一種利迪鏈霉菌發酵液中抗真菌活性物質的分離純化方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種利迪鏈霉菌發酵液中抗真菌活性物質的分離純化方法。
【背景技術】
[0002]據FAO統計，全世界農林業中每年因蟲害、病害和雜草危害造成的損失占總產值的37%，真菌病害占據各種病害之首，損失額高達1260億美元，相當于中國農業總產值的一半。我國是一個農業大國，農業生產是國民經濟中的重要組成部分，而農作物的病蟲害又是影響農業豐產的重要生物學因子，因此用于防治植物病蟲害的農藥在農業生產中起著至關重要的作用。
[0003]化學農藥在病蟲草害的防治上一直居于主導地位，但化學農藥的使用越來越顯現出以下幾個方面的問題:高毒性，殺滅病原物的同時也殺傷害蟲天敵及其它有益生物；高殘留，化學農藥對土壤、水體和大氣的污染，農副產品中農藥殘留增加；抗藥性，化學農藥長期大量的使用致使病原物及害蟲改變代謝途徑產生抗藥性等。因此，生物農藥的開發和應用已成為全球農藥產業發展的新趨勢，其綠色、環保、節能等優越特性比以往任何時期都更加受到世界各國的重視，成為生物技術領域的研究熱點。
[0004]鏈霉菌是一種分布及其廣泛的革蘭氏陽性菌，呈類似于真菌的纖維狀，幾乎60%的應用于農業的生物活性物質均來源于鏈霉菌。因此鏈霉菌被公認為在農業上極具應用潛力的工業微生物。生物活性物質是生物包括微生物、動植物在內在其生命活動過程中所產生的(或由其它方法獲得的)能在低微濃度下有選擇性地抑制或影響其它生物機能的有機物質，含量一般占發酵液的0.1%-5% (w/v)，有些更低，因此選用合理有效的分離純化技術，是成功獲取聞純度抗生素的關鍵。
[0005]目前已有許多學者在進行抗真菌活性物質分離純化的研究。2009年隋琴等人通過乙醇提取、吸附柱層析、娃膠柱層析、制備型HPLC從Streptomyces lydicus AO2的發酵液中分離純化出具有廣譜抗真菌活性的那他霉素；2011年穆凌霄等人通過酸沉淀、大孔樹脂SP825L吸附柱層析、娃膠柱層析、Sephadex LH 一 20凝膠柱層析從Streptomyces tz92的發酵液中分離純化出嘧肽霉素；2011年張楠等人通過大孔樹脂X-5吸附柱層析、硅膠柱層析、制備型HPLC從Streptomyces hygroscopicus BS-112的發酵液中分離純化出抗真菌的Tetramycins A和B。2010年梁雪琴等人通過殼聚糖絮凝處理、酸沉淀、大孔樹脂吸附層析、離子交換層析、制備型HPLC從Bacillu.sp N-23的發酵液中分離純化出一種核苷嘧啶類抗真菌抗生素。Streptomyces lydicus E12是從海南省的土壤中篩選出來的一株放線菌,其發酵液對植物病原真菌(立枯絲核和灰葡萄孢等)具有明顯的抑制作用，但對其抗真菌活性成分的分離純化研究較少。

【發明內容】

[0006]本發明需要解決的技術問題是提供一種工藝簡單、成本低廉、操作簡便、產品純度高的利迪鏈霉菌發酵液中抗真菌活性物質的分離純化方法。
[0007]—種利迪鏈霉菌發酵液中抗真菌活性物質的分離純化方法，包括如下步驟:
[0008](I)將利迪鏈霉菌S.lydicus E9保藏號為CGMCC N0.3075的發酵液在4000-5000rpm的轉速下離心10_20min，收集上清液，按比例在IL上清液中加入4_8g絮凝劑，攪拌混勻后在0-4°C靜置10-12h，真空抽濾收集濾液；所述絮凝劑是由質量比為0.6:1:I的亞鐵氰化鉀，硫酸鋅和硼砂組成；
[0009](2)濾液經裝填有型號為Dia1n HP-20的大孔樹脂的層析柱進行吸附層析，用1-2倍柱體積的體積濃度為40%-60%的甲醇水溶液沖洗所述層析柱以除去色素和未吸附的雜質，再用3-5倍柱體積的體積濃度為50%-80%的乙醇水溶液洗脫活性成分，分管收集洗脫液，檢測其抗真菌活性；
[0010](3)合并步驟(2)中收集的抗真菌活性組分并減壓濃縮至原體積的1/3-1/2，得活性濃縮液；
[0011](4)活性濃縮液經裝填有型號為Sephadex LH20的葡聚糖凝膠的層析柱進行分子篩層析，用1-2倍柱體積的體積濃度為60%的乙醇水溶液洗脫，分管收集洗脫液，檢測其抗真菌活性，收集抗真菌活性組分。
[0012]步驟(I)中的離心的轉速優選為4500rpm，離心的時間為1min。
[0013]步驟(2)中所述甲醇水溶液的體積濃度優選為50%，用量為2倍柱體積。
[0014]步驟(2)中乙醇水溶液的體積濃度優選為60%，用量為5倍柱體積。
[0015]步驟(2)的層析柱的裝柱體積優選為15-25ml、柱高徑比為8:1_15:1，上樣流速為1-1.5ml/min,洗脫流速為 0.3-0.6ml/min。
[0016]步驟(3)優選為:合并步驟(2)中收集的抗真菌活性組分并減壓濃縮至原體積的1/3,得活性濃縮液。
[0017]步驟(4)的層析柱的裝柱體積優選為80_100ml，柱高徑比為10:1_20:1，上樣流速為 0.1-0.3ml/min,洗脫流速為 0.1-0.3ml/min。
[0018]本發明的優點是:
[0019]1.分離純化流程簡單快速、操作方便、成本低廉。
[0020]2.三廢排放較少，對環境友好。
[0021]3.純化過程溫和，抗真菌活性物質的純度較高。
[0022]4.選用低毒性、低沸點的乙醇作為洗脫劑，后續回收處理簡單；分離時間較短。
【附圖說明】
[0023]圖1為實施例2中絮凝處理后的發酵液與原始發酵液抗真菌活性的對比。
[0024]圖2為實施例2中吸附柱層析收集到的組分的抗真菌活性檢測結果。分管收集并按收集順序依次編號后，每管取1ul滴加到PDA平皿的病原真菌菌絲塊周圍，28°C恒溫培養12h，記錄結果。對照分別為絮凝后的發酵液(CK)、50%甲醇(50%甲)和60%乙醇(60%乙)。
[0025]圖3為實施例2中分子篩層析收集到的組分的抗真菌活性檢測結果。分管收集并按收集順序依次編號后，每管取1ul滴加到PDA平皿的病原真菌菌絲塊周圍，28°C恒溫培養12h,記錄結果。
[0026]圖4為實施例2中分子篩層析收集到的抗真菌活性組分的LC-MS圖。LC-MS條件為LCQ Deca XP MAX四級桿離子肼質譜檢測器(Thermo Finnigan，CA，USA)，色譜柱為XBPC18column(150mm, 2.lmm;Agela Technologies)，流動相為乙臆:水(35:65)，流速 0.2ml/min0
【具體實施方式】
[0027]下面的實施例是為了使本領域的技術人員能夠更好地理解本發明，但并不對本發明作任何限制。
[0028]利迪鏈霉菌StMptomyces lydicus E9于2009年5月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，并已存活。保藏機構地址:北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵政編碼:100101，電話:,保藏號為CGMCC N0.3075。以下簡稱利迪鏈霉菌S.lydicus E9保藏號為CGMCC N0.3075。
[0029]實施例1
[0030]取_40°C保存的菌種(利迪鏈霉菌S.lydicus E9保藏號為CGMCC N0.3075)接種于裝有50mL種子培養基的250mL搖瓶中，220rpm、28°C回旋式搖床培養48h，得到一級種子。將一級種子以10% (v/v)接種于裝有10mL種子培養基的250mL搖瓶中，220rpm、28°C回旋式搖床培養24h,得到二級種子。將二級種子混勻后，4500rpm離心1min,用同等體積的無菌水重懸，然后按10% (v/v)的接種密度接種到裝有3L發酵培養基的5L發酵罐中，在28°C，攪拌轉速500rpm,通氣量2vvm,pH自然,發酵18h即可卸罐,收集發酵液用于抗真菌活性物質的分離純化。
[0031]種子培養基(g/L)的組成如下，淀粉30，葡萄糖5，酵母粉4，蛋白胨2，K2HPO4L 5，Mg2SO4.7Η200.5，NaCl0.5，余量為水，pH 自然，121°C蒸汽滅菌 20min。
[0032]發酵培養基(g/L)的組成如下，淀粉40，葡萄糖5，蛋白胨2，K2HPO4L 0，Mg2SO4.7Η200.5，NaCl0.5，余量為水，pH 自然，121°C蒸汽滅菌 20min。
[0033]實施例2
[0034]一種利迪鏈霉菌發酵液中抗真菌活性物質的分離純化方法，包括如下步驟:
[0035](I)將利迪鏈霉菌S.lydicus E9保藏號為CGMCC N0.3075的發酵液在4500rpm的轉速下離心1min,收集上清液,檢測其抗真菌活性,按比例在IL上清