專利名稱：海藻糖基水解酶及其制備和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種海藻糖基水解酶及其制備和用途，特別是涉及一種新型嗜酸耐熱海藻糖基水解酶，它能夠在酸性高溫環境下特異性水解非還原性多糖中海藻糖部分和其余糖基部分之間的鍵，所述的非還原性多糖含有海藻糖結構為一個末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高。本發明還涉及能產生所述酶的微生物及該酶的制備，用所述酶得到的海藻糖，及含所述海藻糖的組合物。
已知海藻糖或α，α一海藻糖是一種由葡萄糖單位組成的非還原性多糖。如在Advances in Carbohydrate Chemistry.Academic Press，1993，18201-225和Applied and Environmental Microbiology.1990，563213-3215中描述的那樣，海藻糖廣泛存在于生物界，包括動物、植物和微生物之中均存在此糖，但含量較低。海藻糖是一種非還原二糖，常態下為白色晶體，爽口甘甜且無后味，其甜度為砂糖的45％；因為該糖具有獨特的生物學功能，對多種生物大分子和細胞膜有顯著的保護作用，其用途和潛在作用十分廣泛，可作為生物制品及活菌制劑的保護劑和穩定劑使用，也可在食品及化妝品中用做天然添加劑。因此迫切要求能夠工業化大規模制備海藻糖。
傳統的海藻糖制備方法包括如日本專利公開No.154,485/75中利用酵母提取物的方法及日本專利公開No.216,695/83中報道的用麥芽糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶聯合轉化麥芽糖生成海藻糖的方法。然而，由于前者用作為起始材料的酵母體中，海藻糖的含量通常低于15W/W％(除非特別說明，本說明書中的術語“W/W％”縮寫為“％”)，并且提取和純化步驟復雜，因此不適于工業化生產。后者有下列缺點(I)由于海藻糖是經葡萄糖-1-磷酸形成的，不可能將作為底物的麥芽糖濃度調整到符合要求的高水平(II)磷酸酶的酶反應系統是傳遞反應，而實際生產中很難獲得穩定的連續酶反應系統，因此海藻糖產率比較低，使該方法也不能作為工業化生產方法。
考慮這些因素，大家現在都努力尋找一種利用淀粉水解制備海藻糖的新途徑。結果如日本專利申請No.362,13l,92中公開的，人們發現從土壤中分離的根瘤菌(Rhizobium sp.)M-11(CCTCC M94031)和節桿菌(Arthrobacter sp.)Q36(CCTCC M94030)能產生一種海藻糖基水解酶，在常溫下與能形成具海藻糖末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖的海藻糖基合成酶一起使用，水解淀粉直接生產海藻糖。該海藻糖基水解酶能夠在常溫下水解有海藻糖末端單位且具有3或更高的葡萄糖聚合度的非還原性多糖中，海藻糖部分和其余糖基部分之間的鍵，釋放海藻糖。因此用此海藻糖制備方法，從非還原性淀粉部分水解物生產海藻糖較以前的方法有很大的進步。但由于該方法中微生物培養周期長，產酶水平低，特別是該酶的熱穩定性差，不耐酸，導致生產工藝復雜，糖轉化率低下，生產成本偏高等眾多不利因素，不能適應現代淀粉糖化生產中高溫、高效、高質的需求。這是因為在實際生產中，淀粉水解溫度低于55℃時，極容易染菌造成生產污染；此外反應過程中溶液pH會不斷下降而導致不耐酸的酶類失活，但中性條件下，淀粉又容易老化，形成不溶沉淀，影響生產；這些都是該方法中明顯的不足。為解決這個問題，迫切需要篩選一種新型海藻糖基水解酶，它既能有高的水解活力和理想的熱穩定性，在55℃以上的環境中不失活，也要求具備理想的pH穩定性，特別在酸性條件下，也能具備穩定的酶活力。
為了達到上述目的，本發明人廣泛篩選了能夠生產這種新酶的微生物，所述酶可以在高溫酸性環境中從具有海藻糖結構作為一個末端單位并且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原性多糖中水解釋放海藻糖。結果，我們發現了埃希氏菌屬的微生物菌株(E.coli)MTH-11能夠產生水解具有海藻糖末端結構且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖形成海藻糖的海藻糖基水解酶；我們發現，在高溫酸性條件下在當與同樣耐熱耐酸的海藻糖基合成酶共同使用時，這種新型海藻糖基水解酶能夠以令人滿意的高產率催化水解反應形成海藻糖，而且通過讓這種新型海藻糖基水解酶和海藻糖基合成酶對還原性淀粉部分水解物作用，并回收海藻糖含量相對高的反應混合物，很容易制備海藻糖。我們還發現，與來自埃希氏菌屬的微生物一樣，芽孢桿菌屬、酵母菌的微生物也能夠產生相似的水解具有海藻糖末端結構且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖形成海藻糖的海藻糖基水解酶，對此我們也進行了同樣的研究并完成了本發明。我們同時也研制了含由上述制備方法制備的海藻糖的組合物，如食品、化妝品和藥物，并完成了本發明。
本發明人已將這些微生物分別命名為“大腸桿菌(Escherichia coli)MTH-11”和“酵母菌(Saccharomyces)MTH-8”，并于2000年12月27日保藏于中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center，即CGMCC)(中國，北京，中關村)。保藏號分別為CGMCC No 0526(大腸埃希氏菌，MTH-11)和CGMCC No 0525(酵母菌，MTH-8)。
除上述微生物外，埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬、酵母屬的其它菌株和其突變體；只要能產生本發明的新型嗜酸耐熱海藻糖基水解酶，就適用于本發明，所述的海藻糖基水解酶能夠在高溫酸性條件下特異性水解具有海藻糖結構作為末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖中海藻糖部分和其余糖基部分之間的鍵。
任何營養培養基只要上述微生物能生長于其上，且能產生本發明的海藻糖基水解酶，就可用于本發明例如可隨意使用合成的和天然營養培養基。任何含碳的物質只要它被所述微生物利用，就可作為碳源用于本發明所述碳源的實例是糖類，如葡萄糖，果糖，乳糖，蔗糖，甘露醇，山梨醇，糖蜜，淀粉和淀粉部分水解物；有機酸類如檸檬酸和琥珀酸。可以適當選擇這些碳源在營養培養基中的濃度例如，在用葡萄糖時，從所述微生物生長和繁殖的角度看，優選的濃度通常是10％或更低，最好是1％或更低。可用于本發明的氮源有無機氮化合物，如銨鹽和硝酸鹽；含有機氮的物質，如脲，玉米漿，酪蛋白，蛋白胨，酵母提取物和牛肉膏。可用于本發明的無機鹽有鈣鹽，鎂鹽，鉀鹽，鈉鹽，磷酸鹽及鋅，鐵，銅，鉬和鈷的其它鹽。如果需要，可以添加氨基酸和維生素。
將在本發明中可用的微生物于需氧條件下，通常在4-50℃的范圍，優選的25-45℃的范圍；及pH4-10；優選的pH5-9條件下培養。將在本發明中適用的培養時間調整至比所述微生物生長開始所需的時間更長，優選的是，8-100小時。沒有特別限制營養培養基中溶解氧(DO)的濃度，通常使用0.5-20ppm范圍的DO是令人滿意的。通過控制通氣率，攪拌營養培養基，通氣補充氧，及增加發酵容器的內壓，可將DO濃度保持在該范圍內。該微生物的培養方式可以是分批培養，也可以是連續培養。
在微生物培養完成后，回收本發明的酶。在細胞和無細胞上清液中，都發現具有活性的本發明酶，可將其分別回收并用作粗酶；也可將所得的培養物原封不動地用作粗酶。在本發明中，可以使用傳統的液—固分離方法，以便從培養物中分離細胞。例如，可以將所得的培養物直接離心的方法，以及預涂布濾器將其過濾或通過使用板框濾器或空心纖維的膜過濾分離細胞的方法，可將因此得到的無細胞濾液原封不動地用作酶溶液或在使用前將其濃縮，也可將獲得的細胞直接破碎提取酶液。本發明中可用的濃縮方法如，加熱法，使用硫酸銨的鹽析，使用丙酮和醇的沉淀法，使用如板框濾器和空心纖維膜的濃縮法。
可將無細胞濾液和其濃縮物用于傳統的固定方法。傳統方法的實例是使用離子交換劑的結合法，使用樹脂和膜的共價鍵合吸附法，以及使用高分子量物質的包埋法。可以將從所得培養液中分離的細胞用作粗酶而不需任何進一步的處理或在使用前將其固定。例如，將細胞與藻酸鹽混合，在氯化鈣液中滴所得的混合物，將珠滴膠凝成顆粒，從而固定細胞。可以用聚亞乙基亞胺或戊二醛固定所得的顆粒。可以將由細胞提取的酶制品，作為粗酶溶液使用。通過從細胞中提取本發明的酶，包括用超聲波，使用玻璃珠和氧化鋁的機械破碎，法蘭西壓(Frenchpress)破碎等，使得到的提取物經加熱預處理、離心或膜過濾，從而得到含本發明酶的粗酶澄清溶液。
可以原封不動地使用由此得到的粗酶溶液或在使用前用傳統方法將其純化。例如可以通過粗酶液濃縮、透析，然后用“DEAE-Fast Flow”(一種陰離子交換劑)的陰離子交換柱上層析；用“Phenyl-Sepharose”(一種疏水樹脂)的疏水柱層析；和使用“Sephaeryl S-200”(一種凝膠過濾樹脂)的凝膠過濾層析，從而制備電泳上呈一條帶的純酶制品。
由此得到的本發明海藻糖基水解酶有下列物理化學特性；1.作用特異性水解具有海藻糖結構作為一個末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖中，海藻糖部分和其余糖基部分之間的鍵；2.分子量在十二烷基磺酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)上約55,000到65,000道爾頓；3.等電點(PI)在用兩性電解質的等電點電泳上約5.5到6.6；4.最佳溫度在pH5.5保存30分鐘時，60～85℃；5.最佳pH在65℃保存30分鐘時，5.0～6.0；6.熱穩定性在pH5.5保存60分鐘時，可穩定的溫度為約30～80℃；7.pH穩定性在25℃保存16小時，可穩定的pH為4.0～11.0。
按下列步驟檢測本發明海藻基水解酶的活性將0.1ml酶溶液加到0.4ml 1.25w/w％麥芽三糖基海藻糖(別名α-麥芽四糖基α-葡萄糖苷)的50mm醋酸緩沖液(pH5.5)中，將混合物在75℃培養30分鐘。將所得的反應混合物加到Somogyi銅溶液中進行Somogyi反應，以終止酶反應；然后用Somogyi-Nelson方法確定還原能力。作為對照，在100℃將酶溶液預熱15分鐘以使酶失活，按與上述相似的方法檢測。本發明中將1單位的酶活性定義為在該條件下，每分鐘增加1μmol葡萄糖還原能力所需的酶量。
任何物質只要它是一種含有海藻糖結構作為一個末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖，就可作為本發明酶的底物。所述底物的實例是葡萄糖基海藻糖，麥芽糖基海藻糖，麥芽三糖基海藻糖，麥芽四糖基海藻糖和麥芽五糖基海藻糖，這些糖是由海藻糖基合成酶作用于麥芽三糖，麥芽四糖，麥芽五糖，麥芽六糖和麥芽七糖而形成的。除這些底物外，通過用淀粉酶或酸部分水解淀粉類物質如淀粉、支鏈淀粉和直鏈淀粉而制備的，具有末端海藻糖結構且葡萄糖聚合度為3或更高的低還原性淀粉部分水解物也適用于本發明。
部分水解淀粉的所述淀粉酶的實例是在Handbook of Amyloses andRelated Enzymes(由Pergamon Press；Tokyo，Japan(1988)出版)中公開的α-淀粉酶、麥芽五糖形成淀粉酶和麥芽六糖形成淀粉酶。可以將這些淀粉酶與脫支酶如支鏈淀粉酶和異淀粉酶結合使用。
對在本發明中用作底物的還原性淀粉部分水解物的濃度沒有特別的限制。根據本發明甚至可以在含0.1％或50％底物的溶液中進行酶反應，形成海藻糖。在本發明中也可使用含過量底物的不可溶懸浮物。在本發明酶反應中可用的反應溫度可以是本發明酶不失活的溫度，即最高達約80℃，優選的在55-80℃。在本發明酶反應中可用的反應pH是4.5-8.0，優選在pH5-7。應根據酶反應條件來選擇本發明酶反應所用的時間，通常，當以0.1-100單位/g底物使用本發明的酶時，大約需0.1-100小時。
關于從材料底物制備海藻糖的產率，特別是在由具有相對低DE值又同時具有相對高的葡萄糖聚合度的非還原性淀粉部分水解物制備海藻糖的情況下，本發明的海藻糖制備方法具有提高海藻糖產率的優點，其產率大于用日本專利申請No.362,131/92中公開的制備方法(其中海藻糖基合成酶與葡糖淀粉酶結合使用)所得的產率。本發明的制備方法，其中，海藻糖基合成酶與本發明的海藻糖基水解酶結合使用，可以約70％或更高的產率形成海藻糖，而日本專利申請的制備方法，形成海藻糖的產率只有約30％。
本發明的酶機制如下首先用海藻糖基合成酶將具有相對高的葡萄糖聚合度的還原性淀粉部分水解物轉變成1摩爾具有海藻糖結構作為末端單位的非還原多糖，然后，用本發明的海藻糖基水解酶將所得的非還原多糖水解成1摩爾海藻糖和1摩爾比原材料還原性淀粉部分水解物的葡萄糖聚合度低2的還原性淀粉部分水解物。對于新形成的葡萄糖聚合度為3或更高的還原性淀粉部分水解物，可以將其進一步轉化為有一個海藻糖作為末端單位的非還原多糖，然后，用海藻糖基水解酶轉變成1摩爾的海藻糖和淀粉部分水解物。因此，重復前述海藻糖基合成酶和海藻糖基水解酶的酶反應，可以從1摩爾還原性淀粉部分水解物形成多摩爾的海藻糖分子及非還原性淀粉部分水解物。(如


圖1)在本發明制備方法中，可以同時使用海藻糖基合成酶和本發明的海藻糖基水解酶以作用于葡萄糖聚合度為3或更高的非還原性淀粉部分水解物，或以該順序連續使用這兩種酶作用于非還原性淀粉部分水解物。為了進一步提高海藻糖產率，也可使所得的反應混合物進一步經葡糖淀粉酶的作用。
用常規方法過濾并濃縮由此得到的反應混合物以除去不可溶物質，然后用活性炭將所得的溶液脫色，用H-和OH-形式的離子交換劑脫鹽，進一步濃縮成漿狀產品后，可以隨意地將糖漿產品干燥成粉狀產品。
如果需要，用一種或多種方法，如離子交換柱層析、活性炭或硅膠的柱層析分級分離進行純化；用有機溶劑如乙醇和丙酮分離法；用降解剩余還原多糖的堿處理法等，很容易將粉狀產品加工成高純度的海藻糖產品。
如果需要，按照本發明，可以用淀粉酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶和/或海藻糖酶水解含海藻糖的多糖產品，或用環狀糊精葡聚糖轉移酶和/或葡糖基轉移酶催化的多糖—轉移反應以控制其甜度和還原力并降低其粘度。此外，可以隨意氫化多糖產品將其轉變成糖醇，從而降低其還原力。可以用上述的純化方法，如離子交換柱層析從所得的產品中除去葡萄糖以制備海藻糖含量高的組份。可以很容易將由此得到的組份純化并濃縮成糖漿產品，且根據需要可以進一步將糖漿產品濃縮成過飽和濃液并結晶以得到含水或無水的結晶海藻糖。
在本發明中可用的離子交換柱層析技術包括，在日本專利公開No.23,799/83和72,598/83中公開的使用強酸陽離子交換樹酯的方法。使用這些技術，可以很容易地除去在粗海藻糖產品中所含的伴生糖以得到高海藻糖含量的產品。在這種情況下，可以隨意使用固定床、移動床和半移動方法。
為了制備含水的結晶海藻糖，將約65-90％的海藻糖溶液放在—結晶器中，于95℃或更低，優選10-90℃的范圍內，在存在0.1-20％晶種的情況下，邊攪拌邊逐漸冷卻以得到含有含水結晶海藻糖的糖膏。可以在本發明中使用傳統方法，如分離法、塊粉碎作用、流化床或成粒作用及噴霧干燥法以便從糖膏或晶狀多糖制備含水的結晶海藻糖。
在分離時，使糖膏經籃式離心以便從母液中分離含水的結晶海藻糖，如果需要，用少量冷水噴洗含水結晶海藻糖以促進高純度含水結晶海藻糖的制備。噴霧干燥時，通過從一個高壓泵嘴射具有60-85％濃度，約20-60％結晶度的糖膏，用含約60-100℃不融化所得晶體粉末的熱空氣干燥，邊攪拌所得粉末邊通熱空氣約1-20小時，很容易制備沒有或基本沒有吸濕性的結晶多糖。在塊粉碎作用時，使水分含量為約10-25％且結晶度為約10-60％的糖漿放幾小時或3天以便使全部內含物結晶并固化成塊，粉碎或切割所得的塊，并將所得物干燥，從而很容易地制備沒有或基本沒有吸濕性的結晶多糖。盡管可以通過干燥含水的結晶海藻糖以脫水來制備無水結晶海藻糖，但一般方法是通過將水分含量低于10％的高海藻糖含量溶液置于結晶器中，在攪拌條件下，于50-160℃，優選80-140℃的范圍，添加晶種的情況下處理溶液以得到無水結晶海藻糖的糖膏，在干燥和高溫下將其結晶，用傳統方法如塊粉碎法、流化床成粒法和噴霧干燥將所得的無水結晶海藻糖粉碎，從而制備無水結晶海藻糖。
由此得到的本發明海藻糖是穩定的且基本上沒有還原能力，并可以與其它物質，特別是氨基酸、多肽和蛋白質混合，而不必顧慮引起焦化變質和產生令人討厭的氣味。海藻糖本身有令人滿意的品質和甜度，且容易被體內的海藻糖酶水解，因此口服時能被機體同化，吸收和利用。此外，海藻糖基本上不會被誘發齲齒的微生物發酵，因此這可使其用作防齲齒的甜味劑。
可以將本發明的海藻糖制成藥劑，如用于輸血和管飼法的營養藥劑，可以隨意地將其施用于活體并很容易被活體代謝和利用而不必擔心起毒性和副作用。因此，有利于將這些產品作為用于機體的能量補充劑。
海藻糖是穩定的甜味劑，特別是與粘合劑如支鏈淀粉，羥乙基淀粉或聚乙烯吡咯烷酮結合使用時，晶體海藻糖可隨意被用作片劑的糖包衣劑。另外，海藻糖有許多特性，如控制滲透壓的能力、賦予填料的能力、賦予光澤的能力、保持濕度的能力、賦予粘度的能力、基本不發酵性、防止膠凝化淀粉退化的能力、以及防止其它多糖結晶的能力。
因此，可隨意地將本發明中海藻糖和含海藻糖的多糖組合物作為甜味劑、味道改善劑、質量改善劑、穩定劑和填充劑用于各種組合物如食品、香煙、煙草、飼料、化妝品和藥物。
可將本發明中海藻糖和含海藻糖的多糖組合物原封不動地用作甜味調料。可根據需要與足量的一種或多種其它甜味劑，如粉化的糖漿、葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、異構糖、蜂蜜、槭糖、赤蘚糖、山梨醇、甘露醇、乳糖醇、甜葉菊苷、阿里塔姆(Alitame)、甘草甜、天冬甜精(Asparmate)、糖精、甘氨酸和丙氨酸或填充劑如糊精、淀粉和乳糖一起使用。
可以原封不動地使用含本發明海藻糖和含海藻糖的多糖組合物的粉末或結晶與其它賦形劑、填充劑、稀釋劑和粘合劑混合，并制成顆粒、球棒，扁片、錠劑和片劑。
含本發明海藻糖和含海藻糖的多糖組合物可以與有酸味、鹽味、苦味、澀味及美味的其它物質很好地兼容，并有相對高的耐酸性和熱抗性。因此可很好地將其用于食品、作為甜味劑、味道改善劑和質量改善劑。
可以將本發明海藻糖和含海藻糖的多糖組合物用于調味劑中，如氨基酸、肽、醬油、粉末化的醬油、酒、蛋黃醬、調味品、醋、醬菜、方便調料、核酸調味品、混合調料、食糖和咖啡糖。
可以將本發明海藻糖和含海藻糖的多糖組合物隨意用于增加以下食品的甜味糕點、果胨、面醬、乳脂糖；甜食如甜點心，餅干，干酪，小甜餅，派，布丁，黃油，八寶粥，牛奶蛋糊，奶油酥，牛奶雞蛋格子甜餅，海綿蛋糕，油炸餅圈，巧克力，口香糖，焦糖和糖果；冷凍甜點如冰激凌和甜味果汁粉、糖漿；加工過的水果和蔬菜如果醬、蜜餞、番茄醬；腌菜和腌制食品如腌蘿卜、腌榨菜和腌黃瓜；肉產品如火腿和香腸；魚肉產品如魚火腿，魚腸，魚干；干菜如紫菜，脫水蔬菜；奶產品，如牛奶、豆奶；罐裝和瓶裝產品如肉，魚肉，水果和蔬菜罐頭；含醇飲料如米酒，黃酒，葡萄酒和白酒；軟飲料如咖啡，茶，可可，果汁，碳酸飲料，酸牛奶飲料和含乳酸菌的飼料；方便食品如即食布丁混合物，即食熱糕點混合物和即食湯混合物；和特殊食品，如嬰兒食品、藥療食品、太空食品，全營養素；本發明海藻糖和含海藻糖的多糖組合物能改善上述食品的味道和質量。
也可將本發明海藻糖和含海藻糖的多糖組合物用于動物如家畜、家禽、蜜蜂、蠶和魚的飼料和寵物食品，以改善其口味愛好。也可將海藻糖和含海藻糖的多糖組合物用作甜味劑、味道改善劑、質量改善劑和穩定劑添加進如煙草、香煙、牙膏和牙膏粉、口紅、胭脂、唇膏、面霜、內服藥、魚肝油、口服降溫劑、含漱劑、化妝品和藥物。
可將本發明海藻糖和含海藻糖的多糖組合物作為質量改善劑和穩定劑用于對其有效成分和活性喪失敏感的生物活性物質，及含生物活性物質的健康食品和藥物組合物。上述生物活性物質的實例是淋巴細胞活素如α-，β-，和γ-干擾素，α-腫瘤壞死因子(INF-α)，β-腫瘤壞死因子(TNF-β)，巨噬細胞遷移抑制因子，集落刺激因子，轉移因子和白細胞介素2(IL-2)；激素如胰島素，生長激素，泌乳素，紅細胞生成素和卵泡刺激素；生物制品如BCG疫苗，日本腦炎疫苗，麻疹疫苗，活脊髓灰質炎疫苗，天花疫苗，破傷風類毒素，抗毒素和人免疫球蛋白，獸用注射疫苗；抗生素如青霉素，紅霉素，氯霉素，四環素，鏈霉素和硫酸卡那霉素；維生素如硫胺，核黃素，L-抗壞血酸，魚肝油，類胡蘿卜素，麥角甾醇和生育酚；酶如脂酶，彈性蛋白酶，脲激酶，蛋白酶，α-乙酰乳酸脫羧酶，β-淀粉酶，異淀粉酶，聚葡糖酶和乳糖酶；提取物如人參提取物，龜鱉提取物，藻類提取物，蘆薈提取物、蜂膠提取物；可存活的微生物菌種，如病毒，乳酸菌和酵母；其它生物活性物質如蜂王漿。通過使用本發明海藻糖和含海藻糖的多糖組合物，可以很容易將上述生物活性物質加工成具有令人滿意的穩定性和質量的健康食品和藥物組合物，而不必擔心其有效成分和活性的喪失或丟失。
按上文所述，將本發明海藻糖和含海藻糖和多糖組合物摻入上述物質的方法包括傳統方法，例如混合、捏合、溶解、融化、浸泡、滲透、噴淋、敷、涂上、噴、注射、結晶和固化。通常以0.1％或更高，優選的1％或更高的量，將本發明海藻糖和含海藻糖的多糖組合物摻入上述的物質和組合物中。
附圖簡要說明
圖1表示由淀粉通過海藻糖基合成酶和海藻糖基水解酶生成海藻糖簡圖。其中，○葡萄糖殘基●葡萄糖殘基還原端 -α-1.4葡萄糖苷鍵～α.α-1.1-葡萄糖苷鍵d.p.n聚合度≥3。
圖2為大腸桿菌MTH-11海藻糖基水解酶的“DEAE-Fast Flow”凝膠色譜柱洗脫圖譜。
圖3表示大腸桿菌MTH-11的海藻糖基水解酶的最適反應溫度。
圖4表示大腸桿菌MTH-11的海藻糖基水解酶的最適pH值。
圖5表示大腸桿菌MTH-11的海藻糖基水解酶的溫度穩定性。
圖6表示大腸桿菌MTH-11的海藻糖基水解酶的pH值穩定性。
下列實施例說明從微生物大腸桿菌MTH-11和酵母菌MTH-8，以及迄今已知的微生物中生產并純化本發明的嗜酸耐熱海藻糖基水解酶。
實施例1海藻糖基水解酶的制備含0.1w/v％蛋白胨，0.05w/v％酵母提取物，0.1w/v％葡萄糖和0.1w/v％氯化鈉的液體營養培養基，調pH到7.0，將約50ml等份的液體營養培養基放在250ml Erlenmeyer燒瓶中，在15 lbf/in2(1.034×105Pa)高壓蒸汽滅菌30分鐘，冷卻，用大腸桿菌MTH-11種子培養物接種，在轉速為220轉/分的搖床上30℃培養12小時，收集所得的培養物并用作種子培養物。
將約3升上述新鮮制備的液體營養培養基放在5升的發酵罐中，滅菌，冷卻到28℃，用5％的種子培養物接種，并在28-37℃，pH6.0-8.0，攪拌并通氣的條件下培養約4-6小時，當培養液的OD600為0.3-1.0時，提高培養溫度至38-42℃繼續培養3-6小時。培養結束后，將培養物于4℃，6000轉/分離心10分鐘，分離成菌體細胞和上清液。
實施例2酶的純化對由實施例1方法得到的菌體進行處理，用100ml醋酸緩沖液(pH5.5)重新懸浮菌體，在冰浴條件下超聲波破碎，直到菌體懸浮液變清亮為止；所得懸浮液于70℃保溫半小時后，11,000rpm下離心20分鐘得到約100mL上清液為粗酶液。然后用20mL“DEAE-Fast Flow”(一種陰離子交換劑)裝填的柱進行柱層析；目標蛋白海藻基水解酶被吸附于離子交換劑上，用新鮮制備的以不同鹽濃度的醋酸緩沖液將它從柱上洗脫下來。圖2表示了該柱層析的洗脫圖譜。在鹽濃度為0.3M時，海藻糖基水解酶被從柱上洗脫下來，合并含海藻基水解酶酶活的組份并精制。
把合并的含有海藻糖基水解酶的組份在新鮮制備的用2M硫酸銨補充的同一醋酸緩沖液中透析。透析液于10000rpm下離心30分鐘除去不溶物，所得上清液用以10ml“Phenyl-Sepharose”(一種疏水樹脂)裝填的柱進行疏水柱層析。用從2M到0M范圍的線性梯度緩沖液將吸附于凝膠的酶從柱上洗脫下來，回收具有酶活性的組份。將所得組份精制并用“Sephaeryl S-200”(一種凝膠過濾樹脂)裝填的柱進行凝膠過濾層析，回收具有酶活性的組份。
表1顯示了每個純化步驟中海藻糖糖基水解酶的總酶活性、比活性及收率。
總酶活力 比活 收率(U) (U/mg) (％)粗酶液 134800 27熱處理 134800 73100DEAE-Fast Flow離子柱層析 109180 153 81Phenyl-Sepharose疏水柱層析 68748 220 51Sephaeryl S-200凝膠柱層析 32350 557 24純化過的酶制品(由表1中凝膠過濾柱得到的洗脫液)，使用7.5％聚丙烯酰胺，在電泳上測定其純度。結果，觀察到酶制品呈單一蛋白譜帶，這表明它是具有較高純度的電泳單一制品。
實施例3海藻糖基水解酶的性質使用含10％十二烷基磺酸鈉的聚丙烯酰胺凝膠，將由實施例2方法得到的純酶制品進行電泳，并通過將它與蛋白分子量標記進行比較，測得其分子量為約55,000-66,000道爾頓。
使用含2w/v％兩性電解質“AMPHOLINE”，對實施例2方法得到的純酶制品進行等電點電泳(isoeletrohopresis)。將所得凝膠切成片，然后測定它們的pH值，得到該酶的pI為約5.5-6.6。
根據對酶活性的分析來研究溫度和pH對該酶活性的影響。圖3(溫度的影響)和圖4(pH的影響)分別顯示了這些結果。
當于pH5.5保存30分鐘時，該酶的適宜溫度為約60-85℃，在65℃保存30分鐘時，該酶的適宜pH為約5.0-6.0。
通過將在50mm醋酸緩沖液(pH5.5)中的酶在不同溫度下保存60分鐘，然后用冷水冷卻測試試管中的緩沖液并測定每份緩沖液中殘留的酶活性，從而來測定該酶的熱穩定性。通過將在不同pH的廣泛圍緩沖溶液在25℃保存16小時，調整這些緩沖液至pH5.5，然后分析每份緩沖液中殘留的酶活性來測定該酶的pH穩定性。圖5和圖6分別顯示了該酶的熱和pH穩定性結果。該酶在溫度高達約80℃和pH約4-11下是穩定的。
實施例4從末端為海藻糖結構且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖制備海藻糖按日本專利申請No.362,131/92所述的方法來制備非還原多糖用作底物，它具有末端為海藻糖結構且葡萄糖聚合度為3或更高。分別向作為底物的含20％麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖或麥芽七糖的水溶液中加入2單位/g底物的海藻糖基合成酶，將所得混合物于75℃和pH5.5下進行酶反應48小時。將該反應混合物100℃加熱，使殘留的酶失活，過濾、脫色、脫鹽并濃縮得到一種濃的糖溶液，然后用“XT-1016”(Na型，聚和度為4％的一種離子交換劑)對該溶液進行柱層析。在柱層析中，用內徑為2.0cm，長為1m的3個套層的不銹鋼柱裝填離子交換劑，然后將這些柱順序級聯并加熱至柱內溫達55℃，將5v/v％濃糖溶液(對樹脂量)上樣，當濕度保持在55℃，且在SV(體積速度)為0.13下用55℃熱水洗脫，得到高純度的非還原多糖，該糖具有末端為海藻糖結構且葡萄糖聚合度為3或更高。在得到的制品中，葡糖基海藻糖制品含葡糖基海藻糖的純度為97.6％，麥芽糖海藻糖、麥芽三糖基海藻糖、麥芽四糖基海藻糖和麥芽五糖基海藻和麥芽五糖基海藻糖在它們的高純度制品中的純度分別為98.6％、99.6％、98.3％和98.1％。
分別配制含20％上述5種非還原多糖制品的水溶液，然后將該溶液與實施例2中得到的純化的海藻糖基水解酶以2單位/g底物的量混合，然后將所得溶液于75℃和pH5.5進行酶反應48小時。把得到的每種反應混合物脫鹽并經高壓液相色譜(HPLC)(使用REZEX RNMCARBOHYDRATE柱)分析其組成。作為對照，將新鮮制備的同樣的海藻糖基水解酶作用于麥芽糖寡糖，例如麥芽糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖和麥芽七糖，并經HPLC分析得到的每種反應混合物的組成。表2顯示該結果。
表2
表3中的結果表明1、根據本發明的海藻糖基水解酶特異地水解具有海藻糖結構作為一個末端和葡萄糖聚合度為3或大于3的非還原多糖中的海藻糖部分和糖基部分之間的鍵，形成海藻糖和一種葡萄糖聚合度為1或大于1的非還原糖；2、麥芽寡糖不被本發明的海藻糖基水解酶所水解。
這些結果證實本發明的海藻糖基水解酶是一種新酶，它具有在高溫酸性條件下特異地水解帶有海藻糖結構作為一個末端且葡萄糖聚合度為3或大于3的非還原多糖中的海藻糖部分和糖基部分間的鍵，從而將海藻糖從非還原多糖中釋放出來。
為純化各種反應混合物中的海藻糖，將該反應混合物用以“XT-1016(Na+型)”(一種堿金屬型強酸陽離子交換樹脂)裝填的柱進行柱層析，之后回收含97％或更高的海藻糖的組份。將這些組份合并并濃縮至約65％濃度，將該濃縮物于25℃放置2天使其結晶出水合結晶海藻糖，然后分離出這些結晶并真空下干燥得到純度為99％或更高的高純度海藻糖制品。用葡萄糖基海藻糖、麥芽糖基海藻糖為底物制備海藻糖的收率分別為9.5％、14.9％、16.0％、18.5％和17.7％。研究了高純度海藻糖制品和市場上購得的海藻糖樣品(作標準品)的熔點、融化熱、比旋光、紅外吸收光譜、X-衍射圖譜及對海藻糖酶(Sigma產品)的水解作用的敏感度。結果，各種海藻糖制品顯示的熔點為97.6±0.5℃、融化熱為57.9±1.2KJ/mol和比旋光為+182±1.1°，與標準海藻樣品的數值十分吻合，此外這些海藻糖制品的紅外吸收光譜和X-衍射圖譜也與標準海藻樣品的十分吻合。與標準的海藻糖樣品相似，這些海藻糖制品很容易被海藻糖酶水解成為葡萄糖單體。
這些結果明確證實，由本發明的海藻糖基水解酶作用于具有海藻糖結構作為一個末斷且葡萄糖聚合度為3或大于3的非還原多糖形成的非還原多糖是海藻糖。
實施例5從非還原性的淀粉部分水解物制備海藻糖經加熱使含5％蠟狀玉米淀粉的懸浮液明膠化，調至pH4.5，加熱到50℃，與一種異淀粉酶(isoamylase)樣品以4,000單位/g淀粉的量混合，并使該酶反應持續20小時。該反應混合物于120℃高壓滅菌10分鐘，冷至60℃，然后用以750ml“Toropearl 50s凝膠”裝填的柱進行凝膠過濾層析，得到葡萄糖聚合度為35-10的還原性淀粉部分水解物。
將上述得到的還原性淀粉部分水解物或葡萄糖聚合度為3的麥芽三糖作為底物溶于10mM醋酸緩沖液(pH5.5)制成1％溶液，然后將該溶液與4單位/g底物的海藻糖基合成酶和純化的海藻糖基水解酶(以實施例2中方法制備)以4單位/g底物的量混合，并于75℃進行酶反應24小時。待酶的反應完全后，將得到的每種反應混合物進行脫鹽并經HPLC分析其組成。
將剩余的每種反應混合物加熱到50℃，調pH至4.5，以50單位/g底物的量與葡萄淀粉酶樣品混合，然后進行24小時酶反應。與上面相似，將得到的部分反應混合物進行脫鹽并以HPLC分析其組成。表3顯示了該結果。
表3
A海藻糖基合成酶+本海藻糖基水解酶B海藻糖基合成酶+本海藻糖基水解酶+葡萄淀粉酶如表3所示，在使用葡萄糖聚合度為3的麥芽三糖為底物的情況下，經海藻糖基合成酶與本海藻糖基水解酶發生酶反應后的海藻糖收率比較低，即4.3％，但在使用葡萄糖聚合度為10-35的淀粉部分水解物為底物的情況下，該海藻糖的收率比較高，即67.4-80.4％。并發現還原性淀粉部分水解物的葡萄糖聚合度越高，所得海藻糖的純度也越高。還發現通過使葡萄淀粉酶作用于由兩種酶水解還原性淀粉部分水解物制得的反應混合物，將伴生的具有海藻糖末端且葡萄糖聚合度為3或大于3的非還原多糖水解成海藻糖和葡萄糖分子，能提高所得海藻糖的濃度。
實施例6美拉德反應將1％甘氨酸、10％高純度海藻糖(純度為99.5％，通過實施例4的方法獲得)溶于50mM磷酸緩沖液中(pH7.0)，于100℃保存90分鐘，然后冷卻該溶液并測定它在480nm波長處的光吸收。以同樣處理的葡萄糖和麥芽糖作為對照，結果見表4。
表4
該結果表明本發明的海藻糖制品經美拉德反應誘導后僅表現為較淺的顏色，其顏色程度僅為葡萄糖和麥芽糖的約0.3-0.5％。說明該海藻糖基本上不參與美拉德反應，本發明的海藻糖是一種當它們與氨基酸混合時，對氨基酸的破壞威脅性較小的一種糖。
實施例7由已知微生物生產的海藻糖基水解酶及其性質迄今已知的微生物菌株中的酵母菌MTH-8和芽孢桿菌T-3，已被發明者證實它們能產生本發明的海藻糖基水解酶，與實施例1相似，將這兩種菌株分別在發酵罐中30℃培養12小時。將所得的每種菌株的2L培養液收集菌體后使細胞破碎，并離心得到上清液，然后順序用“DEAE-Fast Flow”(一種陰離子交換劑)的陰離子交換柱上層析；用“Phenyl-Sepharose”(一種疏水樹脂)的疏水柱層析；和使用“SephaerylS-200”(一種凝膠過濾樹脂)的凝膠過濾層析得到純化的酶制品，然后研究它的性質。酵母菌MTH-8和芽孢桿菌T-3的海藻糖基水解酶基本與大腸桿菌MTH-11相似。
下述實施例A描述了本發明海藻糖基水解酶的制備，用該酶制備的海藻糖及含海藻糖的糖組合物，實施例B描述了含一種或多種這類海藻糖和糖的組合物實施例A-1按實施例1的方法，將大腸桿菌MTH-11的種子培養物接種到3L的營養培養基上，并在5L發酵罐中培養7小時。發酵完后，將所得發酵液離心，分離成菌體細胞和上清液。用100ml醋酸緩沖液(pH5.5)重新懸浮菌體，在冰浴條件下超聲波破碎，直到菌體懸浮液變清亮為止；所得懸浮液于70℃保溫半小時后，11,000rpm下離心20分鐘得到約100mL上清液為粗酶液，該溶液含1380單位/ml的海藻糖基水解酶。
往15％的土豆淀粉懸浮液中加入碳酸鈣使其終濃度達0.1％，將所得溶液調至pH6.0，與0.2％的高溫α-淀粉酶樣品混合，接下來于95℃進行酶反應15分鐘，該反應混合物在2kg/cm2壓力下高壓滅菌消毒30分鐘，冷卻至75℃，調pH至5.5，以1,000單位/g淀粉的普魯蘭酶與4單位/g淀粉的海藻糖基合成酶及4單位/g上述海藻糖基水解酶溶液混合，接下來進行48小時的酶反應。如此得到的反應混合物于100℃保持10分鐘，冷卻并過濾，所得濾液以常規方法用活性炭脫色，用H-和OH-型離子交換劑脫鹽并純化，之后再將得到的溶液濃縮得為60％糖漿，收率約為92％。
該糖漿含有71.2％海藻糖、2.4％葡萄基海藻糖、3.3％麥芽糖基海藻糖、0.7％葡萄糖、9.1％麥芽糖、12.1％麥芽三糖和1.2％的麥芽四糖和高級寡糖，它具有爽口適中的甜味，較低的還原性及適宜的粘度和保濕性能。由于這些性質，它可任意地用于食品、化妝品和藥品中，作為甜味劑、矯味劑、增質劑、穩定劑、稀釋劑、填充劑和賦形劑。
實施例A-2通過實施例1的方法得到的糖溶液為原料溶液，用以“XT-1016”(Na+型，4％的聚合度，一種堿金屬型強酸陽離子交換樹脂)填裝層析柱分離。該過程如下用內徑5.4cm的4個套層的不銹鋼柱裝填樹脂，將該柱順序級聯使得到的總凝交床深度為20m。將該柱加熱到柱內溫度55℃，并在該溫度保持下，以5V/V％的糖溶液(對樹脂)上柱，用55℃熱水洗脫分離該糖溶液，以除去伴生的糖，例如麥芽糖和麥芽三糖，之后收集富集海藻糖的餾分。將得到的該組份合并、純化、濃縮、真空干燥并粉碎得到高濃度海藻糖粉，收率為約58％。
該產物中海藻糖的濃度為約97％，且該產物具爽口適中的甜味，因此它可任意地用于食品、化妝品和藥品中作為甜味劑、矯味劑、增質劑、穩定劑、賦形劑和填充劑。
實施例A-3通過實施例A-2方法得到的高濃度海藻糖溶液，用活性炭脫色，離子交換劑脫鹽，并濃縮成70％溶液，然后將該溶液放入結晶皿中，混入約2％水合海藻糖結晶作為晶種，再緩慢冷卻得到一糖膏，其結晶率約為45％。該糖漿經高壓干燥噴霧，獲得海藻糖結晶粉末，并將其注入老化塔中老化干燥10小時使之完全結晶，獲得粉末狀結晶海藻糖，收率為90％。
該產物基本上不吸濕，便于保存，可作為甜味劑、矯味劑、增質劑、穩定劑、賦形劑和填充劑任意地用于食品、化妝品和藥品。
實施例A-4與實施例A-3相似，將實例A-2方法獲得的高濃度海藻糖溶液，置于蒸發器中，真空蒸發得到濕度約為3.0％糖漿。將該糖漿放在結晶皿中，加入約1％的水合結晶海藻糖，于120℃下攪拌結晶5分鐘，將產物置于老化塔中，于100℃老化6小時得到塊狀物。
將所得塊狀物用粉碎機粉碎，并經流化床干燥即得到粉狀水合結晶海藻糖(其濕度約為0.4％)，收率約為88％。該產物可任意作為食品、化妝品、藥品的干燥劑、甜味劑或填充劑使用。
實施例A-5按實施例A-1的方法，將大腸桿菌MTH-11的種子培養物接種到3L營養培養基上，用發酵器培養12小時，培養完后，用SF-膜濾去細胞得到約3L濾液，該濾液再用SF-膜濃縮至100mL酶溶液，該溶液含有約190單位/ml的海藻糖基水解酶。
通過加熱6％的土豆淀粉懸浮液明膠化，調至pH4.5，加熱至50℃，以500單位/g淀粉的量混入異淀粉酶樣品，接下來進行20小時的酶反應。將該反應混合物調到pH6.5，于120℃高壓滅菌10分鐘，冷至95℃，以0.1％/g淀粉的量混入高溫α-淀粉酶，接下來進行15分鐘酶反應。該反應混合物于130℃高壓滅菌30分鐘，冷至75℃，調pH至5.5，加入10單位/g淀粉的海藻糖基合成酶及上述酶溶液，之后進行酶反應64小時。所得反應混合物于100℃保持20分鐘，冷至50℃，調pH于5.0，以10單位/g淀粉的量混入葡萄淀粉酶，之后進行酶反應40小時，并加熱使殘留的酶失活。將如此得到的溶液以常規方法用活性炭脫色，用離子交換劑脫鹽并濃縮為約60％溶液(含80.5％的海藻糖)。該溶液濃縮成82％溶液，之后置于結晶皿中并混入約占該溶液干重2％的水合結晶海藻糖作為晶種，在攪拌下結晶出海藻糖。將所得結晶放入平面塑料容器中，于室溫放置3天使結塊，用粉碎機將塊狀物粉碎得到粉狀水合結晶海藻糖，收率90％。
該產物基本上不吸濕，易于保存，因此它作為甜味劑、矯味劑、增質劑、穩定劑、賦形劑和填充劑，可任意用于各種組合物中，例如食品、化妝品和藥品和生物制品中。
實施例A-6按實施例1中的方法，將菌種酵母菌MTH-8的種子培養物接種于營養培養基中，在發酵罐中培養72小時。所得3L培養液于10,000rpm下離心20分鐘除去細胞，用UF-膜濃縮得到的上清液，得200mL酶溶液，它含有25單位/ml的海藻糖基水解酶。
將1份重的土豆淀粉與6份重的水和0.01份重的高溫α-淀粉酶混合攪拌，調至pH6.2并加熱至85～90℃使淀粉明膠化和液化。所得液態淀粉于120℃高壓滅菌10min使剩余的酶失活，冷至75℃，調pH至5.5，以500單位/g淀粉的異淀粉酶樣品混合，另與10單位/g淀粉的海藻糖基合成酶及上述酶溶液混合，然后進行酶反應48小時。待反應完全后，于100℃將該反應混合物加熱20min使剩余酶失活，調至50℃和pH5.0，以10單位/g淀粉量與葡萄糖淀粉酶混合，之后進行酶反應40小時，并加熱使剩余的酶失活。如此得到的反應混合物以常規方法用活性炭脫色，用離子交換劑脫鹽并濃縮成約60％溶液，該溶液含78.3％的海藻糖。與實施A-2的方法相同，只是使用CG6000(Na+型堿金屬型強酸陽離子交換樹脂)作為離子交換劑，將濃縮的溶液進行離子交換柱層析，得到高濃度海藻糖組份，它含有約95％的海藻糖。將所得組份濃縮到75％的濃度，置于一平面塑料容器中結晶，于室溫放置并老化3天，使結塊，然后將該塊狀物用粉碎機粉碎，得到粉狀水合結晶海藻糖，收率為約70％。
該產品基本上沒有吸濕性且易于保存，能任意地用作各種組合物，例如食品、化妝品和藥品中的甜味劑、矯味劑、增質劑、賦形劑、填充劑和稀釋劑。
實施例A-7按實施例1的方法，將芽孢桿菌T-3菌種的種子物接種到營養培養基上，在發酵器中培養36小時，得到的3L培養液用細胞破碎儀處理。所得混合物于10,000rpm下離心30min除去殘留物，用UR-膜濃縮得到的上清液，得到100ml溶液，該溶液含12.5單位/ml的海藻糖基水解酶。
33％的木薯淀粉懸浮液與碳酸鈣混合使其終濃度為0.1％，并調其pH至6.0，與0.3％α-淀粉酶混合，然后在95℃進行酶反應20min。所得反應混合物在2kg/cm2壓力下高壓滅菌30min，冷卻至75℃。再以200單位/g淀粉量與異淀粉酶樣品混合，以0.2ml/g淀粉量與10單位/g淀粉的海藻糖基合成酶及上述酶溶液混合，之后75℃進行酶反應48小時。如此得到的反應混合物于100℃保持20min，冷卻并過濾，得到濾液，該濾液以常規方法用活性炭脫色，用H-和OH-型離子交換劑脫鹽，再濃縮成60％糖漿，收率為約90％。
該產物含有60.1％海藻糖、1.4％葡糖基海藻糖、1.5％麥芽糖基海藻糖、1.0％葡萄糖、6.5％麥芽糖、8.3％麥芽三糖、21.2％麥芽四糖和高級寡糖，它具有爽口適中的甜味，還具有較低還原性和適當的保濕性能。由于這些因素，它可任意地用于各種組合物，例如食品、化妝品和藥品中作為甜味劑、矯味劑、增質劑、穩定劑、賦形劑、填充劑和稀釋劑。
實施例A-8將通過實施例A-6方法得到的含約95％海藻糖的高濃度溶液，以常規方法脫色和脫鹽。將所得溶液濃縮成75％溶液，然后將該溶液轉移到一結晶皿中，混入2％的水合結晶海藻糖作為晶種，加熱至50℃，攪拌下逐漸冷至25℃，用籃式離心分離出結晶。噴入少量水洗滌所得到純度為99％的高純度水合結晶海藻糖，收率為約50％。
實施例B-1甜味劑往通過實施例A-5方法得到的1份重的粉狀水合結晶海藻糖中加入0.01份重的天冬甜精和0.01份重的甜葉菊苷，將得到的混合物送入制粒機，得到粒狀甜味劑。該產品有令人滿意的甜味，且甜度為蔗糖的2.5倍，熱量值為蔗糖的2/5。
由于該產品的低熱量且具有令人滿意的穩定性，不會分解混入的其它甜味劑，非常適宜作為向肥胖者和糖尿病患者提供的低熱量食品的低熱量甜味劑。
當誘導齲齒的細菌作用于該產物時，它基本上不形成酸和不溶性的葡聚糖，因此可用作甜味劑而防止齲齒的產生。
實施例B-2硬糖果將100份重的55％蔗糖溶液與30份重的海藻糖糖漿(通過實施例A-7方法得到)加熱混合，真空濃縮至濕度低于2％。向該濃溶液中加1份重的檸檬酸和足量的檸檬酸芳香劑和著色劑混勻后，用常規方法制成所需產品。
該產品是一種高質量的硬糖果，它具有令人滿意的味道和咀嚼特性，并且不用擔心會產生蔗糖結晶。
實施例B-3口香糖將3份基姆膠加熱至熔化變軟，之后與4份重的蔗糖和3份重的水合結晶海藻糖粉(通過實施例A-3方法得到的)混合，再與足量芳香劑和著色劑混合。用常規方法將所得混合物用輥揉制成型并包裝得所需產品。
該產品是一種具有令人滿意的結構和味道的口香糖。
實施例B-4
甜濃縮牛奶將通過實施例A-1方法得到的三份重的海藻糖漿和1份重的蔗糖溶于100份新鮮牛奶中，所得溶液經平板加熱器加熱滅菌并濃縮成70％的濃度，隨后將得到的濃縮物無菌裝罐成所需產品。
該產品具有牛奶甜味和令人滿意的味道，這使它可任意地用在嬰兒食品、新生兒食品、水果、咖啡、可可和茶中作調料。
實施例B-5乳酸飲料將170份重的脫脂牛奶、130份重的海藻糖糖漿(通過實施例A-1的方法得到)和50份重的高含量乳蔗糖粉(如日本專利公開No.281,795/92中所公開)溶于1150份重的水中。所得溶液于65℃滅菌30min，冷卻至40℃并接種30份重的乳酸菌作為起始物，于37℃培養8小時后得到所需產品。
該產品是一種味道令人滿意的芳香的乳酸飲料。因為該產品中含有寡糖，可以保持乳酸菌的穩定并促進雙歧菌的生長。
實施例B-6粉末果汁將33份重經噴霧干燥得到的粉狀橘汁和50份重的高純度海藻糖粉(通過實施例A-2方法制得)、10份重的蔗糖、0.65份重的無水檸檬酸、0.1份重的蘋果酸、0.1份重的L-抗壞血酸、0.1份重的檸檬酸鈉、0.5份重的支鏈淀粉和足量粉狀芳香劑混合均勻。將所得混合物粉碎并送入制粒機制粒，同時以作為粘合劑的海藻糖糖漿(通過實施例A-1方法得到)噴霧并用40℃空氣通風。將獲得的粒狀物進行稱重并包裝得所需產品。
該種含30％橘汁的產品能在較長時間內保持其高品質而不會產生異味。
實施例B-7牛奶蛋糊凍將100份重的玉米淀粉、100份重的海藻糖漿(通過實施例A-7方法得到)、80份重的乳糖、20份重的蔗糖和1份重的鹽混合均勻后，再逐漸加入280份重的雞蛋和100份重的沸牛奶，并繼續加熱攪拌，當混合物中淀粉完全明膠化時停止加熱，得到半透明物，然后冷卻該混合物并往其中加入足量香草香精。將所得混合物稱重并注裝得所需產品。
該產品表面光滑并具光澤，并有牛奶味和甜味。
實施例B-8豆沙醬用10份重的大豆為原料，以常規方法與水混合并煮沸，在去除豆的澀味和精糙感及水溶性雜質后，往所得物中加入14份重的蔗糖、5份重的海藻糖糖漿(通過實施例A-1方法得到)和4份重的水，并將所得混合物煮沸，與少量沙拉油混合并小心捏合到使豆不成糊狀。這樣，就制得了約35kg所需產品。
不因煮沸而褪色的該產品具有令人滿意的味道和香味，這使它可用作豆沙醬面包、豆沙醬包子、湯圓、豆沙醬薄脆餅、米糕和冰激凌的原料。
實施例B-9面包將100份重的麥粉、2份重的酵母、5份重的糖、1份重的粉狀水合結晶海藻糖(通過實施例A-3方法得到)、0.1份重的食用酵母粉混合后按一般方法加水捏合，于26℃發酵2小時，老化30分鐘并烤制。
該產品是一種高品質的面包，具有令人滿意的顏色、甜度和松軟性。
實施例B-10火腿往1000份重的切成片的火腿肉中加入15份重的鹽和3份重的硝酸鉀并均勻磨碎，將該火腿肉片堆起并放在冷藏室過液。然后，將該火腿肉片先于冷藏在鹽溶液中浸泡7天，該鹽溶液含500份重的水、100份重的鹽、3份重的硝酸鉀、40份重的非還原多糖的粉末(通過實施例A-6方法制備)及足量胡椒，再以常規方法用冷水洗，掛起薰制，烹煮，冷卻包裝得所需產品。
該產品是一種高質量的火腿，具有令人滿意的顏色、味道和芳香。
實施例B-11
豆奶粉將1份重的豆奶與兩份重的結晶海藻糖粉末(通過實施例A-6的方法制備)混合，所得混合物放入塑料器皿中，于50℃真空干燥并粉碎得到粉末豆奶粉。
該產品具有令人滿意的味道和芳香，可任意地用作糖果，例如預混物、冰糕和冰激凌的原料，也用作口服或飼料喂形工的嬰兒食品和治療用營養品的原料。
實施例B-12粉末蛋黃用新鮮雞蛋制得的蛋黃，用平板加熱器于60～64℃滅菌，將1份重的所得液體與4份重的粉狀無水結晶海藻糖(通過實施例A-4得到)混合。并轉入—容器中，放置過夜使結塊，此時無水結晶海藻糖轉化成水合結晶海藻糖。將這樣得到的塊狀物用粉碎機粉碎得到粉末蛋黃。
該產品可任意地用作糖果，例如預混物、冰激凌和乳制品的原料，還有口服或飼喂形式的嬰兒食品和治療用營養的原料。該產品也可用作皮膚護理劑和生發劑。
實施例B-13化妝霜按常規方法加熱溶解2份重的聚7二醇單硬脂酸酯、5份重的單硬脂酸甘油酯(自身乳化的)、2份重的高純度海藻糖粉(通過實施例A-2方法得到)、1份重的α-糖基蘆丁、1份重的液態凡士林、10份重的三-2-乙基環己酸甘油酯和足量抗菌劑。將所得溶液與2份重的L-乳酸、5份重的1，3-丁二醇和66份重的純化水混合，并用均化器乳化所得混合物，再在攪拌下混入足量香精，得到化妝霜。
該產品有較高穩定性，可任意地用作高質量防曬霜、皮膚護理劑和皮膚增白劑。
實施例B-14粉末人參提取物將半份重的人參提取物與1.5份重的粉狀無水結晶海藻糖(通過實施例A-4方法得到)混合，所得混合物轉入平面容器中，使之放置2天將無水結晶海藻糖轉化為水合結晶海藻糖，結塊。用粉碎機粉碎所得塊狀物，分份得到粉末人參提取物。
該產物和足量維生素B1和B2裝入制粒機制得含維生素的粉末人參提取物。
這樣得到的該產品可任意地用作滋補劑、疲勞恢復劑和強身劑。
該產品也可用作生發劑。
實施例B-15固體藥品將天然的人α-干擾素制品用常規方法上固定有抗人α-干擾素抗體的柱以吸附α-干擾素，并將作為穩定劑的一種含牛血清的緩沖液上柱，然后除去過量蛋白。此后，用含5％高含量海藻糖粉(通過實施例A-2方法得到)的生理鹽水將α-干擾素從柱上洗脫下來，此時生理鹽水的pH發生變化。將所得洗脫液進行膜過濾，濾液通過加入20倍體積的無水結晶麥芽糖粉，產物脫水后粉碎，并將所得粉末通過制片機制片，得到每片含約150單位天然人α-干擾素的藥片，每片重約200mg。
該產品可作為舌下片給患者口服，劑量為每人1-10片/天，并任意地用于治療病毒性疾病、變態反應、關節炎、糖尿病和腫瘤。更具體地，該產品適于用作治療AIDS和肝炎的藥劑，患有這類疾病的患者數顯著增加。混在該中的海藻和麥芽糖作為天然人α-干擾素的穩定劑，其活性在室溫下也能較長時間、較好地保持。
實施例B-16糖包衣片重150mg的未加工的片，用溶液進行包衣直至片的總重達230mg，該包衣用溶液組成為40份重的粉狀水合結晶海藻糖(通過實施例A-3方法得到)、2份重的香草香精(平均分子量為200,000)、30份重的水、25份重的滑石粉和3份重的二氧化鈦；將所得片劑再用一種溶液包衣，該溶液組成為65份新鮮制備的相同的水合結晶海藻糖、1份重的香草香精和34份重的水，并用液態石蠟上光，得到具有令人滿意光澤和外觀的糖包衣片。
該產品有較高的貯存耐受性并能在相當長的時間內保持其高質量。
實施例B-17牙膏通過將下列組份混合，用常規方法制備牙膏磷酸氫鈣45.0％香草香精2.95％月桂基磺酸鈉1.5％甘油20.0％聚氧乙烯脫水山梨醇 0.5％抗菌劑 0.05％粉狀水合結晶海藻糖(通過實施例A-3方法制備)12.0％麥芽醇5.0％水 13.0％該產品由于有足夠的甜味，可令人滿意地作為新生兒用牙膏。
實施例B-18全營養素制備由下列組份組成的組合物500份重的的粉狀水合海藻糖結晶(通過實施例A-6的方法制備)、270份重的粉末蛋黃、209份重的脫脂牛奶、4.4份重的氯化鈉、1.8份重的氯化鉀、4份重的硫酸鎂、0.01份重的硫胺素、0.1份重的抗壞血酸鈉、0.6份重的維生素E和0.04份重的尼克酰胺。將該組合物以25g每等份裝入防潮的小袋并熱封制得所需產品。
將1袋該產品溶于約150～300ml的水制成流食，通過飼喂經口或非胃腸道施用到鼻腔、胃或腸道，以補充機體能源。
實施例B-19超級營養液將通過實施例A-8方法制備的高純度水合結晶海藻糖溶于水中制成10/w/v％海藻糖水溶液，然后以常規方法將該水溶液進行膜過濾除去熱原，無菌條件下裝入塑料瓶中，封口得所需產品。
該產品是一種令人滿意的穩定超級營養液，存放時基本上不會產生變化，適于靜脈和腹內施用。該產品的10w/v％溶液與血液是等滲透，并表明它可以高于葡萄糖2倍的濃度向機體提供能量。
實施例B-20超級營養液將通過實施例A-8方法制備的高純度水合結晶海藻糖和由下組份組成的氨基酸組合物攪拌下溶于水中，得到濃度分別為5w/v％和30w/v％的溶液，以常規方法將該水溶液進行膜過濾除去熱原，無菌條件下裝入塑料瓶中，封口得所需產品。
氨基酸組合物的組成組份 mg/100mlL-異亮氨酸 180L-亮氨酸 410L-賴氨酸單鹽酸鹽 620L-甲硫氨酸 240L-苯丙氨酸 290L-蘇氨酸 180L-色氨酸 60L-纈氨酸 200L-精氨酸鹽酸鹽 270L-組氨酸單鹽酸鹽 130甘氨酸 340雖然該產品是一種含有海藻糖和氨基酸的復合超級營養液，但它具有令人滿意的穩定性，存放時基本不會發生變化，該產品可任意地用于向機體補充能源和氨基酸。
實施例B-21治療損傷用軟膏將200份重的高含量的海藻糖粉(通過實施例A-2方法制得)和300份重的麥芽糖與含有3份重的硫磺的50份重的甲醇溶液混合，該所得溶液再與200份重的的10w/v/％的香草香精水溶液混合，得到具有令人滿意的伸展性和粘著性的所需產品。
該產品中含有的硫磺表現出殺細菌活性，該產品中的海藻糖作為活細胞的能量補充劑，由于這些性質，該產品縮短了創傷表面的愈合期，并使其恢復令人滿意。
由上可見，當本發明的海藻糖基水解酶與海藻糖基合成酶一起，作用于還原性淀粉部分水解產物時，它能以較高收率從非還原多糖中釋放生成海藻糖，所述非還原多糖具有海藻糖結構末且葡萄糖聚合度為3或高于3。這樣得到的海藻糖可被簡便地分離和純化，所得的海藻糖和含有它的糖組合物具有令人滿意的穩定性及較高的質量和中度甜味。當口服未加工的產品或經胃腸道施用輸液劑時，該海藻糖可方便地被機體消化、吸收和利用。海藻糖本身和含有它的糖組合物可任意地用作各種組合物，例如食品、化妝品和藥品中的甜味劑、增質劑、穩定性、賦形劑和填充劑。
因此，本發明提供限一種工業規模制備海藻糖和含有它的糖組合物的新技術，該技術以價廉和資源豐富的淀粉制備的淀粉部分水解產物為原料，具有較低成本。所以，本發明給許多領域帶來不可預測的巨大影響，這些領域包括如淀粉、酶和生化科學等，其它工業領域有食品、化妝品、藥品工業，及林業、漁業、農業、家畜和化學工業。因此，本發明對這些領域有著深遠而巨大的影響。
考慮到在此的描述是本發明的優選實施方案，但很清楚其中可以進行各種修改和補充。因此本發明既包含了符合本發明實質精神和范圍內的附屬權利要求，也包括了與此相關的所有此類修改和補充產生的權力要求。
權利要求
1.一種新型嗜酸耐熱海藻糖基水解酶，所述酶能在pH5.5，75℃條件下特異性高效水解具有海藻糖結構作為一個末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖中，海藻糖部分和其余糖基部分之間的鍵，并具有如下的物理化學特性(1)作用特異性水解具有海藻糖結構作為一個末端結構且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖中，海藻糖部分和其余糖基部分之間的糖苷鍵；(2)分子量在十二烷基磺酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)上約55,000到65,000道爾頓；(3)等電點(PI)在用兩性電解質的等電點電泳上約5.5到6.6；(4)最佳溫度在pH5.5保存30分鐘時，60～85℃；(5)最佳pH在65℃保存30分鐘時，5.0～6.0；(6)熱穩定性在pH5.5保存60分鐘時，可穩定的溫度為約30～80℃；(7)pH穩定性在25℃保存16小時，可穩定的pH為4.0～11.0。
2.根據權利要求1所述的酶，其中所述的酶是一種來自微生物的酶。
3.根據權利要求2所述的酶，其中所述微生物是選自埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬、酵母屬的微生物。
4.根據權利要求3所述的酶，其中所述埃希氏菌屬的微生物是埃希氏菌屬大腸桿菌(Escherichia Coli)MTH-11，保藏號為CGMCC No.0526。
5.根據權利要求3所述的酶，其中所述酵母菌的微生物是酵母屬(Saccharomyces sp)MTH-8，保藏號為CGMCC No.0525。
6.根據權利要求3所述的酶，其中所述芽孢桿菌屬的微生物是芽孢桿菌(Bacillus sp.)T-3。
7.一種制備權利要求1所述的酶的方法，所述方法包括在營養培養基中培養能生產所述酶的微生物以形成所述的酶，并回收所得的酶；所述微生物為選自埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬、酵母菌的微生物。
8.一種制備海藻糖的方法，包括(a)使權利要求1的酶作用于含有海藻糖結構作為一個末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖溶液，所述酶能特異性水解所述非還原多糖中海藻糖部分和其余糖基部分之間的鍵；(b)純化所得的海藻糖；
9.根據權利要求8所述的方法，其中將步驟(a)中的所述酶與海藻糖基合成酶一起使用，所述的海藻糖基合成酶能形成一個或多個具有海藻糖結構作為一個末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖。
10.根據權利要求8所述的方法，其中步驟(a)中還包括使葡萄糖淀粉酶作用于步驟(a)中所得溶液的步驟。
11.根據權利要求8所述的方法，其中步驟(b)包括使步驟(a)中所得的含海藻糖溶液經裝有強酸陽離子交換樹脂的柱的柱層析以純化海藻糖的步驟。
12.根據權利要求8所述的方法，其中步驟(b)還包括將步驟(b)中所得溶液中的海藻糖制成含水或無水的結晶海藻糖的步驟。
13.根據權利要求8所述的方法，其中所述糖基部分由一個或多個葡萄糖殘基組成。
14.一種制備含海藻糖的多糖組合物的方法，包括(a)使權利要求1所述的酶作用于具有海藻糖作為一個末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖以形成海藻糖，所述的酶能特異性水解所述非還原糖中海藻糖部分和其余糖基部分之間的鍵；(b)回收所得的含海藻糖和其它多糖的多糖組合物。
15.根據權利要求14所述的方法，其中將步驟(a)中的所述酶與能形成一個或多個具有海藻糖結構作為末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖的海藻糖基合成酶一起使用。
16.根據權利要求14所述的方法，其中步驟(a)還含有使葡萄糖淀粉酶作用于步驟(a)中所得溶液的步驟。
17.根據權利要求14所述的方法，其中步驟(b)還包括將步驟(a)所得溶液中的海藻糖結晶成含水或無水晶體海藻糖。
18.根據權利要求14所述的方法，其中所述糖基部分由一個或多個葡萄糖殘基組成。
19.一種制備含海藻糖的組合物的方法，包括(a)使權利要求1所述的酶與海藻糖基合成酶一起作用于含一種或多種葡萄糖聚合度為3或更高的還原性淀粉部分水解物以形成海藻糖，所述海藻糖基合成酶能形成具有海藻糖結構作一個末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖；(b)回收帶有或不帶有其它多糖的所得的海藻糖；(c)將帶有或不帶有其它多糖的海藻糖摻入物質構成組合物。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述的組合物是食品。
21.根據權利要求19所述的方法，其中所述的組合物是化妝品組合物。
22.根據權利要求19所述的方法，其中，所述的組合物是藥物組合物。
23.一種降低還原性淀粉部分水解物的葡萄糖聚合度而不增加其還原能力的方法，包括步驟使權利要求1所述的酶和海藻糖基合成酶一起作用于含一種或多種葡萄糖聚合度為3或更高的還原性淀粉部分水解物的溶液，所述的海藻糖基合成酶能形成一種或多種具有海藻糖結構作為一個末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖。
全文摘要
本發明公開了一種新型嗜酸耐熱海藻糖基水解酶及其制備和用途,該酶可以從埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬、酵母屬的微生物中獲得,能夠在高溫酸性條件下高效水解具有海藻糖結構作為一個末端單位且葡萄糖聚合度為3或更高的非還原多糖中,海藻糖部分和其余糖基部分之間的鍵。該酶分子量約55000到65000道爾頓;等電點約為5.5到6.6。該酶很容易通過微生物發酵大量制備,并用于工業化制備海藻糖。該海藻糖可廣泛地用于食品、化妝品和藥品組合物中。
文檔編號C12N1/20GK1364899SQ0110041
公開日2002年8月21日 申請日期2001年1月10日 優先權日2001年1月10日
發明者吳襟, 陳煒 申請人:中國科學院微生物研究所