鐵皮石斛破損蒴果種子瓶播組培方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術和組織培養領域，特別涉及鐵皮石斛破損蒴果種子瓶播組培 方法，利用回收破損蒴果進行消毒處理和種子瓶播育苗，是一種工廠化生產鐵皮石斛育苗 技術的新型方法。
【背景技術】
[0002] 鐵皮石斛為蘭科多年生附生草本植物，具有重要的觀賞價值、藥用價值和食用價 值。目前，鐵皮石斛自然狀態下的無性分蘗繁殖和有性種子繁殖系數都很低，無法滿足鐵 皮石斛工廠化育苗需求，只有通過組織培養的方法進行無性繁殖（比如取根、莖、葉、等器 官組培繁殖）或是種子瓶播繁殖育種苗，其中種子瓶播繁殖是目前工廠化育苗的最常用方 式。
[0003] 鐵皮石斛種子瓶播繁殖一般都是通過采收成熟的蒴果來進行表面消毒后，取出果 內無菌種子來進行組培擴繁，要求蒴果外表無破損才能進行常規方法消毒。常規消毒方法 一般為液態消毒溶液，鐵皮石斛種子為粉末狀且輕于水，蒴果破損后種子只會漂浮在消毒 溶液上面，就算按照常規消毒的方法進行，也無法大量從消毒液中取出種子和清洗種子表 面殘留消毒溶液。本發明涉及的方法能夠大量高效處理破損的蒴果，同時能完全消毒鐵皮 石斛種子且不影響瓶播后的正常生長，種子脫菌率可達90%以上。鐵皮石斛蒴果較貴，一顆 種子要幾十元到一百元左右，該方法能夠減少蒴果用量，相當于減少生產成本，經濟效果顯 著。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的在于：針對上述存在的問題，提供鐵皮石斛破損蒴果種子瓶播組培 方法，能夠大量高效處理破損的蒴果，同時能完全消毒鐵皮石斛種子且不影響瓶播后的正 常生長，種子脫菌率可達90%以上。
[0005] 本發明采用的技術方案如下：
[0006] 鐵皮石斛破損蒴果種子瓶播組培方法，包括以下步驟：
[0007] 1)破損蒴果消毒前預處理：用棉花團蘸取濃度為75%的乙醇擦拭蒴果表面，避開 蒴果開裂處，待乙醇自然揮發后，打開蒴果，取粉末狀種子均勻地鋪開在消毒容器內；
[0008] 2)種子用紫外線燈消毒：將含有鐵皮石斛種子的消毒容器，放置在實驗或生產用 的無菌操作臺上，風速調至最低速檔位并打開紫外燈，紫外線照射1~2h ;
[0009] 3)消毒后種子的瓶播育苗：將步驟2)消毒后的鐵皮石斛種子均勻撒播抗菌種子 萌發培養基上，2~3周后，種子萌發成原球，3個月后原球莖分化帶有1~3片小葉的小苗， 并統計種子萌發成活率；所述抗菌種子萌發培養基為MS+0. 5~lmg/L NAA+10~40mg/L異 噻唑啉啁+30g/L蔗糖+7. 2g/L瓊脂粉；
[0010] 4)生根壯苗培養：將步驟3)種子萌發得到的苗，轉移到生根壯苗培養基內生長，2 個月后觀察并記錄生長狀況。
[0011] 作為本發明優選方案，步驟2)中紫外線照射為1.5h。
[0012] 作為本發明優選方案，步驟3)中所述異噻唑啉卩同的濃度為15~40mg/L。
[0013] 作為本發明的優選方案，步驟3)中所述生根壯苗培養基為每升含蛋白胨2. 5g、 水解酪蛋白〇. 2g、鹿糖30g、瓊脂4. 5g、a -萘乙酸3mg、肌醇60mg、鹽酸硫胺12mg、甘氨酸 4. Omg、煙酸2. 5mg、D_泛酸f丐2. Omg、抗壞血酸1. Omg、批卩多辛鹽酸1. 5mg、生物素0. 20mg、香 蕉勻漿60g、胡蘿卜汁40g、蘋果汁40g、馬鈴薯汁30g，其余為MS培養基中的大量元素和微 量元素成分。
[0014] 進一步地，在上述3)~4)各步驟中所用的培養基均為pH 5. 4~6. 2,培養溫度 29°C，光照強度18001x，光照時間llh/d。
[0015] 現對上述技術方案做進一步說明：
[0016] 紫外線消毒時間為1.0~2.0小時內。該時間內，操作人員應該離開紫外燈的照 射范圍。鐵皮石斛種子很輕，使用的無菌操作臺要在低檔位的風速下進行消毒，同時操作人 員動作要輕，避免種子飄散。
[0017] 種子在承載容器內要均勻鋪開，種子沒有過多的堆積。一般要薄薄一層為宜。由 于一個鐵皮石斛蒴果內種子可多達10萬以上，如果承載容器不夠大，可以分1到2次消毒， 如果蒴果破損嚴重，可以省去酒精擦拭蒴果表面的步驟，而且可以同時在一個容器中消毒 幾顆破損嚴重的蒴果。
[0018] 配套的萌發培養基配有抗菌成分，濃度能有效減少瓶播污染，且對鐵皮石斛種子 生長沒有影響。
[0019] 紫外線消毒，原理為：當紫外線照射到微生物時，便發生能量的傳遞和積累，積累 結果造成微生物的滅活，從而達到消毒的目的。當細菌、病毒吸收超過3600~65000UW/C m 2劑量時，對細菌、病毒的去氧核醣核酸（DNA)及核醣核酸（RNA)具有強大破壞力，能使細 菌、病毒喪失生存力及繁殖力進而消滅細菌、病毒，達到消毒滅菌成效。紫外線一方面可使 核酸突變、阻礙其復制、轉錄封鎖及蛋白質的合成；另一方面，產生自由基可引起光電離，從 而導致細胞的死亡。
[0020] 異噻唑啉酮，其抗菌原理是：通過斷開細菌蛋白質的鍵而起殺生作用的。與微生物 接觸后，能迅速地不可逆地抑制其生長，從而導致微生物細胞的死亡，故對常見細菌、真菌、 藻類等具有很強的抑制和殺滅作用。殺生效率高，降解性好，具有不產生殘留、操作安全、配 伍性好、穩定性強、使用成本低等特點。
[0021] 綜上所述，本發明的有益效果：本發明處理鐵皮石斛破損蒴果種子的方法可以減 少工廠化生產中對鐵皮石斛蒴果的使用量，能提高種子的利用率，提高產量和減少生產成 本；能夠大量高效處理破損的蒴果，同時能完全消毒鐵皮石斛種子且不影響瓶播后的正常 生長，種子脫菌率可達90%以上。
【具體實施方式】
[0022] 下面結合一些實施例來對本發明做進一步闡述：
[0023] 實施例1
[0024] 破損蒴果種子瓶播組培方法包括以下步驟：
[0025] 1)破損蒴果消毒前預處理：用棉花團蘸取濃度為75%的乙醇擦拭蒴果表面，避開 蒴果開裂處，待乙醇自然揮發后，打開蒴果，取粉末狀種子均勻地鋪開在消毒容器內；
[0026] 2)種子用紫外線燈消毒：將含有鐵皮石斛種子的消毒容器，放置在實驗或生產用 的無菌操作臺上，風速調至最低速檔位并打開紫外燈，紫外線照射lh ;
[0027] 3)消毒后種子的瓶播育苗：將步驟2)消毒后的鐵皮石斛種子均勻撒播抗菌種子 萌發培養基上，2~3周后，種子萌發成原球，3個月后原球莖分化帶有1~3片小葉的小苗， 并統計種子萌發成活率；所述抗菌種子萌發培養基為MS+(0. 5~l)mg/L NAA+10mg/L異噻 唑啉啁+30g/L蔗糖+7. 2g/L瓊脂粉；
[0028] 4)生根壯苗培養：將步驟3)種子萌發得到的苗，轉移到生根壯苗培養基內生長， 2個月后觀察并記錄生長狀況。所述生根壯苗培養基為每升含蛋白胨2. 5g、水解酪蛋白 0? 2g、鹿糖30g、瓊脂4. 5g、a -萘乙酸3mg、肌醇60mg、鹽酸硫胺12mg、甘氨酸4. Omg、煙酸 2. 5mg、D-泛酸興2. Omg、抗壞血酸1. Omg、批卩多辛鹽酸1. 5mg、生物素0. 20mg、香蕉勻楽60g、 胡蘿卜汁40g、蘋果汁40g、馬鈴薯汁30g，其余為