒納豆酶系白色粉末，無異味。它是一種富集硒元素的纖維蛋白溶解酶，具有較高的纖溶活性和抗氧化酶活性。它既可作為保健食品，用于預防心腦血栓、腫瘤、衰老、冠心病和動脈粥樣硬化、重金屬(鎘、鉛、銀)中毒及黃曲霉素B1毒性、克山病、大骨節病以及由體內缺硒而引發的其他疾病，通過純化處理后，也可作為藥品用于上述疾病的治療。
本發明的硒納豆酶的制備方法還具有成本低、收益高、操作簡便，易于掌握的優點。
上面是對本發明的具體說明，但這些說明不應認為是對本發明的限定。本領域的技術人員知道，根據上面對本發明的說明，可對本發明的具體實施方式
作各種修改和變更而不偏離本發明的實質和由附具的權利要求書所確定的保護范圍。
權利要求
1.硒納豆酶的制備方法，它包括以下步驟(1)將大豆在硒源液中浸漬，蒸煮后得到硒大豆；(2)將Bacillus Subtilis Natto菌株接種于上述硒大豆進行發酵。
2.如權利要求1所述的制備方法，其中，所述Bacillus Subtilis Natto菌株是用硒馴化培養過的菌株。
3.如權利要求1所述的方法，其中，所用硒源為亞硒酸鈉。
4.硒納豆酶，它是用權利要求1-3中任一項所述的制備方法得到的。
全文摘要
本發明提供一種硒納豆酶的制備方法及用該方法得到的硒納豆酶。本發明的制備方法包括以下步驟(1)將大豆在硒源液中浸漬，蒸煮后得到硒大豆；(2)將Bacillus Subtilis Natto菌株接種于上述硒大豆進行發酵。在本發明的方法中，所用的Bacillus Subtilis Natto菌株是用硒馴化培養過的菌株。本發明的硒納豆酶是一種富集硒元素的硒酶復合物，可發揮硒酶的協同作用。而且，將硒元素接入酶體，可提高硒的吸收率和生物利用率，降低其毒性，并可擴大納豆酶的治病防病的應用范圍。和納豆酶一樣，硒納豆酶(Selem′Nattokinase，SNK)具有注射、口服同等有效、半衰期長(8天)的優點，且無毒副作用。
文檔編號C12N1/20GK1407093SQ0112652
公開日2003年4月2日 申請日期2001年8月22日 優先權日2001年8月22日
發明者李麒 申請人:李麒