專利名稱：用分泌殺菌劑的細菌抑制硫酸鹽還原菌介導的降解作用的方法
技術領域：
本發明涉及通過使用分泌殺菌化學物質的細菌來防止或抑制易降解的表面發生降解的領域。具體地，本發明涉及可天然地或通過使用重組技術而分泌化學物質的細菌的用途，這些化學物質可抑制硫酸鹽還原菌在金屬、混凝土、灰漿或其他會發生腐蝕或降解的表面上的生長。
背景技術：
降解和腐蝕破壞在全世界都造成巨大的損失。僅在美國，腐蝕破壞造成的年損失估計相當于國民生產總值的4.2％(Martinez，L.J.Metals.4521(1993)(以下簡稱為Martinez，1993))。通過更好地和更廣地使用防腐蝕技術，可以大大減少這些巨大的損失。
微生物對降解和腐蝕破壞起了很大作用。當表面(尤其是金屬)暴露于自然環境時，它們會被散裝液相中的需氧菌快速占據(Geesey，G.G.，What isbiocorrosion？Presented at the International workshop on industrial biofouling andbiocorrosion，Stuttgart，Germany，Springer-Verlag，New York(1990)(以下簡稱Geesey，1990))。該生物膜的上層是需氧的，而在靠近金屬表面的區域因生物膜的耗氧作用而是缺氧的(Blenkinsopp，S.A.等人，Trends.Biotechnol.9138-143(1991)；Bryers，J.D.等人，Biotech.Prog.357-67(1987))。硫酸鹽還原菌(SRB)可在這些缺氧的生態小境中定居，并因此即使在有氧環境中也造成腐蝕(Hamilton，W.A.＂硫酸鹽還原菌及其在生物腐蝕中的作用＂，Presented at theInternational workshop on industrial biofouling and biocorrosion，Stuttgart，Germany，Springer-Verlag，(1990)(以下簡稱Hamilton，1990))。
在大量不同環境中的金屬劣化過程中都涉及SRB(Borenstein，S.W.Microbiologically influenced corrosion handbook，Woodhead Publishing Limited，Cambridge，England(1994)(以下簡稱Borenstein，1994)；Hamilton，W.A.Ann.Rev.Microbiol.39195-217(1985)(以下簡稱Hamilton，1985)；Hamilton，W.A.Trends.Biotechnol.136-40(1983)；Hamilton 1990)。在石油和船運業的管線和海上石油鉆機(Hamilton，W.A.Trends.Biotechnol.136-40(1983))，在工業系統中的冷卻水再循環系統(Borenstein，1994；Miller，J.D.Metals.p.150-201，在Rose，A.H.編輯的Microbial Deterioration，Academic Press，New York(1981))(以下簡稱Miller，1981)，污水處理設備和管線(Hamilton，1985；Odom，J.M.ASM NEWS，56473-476(1990))，在航空業中的噴氣機燃料箱(Miller，1981)，以及發電業(Licina，G.J.Mater.Perform.2855-60(1989))(以下簡稱Licina，1989)都因為SRB的生長和定居而受害。SRB可導致大量不同的金屬腐蝕，例如低級碳素鋼(如Borshchevskii，A.M.等人，Prot.Metals，30313-316(1994)；Cheung，C.W.S.和Beech，I.B.，Biofouling，9231-249(1996)(以下簡稱Cheung和Beech，1996)；Dubey，R.S.等人，Ind.J.Chem.Tech.2327-329(1995)；Gaylarde，C.C.Int.Biodet.Biodeg.30331-338(1992)(以下簡稱Gaylarde，1992)；Lee等人，Biofouling 7197-216(1993)；)、不銹鋼(Benbouzid-Rollet，N.等人，J.Appl.Bacteriol.71244-251(1991)；Mollica，A.Int.Biodet.Biodeg.29213-229(1992)；Newman，R.C.等人，ISIJ International.3201-209(1991)；Oritz等人，Int.Biodet.26315-326(1990))和銅合金(Licina，1989；Wagner，P.和Little，B.Mater.Perform.3265-68(1993)(以下簡稱Wagner和Little，1993))，所有這些金屬都是在加工、船舶運輸和電力產業中經常使用的。SRB還對世界基礎設施的非金屬部分造成很大的破壞。SRB產生硫化氫，硫化氫會接著被硫氧化性生物如硫桿菌(Thiobacillus)代謝而生成硫酸。已發現，因細菌而導致的硫酸降解會顯著縮短供水系統中混凝土管道的使用壽命。據估計，僅在金屬方面由SRB造成的腐蝕損失在美國相當于每年約40-60億美元(Beloglazov，S.M.等人，Prot.Met.USSR.27810-813(1991))(以下簡稱Beloglazov，1991)。
傳統的抑制腐蝕的策略包括對安裝設備的土壤的pH、氧化還原電位和電阻加以改變(Iverson，W.P.Adv.Appl.Microbiol.321-36(1987)(以下簡稱Iverson，1987))，使用無機涂層、陰極保護和抗微生物劑(Jack，T.R.等人，Controlin Industrial Settings，p.265-292，Barton，L.L.(編)，Sulfate-reducing Bacteria，Plenum Press，New York(1995))(以下簡稱Jack等人，1995)(Barton的全部文獻都在此引用作為參考)。無機保護涂層如涂料和環氧涂料在過去已經被廣泛使用；但是它們不是永久性的，而且維持和替換它們的成本都是很高的(Jayaraman，A.等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.4762-68(1997)(以下簡稱Jayaraman，1997a)；Martinez，1993)。對于陰極保護，是通過將金屬表面偶連于鎂或鋅制成的犧牲陽極，或通過耐腐蝕的陽極從外部電源供應強制電流，從而在金屬表面上激發陰極反應。化學電流或強制電流降低了金屬表面上各處的電化學電位，使得金屬陽離子不形成，因而不發生溶解((Iverson，1987)；Little，B.J.等人，材料性能(Mater.Perform.)3216-20(1993))。然而，Wagner和Little(1993)報道，使用高達-1074mV之內的陰極電位還不能防止形成生物膜。
抗微生物劑(biocide)也已經被用于延緩密閉系統如冷卻塔和儲藏罐中的腐蝕反應(Iverson，1987)，并且可能是最常用的對抗生物腐蝕的方法(Boivin，J.材料性能(Mater.Perform.)3465-68，1995)(以下簡稱Boivin，1995)；Brunt，K.D.Biocides for the oil industry，p.201-207，in Hill.，E.C.，Shennan，J.L.，Watkinson，R.J.(編)，Microbial Problems in the Offshore Oil Industry，John Wiley and Sons，Chichester，England(1986)；Cheung，C.W.S.等人，Biofouling，9231-249(1996)(以下簡稱Cheung，1996)。Saleh等人(J.Appl.Bacteriol.27281-293(1964)(以下簡稱，Saleh等人，1964)綜述了使用近200種對SRB有殺菌或抑菌作用的化合物。氧化性抗微生物劑如氯氣、氯胺和含氯化合物被用于自來水系統(Boivin，1995，同上)。含氯化合物是最實用的抗微生物劑；然而，它們的活性取決于水的pH以及光和溫度條件(Keevil，C.W.等人，Int.Biodet.26169-179(1990)(以下簡稱Keevil等人，1990))，而且它們對于生物膜細菌并不十分有效(Boivin，1995，同上)。非氧化性抗微生物劑如季銨鹽(Beloglazov，1991)、胺類型的化合物、蒽醌類(Cooling III，F.B.等人，Appl.Environ.Microbiol.622999-3004(1996))(以下簡稱Cooling等人，1996)和醛類(Boivin，1995)是最穩定的并且能夠在不同環境中使用。使用這些抗微生物劑有許多嚴重的缺點，不僅包括抗微生物劑本身的成本高，還包括將大量無機化合物釋放入供水中而導致的環境處理成本高。
在材料表面上的生物膜結構還造成了另一問題。糖萼(glycocalyx)(Brown，M.L.等人，應用環境微生物學(Appl.Environ.Microbiol.)61187-193(1995)；Hoyle，B.D.等人，J.Antimicrob.Chemother.261-6(1990)；Suci，P.A.等人，Antimicrob.Agents.Chemother.382125-2133(1994))和在生物膜中發生的表型變化，例如P.aeruginosa中algC基因的表達(Costerton，W.J.等人，Ann.Rev.Microbiol.49(711-745)(1995))(以下簡稱Costerton，1995)，以及表面化學物質對生物膜代謝狀態的影響(Keevil等人，1990)，這些都會導致生物膜中的生物體對于抗微生物劑的抗性的增加超過了對浮游菌所觀察到的抗性(Brown，M.R.W.等人，J.Appl.Bacteriol.Symp.Suppl.7487S-97S(1993))。將有機的膜腐蝕抑制劑(一種聚丙烯酸酯/磷酸酯)和兩種抗微生物劑合用，已成功地控制了冷卻水系統中的腐蝕(Iverson，同上)。然而，SRB天生對于大量不同的抗菌劑有抗性(Saleh等人，1964，同上)，并且，SRB茁壯生長的惡劣的厭氧環境(由腐蝕產物所造成)也降低了抗菌劑的效力(Cheung，1996；Iverson，同上)。一旦SRB牢固定居于它們的小生態環境中，那么不進行拆卸就難以將它們從系統中清除掉(Boivin，1995，同上)。
其他控制微生物誘導的腐蝕的策略是通過控制養分的利用度來抑制最有害微生物的生長，從而產生更良性的生物膜(Jack等人，1995)。最近，Jansen和Kohnen(J.Ind.Microb.，15，391-396(1995))報道了，通過將銀離子與表面離子性地結合而修飾聚合物表面，可降低表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)KH6對表面的粘附，這提示可開發抗微生物的聚合物來防止細菌粘附。Wood，P.等人，(1996)(應用環境微生物學(Appl.Environ.Microbiol.)622598-2602)報道了通過催化在表面生成單過硫酸鉀和過氧化氫，可使這些抗微生物劑對P.aeruginosa生物膜的活性增加150倍。該方法依賴于用必要的化學物質滲透過塑料，并且需要在制造工藝進行廣泛的、根本性和昂貴的改變才能實施。
最后，其他研究者的工作提示(Pedersen和Hermansson，Biofouling，1313-322(1989)，和Biofouling 31-11(1991))，并且我們自己的工作最近證實(Jayaraman等人，1997a和Jayaraman等人，J.Ind.Microb.18(396-401)(1997)(以下簡稱Jayaraman等人，1997b)，生物膜中的需氧細菌可抑制金屬的電化學腐蝕2-40倍，這部分可能是因為金屬上生物膜中呼吸的細菌用掉了一部分原本會用來氧化金屬的氧氣。然而，如上所述，氧氣濃度的下降也增加了厭氧性的SRB在金屬上定居的機會。因此，事實上，作為抑制電化學腐蝕的手段，生物膜的效率因隨后SRB相關腐蝕的增加而下降。
本領域需要的是一種有效而價廉的防止或抑制SRB所造成的腐蝕或降解的手段，并且可減少毒性物質向環境的排放。本發明提供了這些以及其他好處。
發明概述本發明涉及通過使用分泌殺菌化學物質的細菌來防止或抑制腐蝕的領域。具體地，本發明涉及可天然地或通過使用重組技術而分泌化學物質的細菌的用途，這些化學物質可抑制硫酸鹽還原菌在金屬、混凝土、灰漿或其他會發生腐蝕或降解的表面上的生長。
本發明提供了一種抑制SRB在易腐蝕或降解的材料上生長的方法。該方法包括向易腐蝕或降解的材料上施用細菌，該細菌分泌數量足以抑制SRB在材料上生長的化學物質。易腐蝕的材料可以是金屬如鐵、鋁、鎳、銅或其他合金。例如，金屬可以是軟鋼或各種不銹鋼中的一種。易降解材料可以是諸如混凝土、鋼筋混凝土或水泥之類的材料。細菌可以是需氧的，而且可以來自例如假單胞菌屬或芽孢桿菌屬。細菌分泌的化學物質可以是野生型的該細菌物種通常不分泌的物質，而且可以是抗生素如短桿菌肽S、indolicidin、多粘菌素(polymixin)或殺細菌素(bactenecin)，可以是聚氨基酸如聚天冬氨酸或聚谷氨酸，或者可以是鐵載體(siderophore)。
本發明還提供了一種抑制腐蝕的系統，它包括在表面上有生物膜的易腐蝕或降解的材料，其中該生物膜包含細菌，該細菌分泌數量足以抑制SRB在材料上的生長的化學物質。易腐蝕的材料可以是金屬，例如在上一段落中提及的那些種類。易降解材料可以是諸如水泥、混凝土或鋼筋混凝土之類的材料。細菌可以是需氧的，尤其是假單胞菌屬或芽孢桿菌屬。細菌分泌的化學物質可以是野生型的該細菌物種通常不分泌的物質，而且可以是抗生素如短桿菌肽S、indolicidin、多粘菌素(polymixin)或殺細菌素(bactenecin)，可以是聚氨基酸如聚天冬氨酸或聚谷氨酸，或者可以是鐵載體。
附圖簡述


圖1indolicidin和殺細菌素的克隆和表達。S＝絲氨酸，A＝丙氨酸。僅示出了相關的限制性位點。
圖1a用于克隆和分泌indolicidin和殺細菌素的表達系統的示意圖。
圖1b用于克隆indolicidin的互補寡核苷酸。
圖1c用于克隆殺細菌素的互補寡核苷酸。
圖2克隆和表達具有保護性pro-芽孢桿菌RNA酶(pro)區域的殺細菌素。
圖2a用于克隆和分泌pro-殺細菌素的表達系統的示意圖。單字符的氨基酸縮寫表示了pro-區域和殺細菌素基因。SP表示堿性蛋白酶信號肽。
圖2b克隆pro-殺細菌素的有關核苷酸。S＝絲氨酸，A＝丙氨酸。
僅示出了相關的限制性位點。圖3304不銹鋼在含下列雙培養物(除了對照)的改良型Baar氏培養基中的阻抗譜枯草桿菌BE1500[攜帶質粒pBE92(不存在SRB(空心方塊)和存在SRB(實心方塊))，攜帶pBE92-Ind(indolicidin)(實心菱形)、攜帶pBE92-Bac(殺細菌素)(空心三角)和攜帶pBE92-ProBac(帶pro區域的殺細菌素)(空心圓圈)]和對照的細菌P.fragi K(實心六角形)，與代表性的SRB D.Vulgaris構成的雙培養物。數據來自代表性的試驗。
圖3aY軸阻抗的對數，X軸頻率(赫茲)圖3bY軸相角(度)，X軸頻率(赫茲)對圖3-9中阻抗譜的解釋說明電化學阻抗頻譜術是材料科學中一種研究腐蝕的技術。在圖3-9中每圖的上圖(“a”圖)是所述金屬在一定頻率范圍內的的阻抗的對數圖，如圖所示進行處理。在低頻處的阻抗平臺被稱為極化阻抗，它與腐蝕速率成反比；因此，如果在低頻處的阻抗上升，就反映腐蝕速率下降。當儀器掃過圖中所示的頻率范圍時，圖中被認為與腐蝕研究有關的部分是在最低頻率處的數據。因此，在試驗中對腐蝕速率改變的影響是通過圖中最左側所示的數據加以確定的。因為“a”圖的Y軸是log函數的數值，因此Y軸上各數值間的差異反映了10倍差異。
所以，在代表性曲線上數據點的相對位置上的小差別就反映了腐蝕速率的大差別。關于極化阻抗、阻抗譜和測量腐蝕情況的其他技術的更多信息，可見Baboian，R.編，腐蝕測試和標準應用和解釋(CorrosionTest and StandardsApplication and Interpretation)，American Societyfor Testing and Materials，Philadelphia(1995)。
各圖中的下圖(“b”圖)是阻抗響應的相移位圖。這些圖證實了每個試驗中在“a”圖中的阻抗反映了單一的時間常數并且在低頻處的阻抗平臺是極化阻抗。
在所有的圖3-9(“a”和“b”圖)中，X軸是頻率(Hz)。圖4上圖和下圖304不銹鋼在含下列雙培養物的改良型Baar氏培養基中的阻抗譜枯草桿菌WB600[攜帶質粒pBE92(不存在SRB(空心方塊)和存在SRB(實心方塊))，攜帶pBE92-Ind(indolicidin)(實心菱形)、攜帶pBE92-Bac(殺細菌素)(空心三角)和攜帶pBE92-ProBac(帶pro區域的殺細菌素)(空心圓圈)]和細菌P.fragi K(實心六角形)，“SRB”表示代表性的SRB D.Vulgaris。數據來自一次試驗。
圖4aY軸阻抗的對數，X軸頻率(赫茲)圖4bY軸相角(度)，X軸頻率(赫茲)圖5上圖和下圖304不銹鋼在含下列雙培養物的改良型Baar氏培養基中的阻抗譜多粘芽孢桿菌(B.polymyxa)[攜帶質粒pBE92(不存在SRB(空心三角)和存在SRB(實心三角))，攜帶pBE92-Bac(殺細菌素)(空心方塊)和對照細菌P.fragi K(實心六角形)，與代表性的SRBD.Vulgaris構成的雙培養物。數據來自代表性的試驗(兩次獨立的試驗)。
圖5aY軸阻抗的對數，X軸頻率(赫茲)圖5bY軸相角(度)，X軸頻率(赫茲)圖6上圖和下圖SAE 1018軟鋼在改良型Baar氏培養基中的阻抗譜，并且在加入SRB之前和之后將抗微生物的純氨芐青霉素加至P.fragiK。對照的P.fragi K培養物空心圓圈。P.fragi和SRB(D.vulgaris)實心菱形。P.fragi和SRB，并且在SRB后加入氨芐青霉素實心三角。P.fragi，并且在SRB前加入氨芐青霉素空心方塊。數據來自代表性的試驗(來自最少兩次獨立試驗)。
圖6aY軸阻抗的對數，X軸頻率(赫茲)圖6bY軸相角(度)，X軸頻率(赫茲)圖7上圖和下圖304不銹鋼在改良型Baar氏培養基中的阻抗譜，并且在加入SRB之前和之后加入抗微生物的純氨芐青霉素。對照的P.fragi K培養物空心圓圈。P.fragi和SRB(D.vulgaris)實心菱形。
P.fragi和SRB，并且在SRB后加入氨芐青霉素實心三角。P.fragi，
并且在SRB前加入氨芐青霉素實心菱形。數據來自代表性的試驗(來自最少兩次獨立試驗)。
圖7aY軸阻抗的對數，X軸頻率(赫茲)圖7bY軸相角(度)，X軸頻率(赫茲)圖8上圖和下圖304不銹鋼在改良型Baar氏培養基中的阻抗譜，其中在加入SRB之前加入抗微生物的純化的短桿菌肽S，以及由重組的生物膜在原位產生短桿菌肽S。
實心圓圈對照細菌P.fragi和SRB；實心菱形P.fragi和短桿菌肽S和SRB D.vulgaris(在SRB之前加入短桿菌肽S)；空心方塊短桿菌肽S高產性的短芽孢桿菌(B.Brevis)18；實心方塊短芽孢桿菌18和SRB。數據來自代表性的試驗(來自最少兩次獨立試驗)。
圖8aY軸阻抗的對數，X軸頻率(赫茲)圖8bY軸相角(度)，X軸頻率(赫茲)圖9上圖和下圖SAE 1018軟鋼在改良型Baar氏培養基中的阻抗譜，其中在加入SRB之前加入抗微生物的純化的短桿菌肽S，以及由重組的生物膜在原位產生短桿菌肽S。圖標如圖8。數據來自代表性的試驗(來自最少兩次獨立試驗)。
圖8aY軸阻抗的對數，X軸頻率(赫茲)圖8bY軸相角(度)，X軸頻率(赫茲)詳細描述1.序言本發明提供了抑制材料降解的方法，以及用于抑制降解的系統。我們最近表明，在金屬上存在需氧生物膜可降低腐蝕2-40倍(Jayaraman等人，1997a和Jayaraman等人，1997b)。這種抑制部分可能是因為細菌的呼吸作用而降低了金屬表面上的氧氣濃度。然而，在天然環境下，這種氧氣濃度的下降也增加了硫酸鹽還原菌(SRB)在金屬上定居的機會。盡管SRB的影響在Jayaraman等人，1997a或1997b中沒有作過研究，但是預計在所報道的那些研究中SRB會大大增加腐蝕速率。因此，盡管Jayaraman等人，1997a或1997b的研究表明需氧生物膜可以作為抑制腐蝕的手段，但是他們并沒有提供如何減少SRB介導的腐蝕的有關指導。
本發明解決了這一問題，因此顯著地增加了需氧生物膜作為抑制降解手段的實用性。簡而言之，本發明涉及使用分泌抗微生物劑的細菌。現在，我們已表明，可以形成需氧細菌的生物膜，該細菌分泌抑制SRB生長的物質。這些物質可以是在生物膜中通常不存在的野生型細菌(該細菌被引入生物膜)所天然分泌的物質(包括因為突變而使物質的分泌量高于正常水平)。該細菌還可以被重組改造，從而高表達其天然分泌的物質，或者分泌野生型的該細菌品種不表達的抗微生物劑，或者兼而有之。
腐蝕是一種影響金屬的問題。但是其他材料也受到與SRB定居于材料的相關性降解的影響。SRB產生硫化氫作為它們的一種代謝產物。硫化物侵襲鐵、其合金(包括不銹鋼)，并且使銅及其合金氧化。硫化氫可以被眾多的硫氧化微生物氧化成硫酸鹽，例如產生硫酸的硫桿菌。以這種方式形成的硫酸造成了例如洛杉機的混凝土自來水管降解，并且顯著減少了混凝土的水控制系統的預期使用壽命。
盡管本發明特別適用于對抗于SRB有關的腐蝕或降解，但是本發明的方法和系統還可用于其他加劇材料腐蝕或降解的生物體。例如，諸如Hormoconisresinae之類的真菌會污染噴氣燃料并產生會加劇燃料系統中鋁合金腐蝕的有機酸。參見例如H.A.Videla，生物腐蝕手冊(Manual of Biocorrosion)(CRCLewis Pub.，New York)(1996a)，at 129.(以下簡稱“手冊”；該手冊的全部內容在此引用作為參考)。使用分泌和/或改造后分泌抗真菌物質的細菌，可以減少這種起源的腐蝕。類似地，假單胞菌在航空燃料中的生長會加劇腐蝕，而靈桿菌(Serratia marcescens)被發現是保護性的(同上，129-132)。本發明包括對靈桿菌進行遺傳工程改造，以分泌一種或多種抑制假單胞菌、SRB或其他造成腐蝕的微生物生長的抗微生物的物質。
用本方法抑制SRB介導的腐蝕或降解、以及抑制其他細菌(如假單胞菌)或真菌引起的腐蝕，是十分有利的。因為細菌可自我繁殖，因此分泌抗微生物劑的菌群會長時間自我補充。這樣，一次施用就可長期有效這與施用有機或無機化學物質相反(它們通常必須經常重復施用)。此外，生物膜自身分泌的物質會使該物質在作用點的濃度最高，這與外部施用的化學物質不同。化學物質通常必須大量施用以保證有足夠的劑量作用于SRB或其他所針對的目標生物體。此外，SRB獲得能量的機制是稍高能才有利，因此該微生物的生長可能受到不會嚴重影響其他微生物的物質所抑制。所以，周圍微生物分泌抗微生物劑能夠完全抑制或減少SRB對其他物質的抗性，使之可以通過外部施用比原本所需水平低得多的抗微生物劑和其他毒性劑來抑制SRB相關的腐蝕或降解。
本發明的一個額外優點是，即使因為液體流動或磨損而使某些地方的生物膜受損或被移去，相鄰區域不斷地供應的抑制劑會有利于暴露的金屬或其他表面被產生抑制劑的細菌重新占據。因為生物膜可快速地在暴露表面上形成(Costerton，1995)，因此細菌的明智選擇會導致將其他細菌品種排除在生物膜之外。
最后，生物膜對降解或腐蝕的抑制效應還可進一步提高，即通過單獨地引入分泌降解/腐蝕抑制性物質的細菌，或者與抗微生物劑一起引入。這類降解或腐蝕抑制性物質可包括諸如聚天冬氨酸或聚谷氨酸等多肽，以及鐵載體如parabactin和腸桿菌素(enterobactin)。
下面敘述了本發明眾多用途中的一部分，以及實施的方法。在術語定義之后，下文討論了通過使用分泌抗-SRB或抗真菌物質的微生物(包括天然分泌這些物質以及經遺傳工程改造后分泌這些物質的兩類微生物)，從而提高需氧生物膜的抗腐蝕效應的方法。此外，描述了使用抗腐蝕或抗降解物質(如多肽或鐵載體)來進一步提高抗腐蝕效應。本文還進一步描述了如何選擇用于本發明方法或系統的合適生物體以及如何確定生物體是否產生(在改變之前或之后)抑制SRB、真菌或其他目標生物體生長的物質。然后，討論了在待保護的材料被投入使用之前或之后施用生物體的方法，并且描述了該方法和系統的用途。最后，給出了實施例。
II.定義如本文所用，“軟鋼”指通常用于管道等的價廉的低級鋼。“SAE 1018鋼”是一種具體牌號的軟鋼，它符合Society of Automotive Engineers設定的產業標準。
如本文所用，“不銹鋼304”或“304不銹鋼”指一種具體牌號的符合設計產業標準的不銹鋼。
術語“金屬試樣”指小而薄的長方形或圓形的金屬。這樣的“試樣”在本領域中常規用于比較不同金屬、物質和抑制劑的腐蝕方面的特性。
如本文所用，“易腐蝕材料”包括所有會腐蝕的金屬，具體地包括鐵、鋁、鈦、銅、鎳和它們中任一種金屬的合金，包括軟鋼和不銹鋼。
“腐蝕”具體指對金屬的破壞，而“降解”指其他材料(如混凝土、水泥、灰漿等材料)的遭破壞。因此，如本文所用，“易降解材料”是因細菌相關因素而易遭破壞的非金屬材料。然而，出于描述方便，如本文所用，所有“腐蝕”也包括對非金屬材料的破壞，除非上下文另外需要。牙科植入物也可以是一種“易降解材料”。
如本文所用，“化學物質”指對造成金屬腐蝕或非金屬材料降解的微生物有生長抑制作用的化學品。該術語在本文中通常與術語“抗微生物劑”通常是同義的，但并不一定是同義的。
術語“施用”包括由人的活動所介導或協助的任何手段，通過該手段細菌與表面接觸，包括文中將細菌或含細菌的混合物接觸、噴灑、刷、澆、滴于易腐蝕或降解的材料上的合適手段。還包括，當管道、水管、冷卻塔或水系統第一次投入使用時，將分泌抗微生物物質(如抗-SRB物質)的細菌置于水流通過的例如管道、水管、冷卻塔或水系統的最初陶土(bolus)中。還包括將細菌直接置于表面，可以刮表面以便在已有的生物膜中形成一處空白處或不刮。
短語“數量足以抑制硫酸鹽還原菌生長”指數量足以減少細菌生長，并且與對照菌群相比時在統計學上是顯著的。其減少的范圍可以低至能檢測出統計學顯著差異的限度，可高至完全抑制。較佳地，抑制程度最少約10％，意味著細菌的生長比對照菌群的生長低至少約10％。更佳地，抑制程度約為30-50％。更好地，抑制程度約為50-90％。最佳地，抑制程度為90％或更高。
III.提高生物膜的抗腐蝕效應A.通過分泌抗微生物劑的細菌提高生物膜的抗腐蝕效應1.概述暴露于自然環境的表面會很快被需氧細菌所占據。金屬和其他表面會產生包裹在多糖外被(被稱為“糖萼”)中的粘結性菌群(Costerton，1995)。如“發明背景”中所述，本發明人的最近研究已證實，當生長成單培養物或“無共生”培養物時生物膜對表面有保護效應。然而，在自然界中生物體極少長成單培養物，并且因為生物膜中需氧細菌消耗氧氣而在金屬或其他材料的表面附近出現缺氧區域，這增加了硫酸鹽還原菌(SRB)定居于這些材料的機會。因此，這些細菌甚至能在有氧環境中造成腐蝕(Hamilton，1990)。
通過將一種或多種分泌抑制SRB生長的抗微生物劑的細菌引入現有的生物膜，可提高生物膜的保護作用。在一個實施例中，細菌可以是一種天然地或因突變而能天然地產生和分泌抑制SRB生長的物質的細菌。或者，該細菌可通過重組技術改造而分泌原來該物種不分泌的抗微生物劑，或者高水平地或連續地分泌通常低水平地或僅在特定時間分泌的抗微生物劑。
2.天然的細菌分泌者某些細菌天然產生的物質可有效地抑制導致腐蝕的微生物(如SRB)的生長。細菌的生物學已經被研究了數十年并已獲得了相當的知識，包括與已知分泌抗微生物劑的許多細菌有關的知識。下面進一步描述并在實施例中測試了一種這樣的細菌對SRB介導的腐蝕的抑制能力，該細菌因誘導突變而超量表達抗微生物物質-短桿菌肽S(出于本發明目的，因化學誘導突變而超量分泌某物質的細菌被認為是該物質的天然分泌者)。根據下面實施例中所述的測試方法或本領域已知的方法，可以方便地測試已知分泌抗微生物劑的其他細菌的分泌物對引起腐蝕的微生物(如SRB或真菌Hormoconis resinae)的有效性。
3.重組改變的分泌者(a)被用作分泌者的細菌并不天然產生的化學物質并不總是這樣，即能夠找到天然分泌某特定抗微生物劑的細菌，或者天然分泌用于特定用途的所需抗微生物劑的細菌，在特定暴露的特定環境中能夠旺盛生長。在這些和其他情況下，并不天然分泌有關抗微生物劑的細菌就可以用重組生物技術加以改變以分泌所需的抗微生物劑。
(b)細菌天然產生的化學物質，但是更大量或組成型地產生重組技術還可用于提高那些通常的確分泌抗微生物劑的細菌的抗-SRB腐蝕的特性，即通過用構建物轉染它們，該構建物含有可操作地連于強組成型啟動子的抗微生物劑基因，從而提高了分泌物質的數量、或者使通常不連續產生或在僅在特定環境或代謝條件下產生的抗菌物質連續地產生。該構建物還可將編碼抗微生物劑的基因置于誘導型啟動子的控制之下，從而使該物質的分泌可受控制。
(c)將DNA構建物引入細菌細胞應理解，在本領域已知道用于將DNA(包括異源DNA)引入細菌細胞的許多技術。一種代表性的方法將在下面實施例中給出。選擇將DNA引入細菌并獲得表達的具體方法，對于本發明實施并不是關鍵的。
B.選擇抗微生物物質1.抗微生物劑可由細菌產生的許多抗微生物劑是本領域中已知的。例如，乳鏈菌肽，一種由Lactococcus lactis菌分泌的34氨基酸的肽，可用作食物防腐劑。海洋細菌分泌的1700氨基酸的多肽(稱為“D2”)已表明有普遍的抗微生物活性。對目標微生物如SRB有抑制性的任何一種這些抗微生物劑，都可用于本發明。
在一優選例中，抗微生物劑是一種抗生素肽。肽抗微生物劑可以是短小的(通常10-35個氨基酸)，而且小的抗微生物劑可以比許多常規抗生素(可能需要大的操縱子或數個途徑以實現單個抗生素的表達)更容易克隆入細菌。除了上述提及的之外，大量的肽抗生素，如短桿菌肽S和D(在下面實施例中論述)是本領域中已知的。然而，如果對于有關的特定應用合適，可以使用更多的抗生素物質，只要它們可在細菌中足量地表達。
還可以使用通常不被認為是抗生素但具有抗微生物效果的其他小肽。例如，indolicidin和殺細菌素是牛嗜中性白細胞產生的陽離子型抗微生物肽，已知它對大范圍的微生物有效(關于這些化合物的詳細信息(包括相關文獻)在下面實施例中給出)。indolicidin是已知最小的抗微生物線性肽。
對具體抗微生物化合物的選擇可由技術人員作出明智的判斷，它取決于目標微生物、所選擇的分泌抗微生物劑的生物體以及使用分泌生物體的應用場合。所選定的抗微生物劑應能抑制目標生物體(例如，它必須抑制真菌生長如果目標是真菌，必須抑制假單胞菌生長如果目標生物體是假單胞菌，依此類推。在下面的實施例中，給出了確定抗微生物劑對一組生物體中各成員的抑制效應的代表性測試方法)。為了使抗微生物劑可以長時間地持續產生，選定的抗微生物劑通常應對目標生物體的抑制性高于對分泌抗微生物劑的生物體(有時被稱為“宿主生物體”，如果該生物體表達引入的基因)的抑制性。在下面實施例中給出了確定宿主生物體對抗微生物劑的敏感性的代表性測試方法。然而， 在某些情況下，可能不必連續產生抗微生物劑，可能沒有其他生物體能夠分泌某特定抗微生物劑，或者可能需要在消除或抑制目標物種的幾乎同時消除產生抗微生物劑的物種。在這些情況下，可以選擇對宿主生物體以及對目標生物體有抑制性的抗微生物劑。
最后，抗微生物劑的選擇部分取決于所需的應用。例如，indolicidin和殺細菌素是衍生自牛嗜中性白細胞的抗微生物劑。將它們釋放到環境中可能會因此導致產生至少對牛免疫系統的這些天然抗微生物劑有抗性的細菌菌株，并且可能導致產生出對人免疫系統中類似抗微生物劑有更強抗性的菌株。出于該原因，indolicidin和殺細菌素是不宜用于開放系統(即分泌性生物體或被分泌的抗微生物劑通常被釋放入環境的系統，例如水管、排水管等)的優選抗微生物劑。另一方面，這些化合物可用于封閉系統，即生物體和分泌的抗微生物劑通常不會被釋放入環境的系統。
2.抗腐蝕劑(a)多肽已知氨基酸，尤其是甘氨酸、天冬氨酸和谷氨酸可作為腐蝕抑制劑。參見例如Kalota和Silverman，Corosion 502138-145(1994)(以下簡稱Kalota和Silverman)及其引用的文獻。然而，取決于它們所處的環境，許多氨基酸傾向于具有一個以上的酸-堿常數，具有多個pK值，并且有不同的電荷。Kalota和Silverman發現低分子量的氨基酸能夠抑制依賴于pH的腐蝕，而且僅在高pH(pH≥10)時才使腐蝕速率顯著下降。
根據Kalota和Silverman，可能需要對細菌進行工程改造以分泌聚天冬氨酸、聚谷氨酸或聚甘氨酸或者由這3種氨基酸構成的多肽，以作為僅在pH約為10或更高的環境中使用的腐蝕抑制劑。盡管這可以用于某些產業用途，但是涉及如此高pH的場合數目可能有限。
我們自己的研究與Kalota和Silverman相反。我們發現，例如聚天冬氨酸和聚谷氨酸可在低至7的pH下保護金屬免受腐蝕。因此，根據我們的數據，如果細菌分泌多肽例如聚天冬氨酸和聚谷氨酸(或它們對應的酸或鹽)、聚甘氨酸或這些氨基酸的混合物，通過預計或檢測的金屬環境pH約為7或更高，那么可抑制腐蝕。因此，它提高了需氧生物膜的對腐蝕的抑制作用，如果生物膜中的生物體在pH約為7或更高時分泌這些多肽。
(b)鐵載體鐵載體如parabactin(分離自Paracoccus Denitrificans)和腸桿菌素(分離自大腸桿菌)是較低分子量的螯合劑，它們是由細菌產生和分泌，用于溶解鐵離子以便運入其細胞(McCafferty和McArdle，J.Electrochem.Soc.，1421447-1453(1995))。這些物質已經被測試過并發現能抑制鐵的腐蝕(同上)。為了提高生物膜的抗腐蝕效果，可將這些物質的基因置于強組成型啟動子的控制之下并且以高于正常的水平進行表達，或者被插入通常不表達它們的細菌中。
3.抗微生物劑、抗腐蝕劑或兩者的組合構思之中的是用于本發明的細菌可被設計成分泌一種以上的抗微生物劑。例如，在實施例中報道的一個研究涉及使用一種芽孢桿菌，它因突變而超表達短桿菌肽S并且它還經遺傳改造以產生另一種抗微生物劑。使用分泌兩種或多種抗微生物劑的細菌可能是有利的，因為它使造成腐蝕的目標菌(SRB或真菌)更難以產生抗性。
因此，分泌抗微生物劑的細菌可以經工程改造使其也產生抗腐蝕劑(例如聚天冬氨酸，聚谷氨酸、由這兩種肽構成的多肽、或parabactin、腸桿菌素或其他鐵載體)，從而提高其抑制腐蝕的能力。事實上，對細菌進行工程改造以產生抗微生物劑和抗腐蝕劑數目的限制，可能是抗微生物劑對宿主細胞的毒性作用以及代謝排放對產生分泌物的宿主細胞的毒性作用。因為不同生物體有不同的代謝效率，而且因為環境中的可利用養分可能發揮作用，因此對選定細菌能夠分泌多少種物質的確定通常是通過實驗確定。這種確定可方便地進行，即在含所需使用場合中預計會有的養分的培養基中，通過用所需的抗微生物劑和抗腐蝕劑系列地轉化細菌，直至達到目標細菌被完全抑制的時候，然后選擇(1)宿主細胞相對生物膜的天然菌群的競爭能力和(2)宿主細胞分泌所需數目抑菌物質的能力之間的最佳組合。
C.確定適用于所需應用場合的生物體1.選擇所需應用環境之外的細菌通常，應根據所需應用的環境選擇分泌抗SRB、真菌、或其他目標微生物的抗微生物劑的生物體。我們的發現表明，需氧細菌可保護表面免受腐蝕和降解，因此，選定的生物體應是需氧的。此外，生物體必須能夠在所需應用環境中生存。例如，如果目的是保護錨定在海水中或海上的橋梁的鋼材和混凝土，那么應選擇能夠在海水或鹽噴灑下生長的生物體。相反，如果本發明是用于保護輸送含工業廢物的淡水的管道，那么生物體就應能在淡水中并且在存在有預期的排放物下生長。此外，生物體應能夠在所需環境的預計溫度和pH條件下生長。因為細菌已經被集中研究了近百年，因此大多數菌種的溫度、pH和其他環境要求以及耐受性是已知的并且見于文獻。
較佳地，生物體應能夠在預計的環境條件下產生防腐蝕的保護作用。我們已發表了一研究結果，其中我們比較了7個屬的15種不同細菌在兩種不同介質(一種是模擬海水，一種是富含養分的淡水介質)中保護金屬的效果。(Jayaraman等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，4811-17(1997c))(以下簡稱Jayaraman等人，1997c；該文獻全部在此引用作為參考)。對于某些細菌而言，在兩種不同介質中對腐蝕的抑制程度明顯不同，而10種測試的生物體在兩種介質中都很良好地保護金屬(同上，在397)。按照該研究測試，本領域技術人員能輕易地確定，任何用于本發明方法或作為本發明系統一部分的細菌品種是否能夠在所需環境中存在的介質中生長，以及該生物體是否能夠在這些條件下保護金屬免受腐蝕。
此外，如果生物體能夠在生物膜中生長，則是優選的。通常，存在有能夠“粘附(sliming)”的生物體。代表性的菌屬是芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、沙雷菌屬、埃希氏桿菌屬(盡管假單胞菌屬的不應選用于例如航空燃料箱之類的那些環境，已發現在這些場合這些細菌會造成腐蝕。參見例如“手冊”，同上，at 129)。一種確定選定的生物體是否形成生物膜的代表性方法，在Jayaraman等人，1997c(同上)中有所講授。
2.選擇所需應用環境之內的細菌一種選擇適用于早已使用的設備的細菌的優選方法，是讓自然界來選擇。因為生物膜在自然界普遍存在，因此管、道、水冷卻塔、電廠水庫和類似設備和設施會早已存在生物膜，這些生物膜由經自然選擇能夠在這種環境中生長的生物體構成。可取出一份這些生物體的樣品(例如，通過刮下生物膜)，用標準技術進行培養，然后鑒別。如果所鑒別的物種原本是合適的(例如，它們可方便地被遺傳修飾，并且不知道其對腐蝕是增加而不是抑制)，那么它們自身可以被修飾以分泌所需的抗微生物劑。然而，如果需要，在原位發現的生物體純培養物也可通過購買或用母菌液生長得到，而不是使用從原位發現的細菌生長出的培養物。
一旦生物體已被修飾以分泌選定的抗微生物劑，那么它們可以被引入管、道、塔或其他設施中。引入設施可以用任何常規手段，例如按一定間隔刮擦表面以提供生物膜中的空隙，然后將一份培養物用吸管滴在刮過的部位。在一種優選方法中，可以簡單地讓含有高濃度細菌的一份水(即一部分水)通過待保護的材料，從而引入細菌。在水通過的過程中，細菌會粘附于生物膜并成為生物膜整體的一部分，或者在原本沒有生物膜時形成生物膜。
D.施用方法1.在首次將裝置投入使用前施用生物體我們的研究已表明，當預防SRB對表面的定居而不是嘗試將早已定居的SRB去除時，可更成功地減少SRB相關的表面降解。因此，一種優選的實施本發明的方法，是在將裝備、系統、或設備投入使用之前，用分泌合適抗微生物劑的細菌(例如適合抑制SRB生長的細菌)處理易腐蝕或降解的材料。
如果選定的細菌是形成孢子的，那么可以在導致孢子形成的條件下培養該生物體，在設備被使用之前將孢子施用于干的表面，然后正好在設備投入使用之前使表面潤濕以激活孢子。如果細菌不形成孢子，或者如果不方便讓可形成孢子的細菌先形成孢子(例如由于時間限制)，那么可以用任何方便的方法將含細菌的介質施用于表面，如將培養物刷、噴、噴霧、點滴、澆、滴于表面。
如果表面是不規則的，或者具有凹角或裂縫，那么噴灑或噴霧表面是優選的方法，因為它們能夠更佳地對凹角和裂縫進行接種。某些裝置，例如室外的噴泉、水冷卻塔、加熱和冷卻系統等，被設計成讓水、油或其他液體在系統中循環。先將一大桶水進行接種，然后用該水裝滿或沖刷該系統，可以方便地使這些裝置接種。其他開放的或者本來系統中的液體并不循環的系統(例如管道)，也可用這種方式進行接種。
2.在裝置投入使用之后施用生物體一旦SRB已定居在生物膜中，將SRB去除是困難的。在某些情況下，可能需要將全部或部分設備、裝置或設施拆開，然后用例如濃抗微生物劑或“新”蒸汽使全部或部分表面滅菌。在其他情況下，不能被拆開的設備可以用強抗微生物劑或新蒸汽進行沖刷以殺滅生物膜。這樣處理過的設備可以用前面的“在使用前處理”章節中所述的相同方式進行接種。
對于不能這樣處理，或者生物膜不能被有效除去的裝置，可通過如上所述修飾早已存在的生物體以使其分泌所需抗微生物劑，將現有的生物膜有利地加以利用。可將分泌所需物質的細菌重新引入該生物膜。如果需要，可將該生物體簡單地引入液體或其他介質，或者刷或噴在表面上。通過在引入新細菌之前刮去或破壞生物膜，從而產生細菌能夠定居的空檔，可以更成功地引入細菌。
E.本發明的應用1.封閉系統在工業、商業和公共設施中，有大量的封閉系統在使用(即通常不將內含物排入環境的系統)。例子包括鋼制儲罐(通常就地經過壓力檢測，然后用于長時間儲存液體)、水冷卻塔(用于發電站以及工廠、辦公樓和其他商業大樓的加熱和冷卻裝置)、熱交換器(已知會因SRB相關的腐蝕而失效)、以及防火系統。這些系統通常采用金屬管道和儲存容器。在這些設施中可以使用分泌合適抗微生物劑、或抗腐蝕劑、或兩者的需氧細菌，以形成能更好地抑制SRB相關腐蝕的生物膜。然而，用于儲存為人類消費品而設計的液體如牛奶和啤酒的容器，以及定期滅菌(如通過與新蒸汽接觸)的容器，通常不用本發明進行防腐蝕保護。
航空和其他燃料箱也構成了封閉系統。如前所述，在這些系統中腐蝕可由細菌(假單胞菌)或真菌污染引起。在這種情況下，對諸如沙雷氏菌之類的已修飾過而能分泌抗真菌或抗微生物劑(可抑制目標生物體(如假單胞菌))的細菌，可以被引入以減少這些原因引起的腐蝕。為了持續地保護系統，通常需要使所選定分泌的抗微生物劑，對分泌它的生物體的毒性低于它對真菌、假單胞菌或其他目標生物體的毒性。
2.開放系統常規地或有規則地將其內含物(經過或不經過處理)排放入環境的系統，被認為是開放系統。這樣的系統包括城市污水系統、暴雨排水溝和排放系統，它們通常包括較長時間地或反復地浸沒于或暴露于水或其他液體混凝土管道。這些管道會因硫酸氧化菌用硫化氫(由SRB生成)來形成硫酸，而受到SRB相關的腐蝕。因此，在這些以及類似的混凝土管道中用本發明方法抑制SRB，可以減少這些構件的腐蝕。
3.暴露于環境的建筑物有大量的金屬和混凝土建筑物，如橋梁、鐵道、公路立交等，它們經常暴露于環境，并且接觸或始終與水接觸，這使得在表面上形成生物膜。這些建筑物上的SRB相關的腐蝕可用本發明進行抑制。
實施例用下列實施例闡述本發明。提供這些實施例用于闡述，而不用于限制本發明。
實施例1生物膜結構和與腐蝕抑制的相關性該研究的主要目的，是分析保護性生物膜的結構特性并將生物膜構成與腐蝕抑制相關起來。對生物膜的活細胞、死細胞和外多糖進行染色，用共焦掃描激光顯微術(CSLM)觀察，然后定量以獲得深度曲線。研究溫度上升和生長培養基鹽含量上升兩者對生物膜構成以及腐蝕抑制的影響。
材料和方法菌株、生長培養基和培養條件一種腐肉細菌的抗卡那霉素的轉位子突變株P.fragi ATCC 4973(P.fragiK)(Jayaraman，A.等人，1997a)以及一種抗四環素的腸桿菌-大腸桿菌DH5α(pKMY319)(Jayaraman，A.等人，1997a)，因其能夠形成生物膜而被使用(Parolis，L.A.S.等人，Carbohydrate Reserach 216495-504(1991)；Huang，C.-T等人，Biotechnology and Bioengineering 41211-220(1993))。兩種菌株在23℃或30℃和不搖動條件下，在250毫升錐形燒瓶中與多塊SAE1018金屬試樣一起，在35毫升Luria-Bertani培養基(以下簡稱“LB”)(Maniatis，T.等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1982))(以下簡稱Maniatis等人，1982)和Vaatanen九鹽溶液(“VNSS”)(Hernandez，G.等人，Corrosion 50603-608(1994))(以下簡稱Hernandez等人，1994)中培養，其中培養基中補充有50微克/毫升卡那霉素(Jayaraman，A.等人，1997a)或25微克/毫升四環素(Yen，K.M.Journal of Bacteriology 1735328-5335(1991))。所有菌株取自-85℃甘油母菌液，并在含合適抗生素的LB瓊脂平板上劃線。然后挑選單克隆，并用于接種10毫升含合適抗生素的生長培養液中，在30℃和250rpm(Series 25搖床，New Brunswick Scientific，Edison，NJ)下生長過夜。用0.1％接種物(350微升)形成腐蝕實驗所需的生物膜。通過緩慢地取出舊培養液并輕輕地沿著錐形燒瓶的壁加入新鮮培養液，補充培養液。
金屬試樣的制備和質量損失測定從片材上切下重5.1克，直徑25.5毫米且厚1.2毫米的SAE 1018鋼試樣，用240粒度的拋光紙(Buehler，Lake Bluff，IL)拋光，并按以前報道的方法(Jayaraman等人，1997a)進行制備。通過除以試樣的總表面積(11.18平方厘米)而確定觀察到的比質量損失(mg/cm2)，將其用作腐蝕程度的指標(Jayaraman等人，1997a)。所有的腐蝕試驗重復3次。
共焦掃描激光顯微術(CSLM)和測定生物膜厚度將附著有表面生物膜的金屬試樣從錐形燒瓶中取出，在0.85％氯化鈉中浸潤一次以去除松散的上層細胞。在4毫升染色溶液中用“活的/死的”Baclit細菌活力測試試劑盒方案(1.125μl/ml各染色組份，Molecular Probes(Eugene，OR))和Calcofluor(300μg/ml，Sigma(St.Louis，MO)，Stewart等人，1995)同時對細胞和多糖染色30分鐘。“活的/死的”活力試劑盒可根據膜完整性來區分活細胞和死細胞；具有完整膜的活細胞被染成綠色，而具有不完整膜的死細胞被染成紅色。將染色后的試樣轉移至配有氪/氬激光器和60×，1.4NA油鏡的共焦掃描激光顯微鏡(MRC 600，Bio-Rad，Hercules，CA)的工作臺上。當生物膜被置于倒置式顯微鏡的工作臺時，為了減少對生物膜的損壞，將1.8厘米直徑的蓋玻片(圓No.1，1.3-1.7厘米厚，Fisher Scientific Co.，Pittsburgh，PA)輕輕地置于試樣上(通過毛細管作用固定)，通過位于蓋玻片外側區域中的顯微鏡圓孔(直徑2.0厘米)固定試樣(直徑2.55厘米)。生物膜的中央區域不受試樣重量的壓迫，而且僅該區域被觀察。
樣本在488納米受激，用K1/K2組合濾波塊(filter block combination)對熒光進行成像。用具有T1/E2多用途組合濾波器的MRC1024共焦顯微鏡(Bio-Rad，Hercules，CA)分析生物膜。對代表性的部位(選定的同一試樣上生物膜中4個相似部位之一)，收集沿全部生物膜厚度0.5-1.0微米的薄光學切片(水平切片)。通過對生物膜的頂部和底部聚焦，并對穿越的距離進行折射率校正(Bakke，R.和Olsson，P.Q.，Journal of Microbiological Methods 693-98(1986))，從而找出生物膜的厚度，測定的厚度是同一試樣上所分析的4個相似位置的平均值。
圖像分析所有生物膜的圖像處理和分析用Bio-Rad MRC600上的COMOS軟件進行。光學切片根據像素強度加以辨識以區別活的和死的細胞、多糖和空隙。然后測量被一定范圍的像素強度所覆蓋的各切片區域的百分比，以獲得各切片中組份的相對比例；將各組份的相對比例，作為歸一化深度(獲得圖像的深度除以總的生物膜厚度)的函數進行作圖。因此，位置0.0表示生物膜-液體界面，而位置1.0表示生物膜-金屬界面。
結果用P.fragi和大腸桿菌抑制腐蝕在含P.fragi K或大腸桿菌DH5α(pKMY319)的LB培養液和VNSS培養液中的質量損失，在23℃和30℃的靜止批量培養中測試8天，在這些培養中生長培養液或者每天補充，或者在8天不更換。在8天后，與浸入無菌培養液中的試樣相比，浸入細菌懸浮液的金屬試樣表現出的質量損失下降了2.3-6.9倍。這個結果與Jayaraman等人(1997a)以及Pedersen和Hermansson(1989)的結果相比很符合，他們報道，在暴露于VNSS培養液19天后，用假單胞菌S9和靈桿菌可使SIS1146鋼的腐蝕下降8倍。我們實驗室的早先的工作已表明，SAE1018鋼試樣的腐蝕情況，在無菌的新鮮LB培養液和用過且過濾的LB培養液中并沒有差別(Jayaraman等人，1997a)。
用P.fragi K和大腸桿菌DH5α觀察到的8天質量損失，隨生長培養液和培養溫度而有所變化。在較低溫度下，總的質量損失對兩種培養液而言較低；然而，腐蝕抑制(作為無菌對照的質量損失的下降百分比)卻高于或相當于這兩種培養液在較高溫度下腐蝕抑制。兩種菌株在兩個溫度下的質量損失，都是LB培養液低于VNSS培養液。每天補充培養液并沒有明顯影響腐蝕抑制，除了P.fragi K在VNSS培養液(30℃)(腐蝕抑制改善了近2.3倍)之外。不論培養液更換與否，在23℃時大腸桿菌DH5α(pKMY319)導致的質量損失高于P.fragiK，而在30℃時兩種菌株的存在所導致的質量損失相當。無論培養液是否每天更換，無菌對照都同樣程度地腐蝕。
在大多數細菌懸浮液中金屬試樣的腐蝕速率，在頭4天約為0.03-0.06mg/平方厘米·天。在4天后，腐蝕速率下降。在兩個溫度下，無菌對照在VNSS培養液中的腐蝕速率都稍高于在LB培養液中，而且腐蝕速率在整個8天期間較為一致。
用CSLM測定生物膜厚度在2、3、4和8天后，從培養液中取出多個試樣，對細胞和多糖同時染色，然后用CSLM分析。在100倍放大倍數(無蓋玻片)和600倍放大倍數(有蓋玻片)下觀察的生物膜，表現出相似的活細胞和死細胞和多糖的深度曲線。
在暴露于生長培養液的前48小時內，P.fragi K和大腸桿菌DH5α(pKMY319)生物膜都發展至可檢測厚度(約10-15微米)(數據未示出)。在不同的生長溫度、培養液和培養液更換情況下，P.fragi K生物膜的厚度沒有明顯變化，生物膜在4天后約為14微米厚；生物膜在暴露8天后約為12微米厚。大腸桿菌DH5α(pKMY319)表現出類似的傾向，4天時的生物膜(13微米)稍厚于8天時的生物膜(約11微米)。
生物膜的特性研究在23℃和30℃，LB和VNSS培養液，更換或不更換培養液情況下的P.fragi K和大腸桿菌DH5α(pKMY319)生物膜，用圖像分析進行特性研究和分析，以產生4天的歸一化深度曲線。
作為證實“活的/死的”染色能夠用于定量含活細胞和死細胞的群體的對照試驗，將200微克/毫升卡那霉素加至12小時野生型P.fragi培養物中，在48小時后用CSLM觀察。樣本主要為紅色(約75％)，并有少量綠色和黃色細胞。然后將生物膜樣品劃線于LB瓊脂平板上，沿主劃線觀察最低程度的生長(不接觸抗生素的細胞會沿主劃線生長成菌苔)。因此，染色可用于鑒定和定量死細胞。
用共焦顯微鏡獲得P.fragi K和大腸桿菌DH5α(pKMY319)生物膜深度上每1.0微米的水平切片，然后測定活細胞、死細胞、外多糖(EPS)和空隙的分布情況。P.fragi K和大腸桿菌DH5α(pKMY319)生物膜由靠近金屬表面的均勻的多糖(只要存在)和細胞層構成。細胞(活細胞和死細胞)與非細胞物質(多糖和水通道)的比例隨所有生物膜的深度而變化。兩種菌株的生物膜都表現出金字塔型結構，密度大的細胞靠近生物膜的底部(生物膜-金屬界面)而稀疏分布的細胞靠近生物膜-液體界面。這與Lawrence等人，J.Bacteriol.1736558-6567(1991)的報道相符，他報道了在復合和基本培養液中連續培養時，在玻璃載玻片上發展出的P.fluorescens和P.aeruginosa生物膜具有類似的金字塔型結構。在本文報道的工作中，生物膜的上層主要由活細胞構成，而在靠近金屬表面處活細胞密度下降。多糖(當存在時)通常在靠近生物膜底部檢測到(通常距金屬表面3微米之內)。由活細胞和死細胞松散相連構成的厚菌叢(15-40微米厚)位于生物膜的上方(在生物膜-液體界面)，它在測定生物膜厚度時不被考慮在內。在暴露于生長培養液8天后，大腸桿菌DH5α(pKMY319)生物膜還具有覆蓋金屬試樣的薄粘液層，該粘液層在染色過程中無法保留在金屬試樣上方。
測定了P.fragi K在LB和VNSS培養液(30℃)中的4天深度曲線。在LB培養液中生長的P.fragi K和大腸桿菌DH5α生物膜中，可檢測到比在VNSS培養液(30℃)生長時更多的細胞。此外，在LB培養液中，P.fragi在更高溫度下可形成更多細胞團，因為在23℃時50％生物膜由活細胞和死細胞構成，而在30℃生長的生物膜有90％活細胞和死細胞。在VNSS培養液中發展的生物膜中，多糖占生物膜的近10-55％，而在LB培養液中，檢測到的EPS少于5％。
通過每天替換培養液，生物膜諸組份的相對比例會顯著變化；典型地，在所有條件下生物膜中可檢測到更多活細胞。生物膜結構也隨著每天添加新鮮培養液而變化，在生物膜的所有深度上可觀察到幾乎等比例的細胞，而不是形成金字塔型結構。細胞物質與非細胞物質之比，在大多數條件下在整個生物膜中保持相對恒定，而多糖僅在VNSS培養液中觀察到。多糖(只要存在)產生的程度隨著更換培養液而變得更多。在生物膜的上層中觀察到更少的菌叢，而且在朝向生物膜底部的方向上活細胞比例也不明顯下降。
結論對生物膜的CSLM成像分析，以及活細胞、死細胞、EPS和空隙的相對比例的定量分析揭示，最大的細胞(活的和死的)密度在暴露4天后達到，在4天之后下降。因此，選擇在LB培養液和VNSS培養液中的金屬試樣上生長的P.fragi K和大腸桿菌DH5α(pKMY319)的4天批量培養生物膜，用于進一步的特性研究以及與每天更換培養液時生長的4天生物膜作比較。
生物膜的組成取決于生長培養液、培養溫度和培養液的更換。在LB培養液中4天后生物膜的發展情況表現出細胞數目的下降，這提示多糖基質的缺乏導致細胞的解離。在VNSS培養液中，細胞被包埋在多糖基質中，并且在暴露8天后表現出更不易與金屬表面解離的傾向(未示出)。這與Dewanti和Wong，Int′l.J.Food Microbiol.，26147-164(1995)的觀察結果相符，他們觀察到在胰蛋白酶大豆肉湯和基本培養液中生長的大腸桿菌O157H7有類似的生物膜結構。此外，在不同培養液和溫度中形成的生物膜，生物膜細菌的生理學和細胞形態不同。在LB培養液中形成的P.fragi和大腸桿菌生物膜是小而獨特的細胞；與之相反，在VNSS培養液中的生物膜是長形和成蔟的，這可能是對環境應力的反應。
每天更換生長培養液，會導致生物膜深度范圍內細胞含量的輕微下降，并且觀察到較少的菌叢。連續地供給養分可能增加了代謝活躍細胞對細胞膜的附著，導致在生物膜的上方增加細胞以替換失去的細胞，這與Costerton(1995)的觀察結果是一致的。在生物膜-液體界面處缺乏菌叢可以被解釋為，每天添加新鮮生長培養液和染色程序對生物膜結構有最小的干擾。
生物膜的特性(通過CSLM分辨)，與腐蝕結果相比較表明，生物膜中總細胞數的增加可增加對腐蝕的抑制。將溫度從23℃提高到30℃，導致了無菌對照的腐蝕增加了100％，而對于8種研究條件(2種細菌、2種培養基、和2種溫度)中的6種，細胞團增加了1.6-4.1倍(按生物膜整個深度曲線上平均總活細胞和死細胞計算)。與細胞團和溫度的增加相對應，在8種生物膜條件中的6種，腐蝕僅增加了22％(對于大腸桿菌DH5α在每天更換的VNSS培養液中，腐蝕增加了100％；P.fragi K在不更換的VNSS培養液中，腐蝕增加了230％)。因此總體上說，溫度上升導致細胞團上升，而受生物膜保護的試樣所發生的腐蝕增加遠小于無菌培養液中所觀察的腐蝕增加(22％對100％)。
我們實驗室早先對7種很不相同的細菌屬(形成生物膜的程度的不同)的腐蝕抑制作用的觀察工作證實，均質生物膜是必要的(Jayaraman等人，1997b)暴露于鏈霉菌屬(形成細胞分布在菌叢中的松散生物膜)的菌懸浮液的金屬試樣，其腐蝕速率與無菌對照相當。因為在該研究中用P.fragi在4天后的腐蝕速率于類似無菌對照中的腐蝕速率，在23℃和30℃以及對于LB培養液和VNSS培養液是相當的，然而即使在4種條件下生物膜的厚度、組成和特性很不相同，但是生物膜仍能提供相似的腐蝕抑制作用。因此，對于腐蝕抑制似乎需要某一最小生物膜厚度或密度。類似的結果也發生于大腸桿菌在VNSS培養液(30℃)時。
當生長培養液每天更換時，有趣的是注意到，僅在30℃的VNSS培養液中觀察到顯著的腐蝕抑制方面的差異。除了生物膜厚度的增加或減少之外，更換培養液時觀察到的一個主要差異是，細胞在整個生物膜中分布的均一性上升并且活細胞的相對比例上升。這種均一的細胞層會減少金屬表面上用于腐蝕過程的氧氣量，從而抑制腐蝕。與其他條件下不更換培養液時相比，腐蝕抑制沒有明顯變化也提示，對于由極少數目的呼吸活躍細胞快速形成的均一生物膜的特定細菌，其腐蝕抑制存在上限。
實施例2生物膜可抑制銅和鋁的腐蝕該實施例表明了，生物膜可抑制銅和鋁的腐蝕。
銅對微生物的毒性導致人們相信，銅的由微生物引起的腐蝕(MIC)是不重要的(Iverson，1987)。然而，微生物所產生的氨以及硫桿菌(Thiobacillus)和硫酸鹽還原菌(SRB)所產生的硫酸，可導致銅合金的腐蝕(Iverson，1987；Wagner和Little，1993)。Wagner和Little觀察到，銅面上存在生物膜會產生有差異的需氧細胞和氯化物梯度，這會形成點腐蝕(Wagner和Little，1993)。銅合金的腐蝕在熱交換器管道、船舶的海水管道以及飛機燃料箱中造成問題(Iverson，1987；Miller，1981)。Iverson還提及，銅在淡水和海水中的腐蝕可通過加入細菌而被抑制，以及在細菌死亡后腐蝕增加(Iverson，1987)。
在所形成的氧化物鈍性膜，增強了鋁的抗腐蝕性(Iverson，1987；Wagner和Little，1993)。假單胞菌和分支孢子菌通常是與鋁及其合金的微生物引發型腐蝕相關的(Iverson，1987)。由綠膿假單胞菌(P.aeruginosa)產生的腐蝕性有機化合物，可從鋁和合金中去除鋅和鎂并造成腐蝕。已有報道，3種SRB菌可造成鋁的點腐蝕，而且與無菌對照相比重量損失增加了100倍(Iverson，1987)。
材料和方法菌株和生長培養基P.fragi K是一種抗卡那霉素的P.fragi衍生株(Jayaraman，A.等人，1997a)，短芽孢桿菌(B.brevis)18是一種超量產生短桿菌肽S的菌株(Azuma，T.等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.38173-178(1992))(以下簡稱，Azuma等人，1992)。按以前Jayaraman等人所述的系統(Jayaraman，A.等人，1997c)，用改良的Baar氏培養液在連續反應器中形成金屬表面上的生物膜，因為這種培養液支持需氧細菌和SRB的生長。
樣品制備從板材上切下非合金化的銅以及鋁合金2024板(7.5厘米×7.5厘米見方，1.2厘米厚)，用240粒度的拋光紙(Buehler，Lake Bluff，IL)拋光，并按以前描述的方法(Jayaraman等人，1997c)進行儲藏。
用EIS測量持續腐蝕速率用Solarton-Schlumberger電化學測量儀(SI1280，Schlumberger TechnicalInstruments Division，San Jose，CA)測得阻抗數據(至少2次實驗)，該儀器連接于Macintosh計算機(PowerMac 7100/80，Apple Computer，Cupertino，CA)，運行EISIS電化學實驗軟件(University of California，Irvine)(類似軟件，THALESImpedance Measurement and Equivalent Circuit Synthesis/Simulation/FittingSoftware，可從Bioanalytical Systems，Inc.，West Lafayette，IN購得)(以下簡稱THALES軟件)。反應器結構和操作條件早已被描述過(Borenstein，1994，同上)。
結果和論述銅和鋁的所有試驗中的極化阻抗Rp、電容C和腐蝕電位Ecorr總結于表1。非合金化的銅在改良的Baar氏培養液(30℃)時的腐蝕，用連續反應器加以研究并測得阻抗譜。無菌反應器(5次獨立試驗)在暴露10天后的最大相角約為56度。在相同的期間，在銅上生長的P.fragi K生物膜(5次獨立試驗)使得阻抗在測量的最低頻率(1.4×10-3赫茲)處增加了21倍，這表明了腐蝕的下降。這種腐蝕下降還得到了相角增加的證實(56度vs.71度)。對于在銅上形成的短芽孢桿菌18生物膜，也觀察到了類似的阻抗譜(2次獨立試驗)。
用無菌的改良Baar氏培養液和鋁合金2024在連續反應器中獲得的阻抗譜(2次獨立試驗)，表明在暴露10天后在低頻處的最大相角為71度。當在鋁合金上在6天形成P.fragi K生物膜時(5次獨立試驗)，最大相角變為78度，而且還觀察到Rp增加了8倍。與用非合金化的銅所觀察到的情況一樣，在類似條件下，短芽孢桿菌18生物膜(3次獨立試驗)也能夠使鋁2024的Rp增加5倍且使相角增加7度。
觀察到的Rp的增加以及阻抗譜的變化，與Jayaraman等人(1997c)的觀察結果相似。他們報道，與無菌對照相比，無共生的P.fragi K生物膜使SAE 1018軟鋼的相角增加了35度，使Rp下降了40倍。
表1非合金化的銅以及鋁合金2024在改良Baar氏培養液中(30℃)時的極化阻抗Rp、電容C和腐蝕電位Ecorr。數據來自代表性的試驗(最少2次獨立試驗)。
注1無法根據可利用的電路模型估算參數注2阻抗揭示存在點腐蝕(C＝8.1×10-5F/cm2，Rp＝2.97×10-5Ω·cm2，Rpit/F＝3.52×103Ω)實施例3肽抗微生物劑抑制SRB的生長該實施例表明，肽抗微生物劑可抑制SRB的生長。
肽抗微生物劑是小的(Marahiel M.等人，Mol.Microbiol.7631-636(1993)；Nakano M.M.和Zuber，P.，Cirt.Rev.Biotechnol.10223-240(1990))，可以方便地被克隆入形成生物膜的需氧細菌中，并且可以通過蛋白質工程進行優化(PiersK.K.等人，Gene 1347-13(1993))(以下簡稱Piers，1993)；因此它們是將SRB排除出生物膜的有吸引力的候選物質。
Saleh等人(1964)和Postgate(Postgate J.R.＂硫酸鹽還原菌＂，CambridgeUniversity Press，New York(1984))(以下簡稱Postgate，1984)匯編了對各種SRB有抑制作用的抗微生物劑，其中包括肽-多粘菌素B(它在100微克/毫升時抑制D.vulgaris)。本研究描述了代表性的SRB D.vulgaris和D.gigas在懸浮培養中受到下列肽抗微生物劑的抑制短桿菌肽S(來自短芽孢桿菌的10個氨基酸的環肽(Azuma等人，1992))、短桿菌肽D(短芽孢桿菌產生的15個氨基酸的線性肽(van Dohren H.，Peptides，In L.C.Vining和C.Stuttard(編)，Genetics andBiochemistry of Antibiotic Production.Butterworth-Heinemann，Boston(1995)))、酰胺化和非酰胺化的indolicidin(牛嗜中性白細胞產生的13個氨基酸的線性肽(Falla T.J.等人，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)27119298-19303(1996)(以下簡稱Falla等人，1996)；Selsted M.E.等人，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)2674292-4295(1992)(以下簡稱Selsted等人，1992)))、殺細菌素(牛嗜中性白細胞產生的12個氨基酸的環肽(Romeo D.等人，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)2639573-9575)(1988)(以下簡稱Romeo等人，1988))和多粘菌素B(多粘芽孢桿菌產生的10個氨基酸的有分支的環十肽(Fujita-Ichikawa Y.和K.Tochikubo，Microbiol.Immunol.37935-941)(1993))。
材料和方法菌株和生長培養基D.vulgaris(ATCC 29579)和D.gigas(ATCC 19364)是從美國典型培養物保藏中心獲得，在15毫升帶螺旋帽的試管中，于補充有100微升各種除氧劑4％硫化鈉和Oxyrase(Oxyrase Inc.，Mansfeld，OH)的10毫升改良的Baar氏培養液(ATCC培養液1249)中培養。最初的培養物是用-85℃甘油母菌液生長；所有隨后的培養物用3％最初培養物(不搖動地維持在30℃)的接種物進行生長。兩種SRB在牢固密封的帶螺旋帽的試管常規培養，并暴露于層流罩中的氧氣(它不會抑制培養，如以前Angell，P.和White，D.C.，J.Ind.Microb.15329-332(1995)所報道的那樣)。SRB還定期地在0.1％硫酸亞鐵銨存在下培養，然后這些硫酸鹽還原菌的存在通過檢測培養試管中黑色硫化鐵得以證實。在每次MPN分析后還進行脫硫綠毛霉素(desulfoviridin)分析，以便因染料生色團脫硫綠毛霉素的釋放而在紫外線下呈紅色來證實D.vulgaris或D.gigas的存在。
抗微生物肽
indolicidin(酰胺化和游離酸形式)由UC Irvine的Michael E.Selsted教授友情提供，而游離酸形式由Genosys Biotechnologies Inc.(The Woodlands，TX)合成，純度為76。短桿菌肽S(純度96.5％)和短桿菌肽D(純度100％)，以及多粘菌素B(純度100％)購自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。殺細菌素由Genosys Biotechnologies Inc.(The Woodlands，TX)合成(純度為32％)并在二硫蘇糖醇(DTT)存在下(＜0.1％)運輸。合成的indolicidin(酸形式)的分子量(1907道爾頓)和殺細菌素分子量(1486道爾頓)，用MALDI-飛行時間(TOF)質譜儀(VoyagerDE 5-2386-00，Perseptive Biosystems，MA)確證。
用Vydac C18柱(Vydac，Hesperia，CA)，通過反向HPLC(Varian Vista 5000series，Sugar Land，TX)將殘留的DTT從殺細菌素中去除(并且有利于在殘基3和11形成二硫鍵)。用乙腈/0.1％三氟乙酸(TFA)在水中(20∶80)的移動相來洗脫DTT，然后步進地換成(step-change)50∶50的乙腈/0.1％三氟乙酸在水中的系統以便洗脫殺細菌素。該組份被認為不含DTT并用于抗微生物分析。
SRB抑制分析為了測定SRB的活力指數(Romeo等人，1988)，將后指數期的培養物(O.D.600為0.16-0.19，它對應的最初細胞數目為5-9×104細胞/毫升)，暴露于30℃的各種濃度的抗微生物劑1小時。收獲1毫升細胞，在新鮮的改良Baar氏培養液中洗滌一次以去除細胞碎片，然后重懸浮于1毫升新鮮的改良Baar氏培養液(補充有10微升各Oxyrase(Oxyrase Inc.，Mansfeld，OH)和4％硫化鈉)中。將450微升的樣品等份置于500微升無菌的Eppendorf管中，加入適量的抗微生物劑，并在30℃溫育。處理的有效性通過多試管的最近似值(MPN)發酵技術加以確定(無名氏，Multiple-tube fermentation technique for members ofcoliform group，pp.9-45至9-51，In A.E.Greenberg，L.S.Clesceri，和A.D.Eaton(編)，Stantard Methods for the Examination of Water and Wasterwater，18版，American Public Health Association，American Water Works Association，和Water Pollution Control Federation，New York(1992))(以下簡稱Greenberg，1992)。
對SRB進行計數的MPN測試是在3個有1000微升SRB接種物的12毫升試管、3個有500微升接種物的12毫升試管、3個有100微升接種物的12毫升試管中進行的。所有的9個試管都含有終體積為10毫升改良的Baar氏培養液(補充有100微升各Oxyrase(Oxyrase Inc.，Mansfeld，OH)和4％硫化鈉)。監測試管72小時，以確定生長呈陽性的試管數目。通過培養液濁度的增加來確定生長情況，MPN指數/毫升是用Thomas公式(Greenberg 1992)計算出。
結果和論述將D.vulgaris和D.gigas在各種不同的抗微生物肽存在下進行孵育，然后測定其在暴露1小時后的活力。氨芐青霉素被用作D.vulgaris的陽性對照，因為發現氨芐青霉素和氯霉素可在20微克/毫升下抑制該菌株，這與早先的報道相符(Odom和Singleton，The Sulfate-reducing bacteriacontemporary perspectives，Springer Verlag，New York(1993)(以下簡稱，Odom和Singleton，1993))。然而，氨芐青霉素和氯霉素都不能在100微克/毫升的劑量下有效抑制D.gigas。兩種SRB對數種其他抗生素(卡那霉素、四環素、蘚霉素、青霉素G和萘啶酮酸)、無機物(鉬酸銨、鉬酸鈉和蒽醌)和肽(乳鏈球菌肽和多粘菌素B)的敏感性，也用SRB的靜止相培養物進行評估。D.gigas受100微克/毫升蒽醌的抑制(Cooling等人，1996)，而且兩種SRB都受到100微克/毫升鉬酸鈉的抑制。這與Saleh等人(1964)的觀察結果相似，他調查了近200種化合物對SRB的抑制活性，并且注意到SRB對抑制性化合物有高度的抗性(同上)。
用MPN分析來確定D.gigas和D.vulgaris對肽抗微生物劑的活力指數。對于D.gigas，短桿菌肽S和酰胺化的indolicidin(Ind-NH2)(它是牛嗜中性白細胞中天然存在的形式(Falla等人，1996；Selsted等人，1992)，兩者都能在25微克/毫升暴露1小時后，使后指數期培養物的活力降低92-96％。對于D.vulgaris，25微克/毫升Ind-NH2可稍更有效地抑制生長(活力下降99.3％)，而短桿菌肽S的效力較低，在100微克/毫升時使活力下降93％。25微克/毫升時，酸形式的indolicidin(Ind-OH)比酰胺化的indolicidin對D.gigas的效力低10倍，比D.vulgaris的效力低174倍。這并不意外，因為翻譯后的酰胺化被認為可提高indolicidin的效力(Falla等人，1996)。肽抗微生物劑短桿菌肽D、多粘菌素B和殺細菌素(Postgate，1984)也能在100微克/毫升時使D.vulgaris和D.gigas活力下降約90％。這些MPN分析結果還得到了類似結果的證實，即將D.vulgaris暴露于短桿菌肽S、短桿菌肽D、indolicidin和殺細菌素1小時，接種于Desulfovibrio瓊脂平板(ATCC培養基42)，然后在厭氧的GasPak室(FisherScientific Co.，Pittsburgh，PA)中孵育時得到的結果。
這些結果表明，肽抗微生物劑(如短桿菌肽S、indolicidin、多粘菌素B和殺細菌素)可用于抑制SRB生長并且減少微生物造成的鋼材腐蝕。5-25微克/毫升的indolicidin能夠抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌99.9％(Romeo等人，1988；Selsted等人，1992)；但是在該研究中，D.gigas和D.vulgaris表現出對indolicidin的更強抗性。100微克/毫升的殺細菌素可抑制大腸桿菌95％(Romeo等人，1988)，并且在該研究表現出對D.gigas和D.vulgaris有相當的抑制性(90％)。3-12.5微克/毫升的短桿菌肽S已表明可完全抑制革蘭氏陰性菌的生長(Kondejewski L.等人，Int.J.Peptide Protein Res.47460-466(1996))，而且在該研究中50-100微克/毫升對兩種革蘭氏陰性SRB菌都表現出抑制作用。根據它們在懸浮培養中對SRB的活性，所有在該研究中測試的抗微生物肽在可比濃度下，效力都高于市售的抗生素(如卡那霉素、萘啶酮酸、四環素)以及無機物(如鉬酸鈉和蒽醌)。
實施例4用分泌克隆的抗微生物劑的細菌將SRB從生物膜中除去該實施例說明了抗微生物的化學物質在細菌中的克隆和表達，以及它們可用于將SRB從不銹鋼上的生物膜中除去。
已經從數種細菌(Hancock，R.E.W.等人，Adv.Microb.Physiol.37135-175(1995))、植物(Hancock，R.W.等人，Cationic peptidesa class of antibiotics ableto access the self promoted uptake pathway across the Pseudomonas aeruginosaouter membrane，p.441-450，In T.Nakazawa(編)Molecular Biology of thePseudomonads，ASM press，Washington D.C.(1996))(以下簡稱，Hancock等人，1996)、昆蟲(Boman，H.G.等人，歐洲生物化學雜志(Eur.J.Biochem.)2023-31(1991))、和哺乳動物(Frank，R.W.等人，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)265(31)18871-18874(1990)；Lehrer，R.I.等人，Annu.Rev.Immunol.11105-128(1993)；Zasloff，M.美國科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.)845449-5453(1987)(以下簡稱Zasloff，1987))中鑒別和分離出抗微生物肽。這些肽被廣泛地分成爪蟾抗菌肽(Zasloff，1987)、防衛素(Cullor，J.S.等人，Arch.Opthalmol.108861-864(1990)(以下簡稱Cullor等人，1990))、殺菌肽(Calloway，J.W.等人，Antimicrob.Agents Chemother.371614-1619(1993)(以下簡稱Calloway等人，1993))、蜂毒肽(Piers，K.L.等人，Mol.Microbiol.12(6)951-958(1994)(以下簡稱Piers等人，1994))，并且已表明它們對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌以及酵母和真菌有抗微生物活性(Hancock等人，1996)。大多數陽離子型肽有多個賴氨酸和精氨酸殘基以及親水和疏水面(Hancock等人，1996)，它們通過提高細菌細胞膜的通透性或抑制DNA合成而殺滅微生物(Hancock等人，1996；Romeo等人，1988)。
indolicidin(Cullor等人，1990；Del Sal，G.等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.187(1)467-472(1992))和殺細菌素(Frank，R.W.等人，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)265(31)18871-18874(1990)；Romeo等人，1988)是從牛嗜中性白細胞分離出的陽離子型抗微生物劑劑(Lehrer，R.I.等人，Annu.Rev.Immunol.11105-128(1993))。indolicidin是一種十三肽，它屬于防衛素家族(Selsted等人，1992)并且由6種不同氨基酸構成，在所有已知蛋白質中具有最高比例的色氨酸(39％)(Falla等人，1996)。indolicidin還是已知最小的線性抗微生物肽，在天然存在形式中其羧基端是酰胺化的(Falla等人，1996；Selsted等人，1992)。殺細菌素是一種富含精氨酸的環狀十二肽，它含有維持環狀結構的二硫鍵(Romeo等人，1988)。
對于在原核和真核表達系統中產生抗微生物肽以用于商業用途方面，所作的嘗試較少。Piers等人(Piers等人，1993和Piers等人，1994)已描述了用金黃色葡萄球菌表達系統，在細菌中合成和純化人嗜中性白細胞肽1(HNP-1)和殺菌肽(cecropin)/蜂毒肽雜合肽的程序。這些肽以融合于蛋白A的形式合成，分泌入培養液，然后用親和色譜法純化(Piers等人，1993)。Calloway(Calloway等人，1993)嘗試在大腸桿菌中表達殺菌肽A，并且得出結論羧基端的翻譯后修飾是對于高抗微生物活性而言是必需的。Hara和Yamakawa(Hara，S.和M.Yamakawa，Biochem.Biophys.Res.Commun.224(3)877-878(1996))已在大腸桿菌中產生了肽moricin(作為融合于麥芽糖結合蛋白的融合蛋白)，并發現其活性與天然蛋白相當。Haught等人(Biotechnol.Bioeng.5755-61(1998))已報道了，通過融合于牛前凝乳酶，在大腸桿菌中以包含體形式產生重組的反義抗微生物劑P2；并表達了高水平的蛋白(占全部細胞蛋白的近16％)。Pang等人(《基因》(Gene)，116165-172(1992))(以下簡稱Pang等人，1992)已嘗試在細菌、酵母和煙草植物中表達和分泌蝎子的昆蟲毒素I5A(沒有檢測到可測的活性)。所有這些方法都針對大規模且價廉地生產純化的抗微生物肽而不是活體內(in vivo)應用。
在前面的實施例中，我們顯示了純化的抗微生物肽indolicidin、非酰胺化的indolicidin和殺細菌素可抑制懸浮培養中的厭氧SRB。該實施例表明，在需氧生物膜形成菌中產生抗微生物肽，能夠將SRB從生物膜中排除掉并且可抑制SRB所引起的金屬腐蝕。具體地，該實施例顯示了在革蘭氏陽性菌Bacillus中表達陽離子型抗微生物肽indolicidin和殺細菌素，以及它們在將SRB從304不銹鋼上生物膜中去除方面的用途。indolicidin和殺細菌素已經以融合于堿性蛋白酶(apr)信號肽的形式被克隆，然后用apr啟動子組成型地表達。芽孢桿菌RNA酶(一種來自B.amyloliquefaciens的胞外RNA酶)的pro區域已經被用于在Bacillus中產生pre-pro-肽形式的殺細菌素。研究了這些菌株對連續反應器中SAE1018軟鋼和304不銹鋼上SRB生長的抑制能力。
材料和方法菌株、質粒和生長培養液大腸桿菌XL1(Blue){recAl endAlgyrA96 thi-l hsdR17 supE44 relAllac[FlproAB laclqZDM15 Tn10(Tetr)]}購自Stratagene(LaJolla，CA)。枯草桿菌BE1500{trpC2，metB10，lys-3，ΔaprE66，Δnpr-82，ΔsacB∷ermC}和質粒pBE92(含堿性蛋白酶(apr)啟動子、信號序列和堿性磷酸酶報道基因)，得自E.I.du Pont deNemours Inc.(Wilmington，DE)。蛋白酶缺陷型菌株枯草桿菌WB600株(Wu，X.-C，等人，J.Bacteriol. 173(16)4952-4958(1991))(以下簡稱Wu等人，1991){trpC2，ΔnprE，ΔaprA，Δepr，Δbpf，Δmpr，ΔnprB}得自Dr.Sui-LamWong(University of Calgary，Alberta，Canada)。多粘芽孢桿菌得自美國典型培養物保藏中心(ATCC 10401)。D.vulgaris(ATCC菌株29579)被用作該研究中的參照SRB。用枯草桿菌BE1500和P.fragi K(Jayaraman，A.等人，1997a)進行的所有腐蝕試驗，都在用于硫酸鹽還原菌的改良Baar培養液(ATCC培養基1249)中進行。多粘芽孢桿菌的腐蝕試驗，是在補充有1/10體積10×TY培養液(10克胰蛋白胨，5克酵母提取物，100毫升水)的改良Baar培養液中進行。
酶和化學試劑所有的限制性酶、T4DNA連接酶、和Taq聚合酶得自Promega(Madison，WI)。BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸)購自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。indolicidin(游離酸形式，純度76％)和殺細菌素(純度32％)由GenosysBiotechnologies Inc.(The Woodlands，TX)合成。
質粒構建按Maniatis(Maniatis，T.等人，1982)和Rodriguez和Tait(Rodriguez，R.L.等人，Recombinant DNA Techniques.An introduction，The Benjamin/CummingsPublishing Company Inc.，Menlo Park，CA(1983))所述，進行重組DNA法的操作。根據Bramucci和Nagarajan(Bramucci，M.G.和V.Nagarajan，應用環境微生物學(Appl.Environ.Microbiol.)62(11)3948-3953(1996))(以下簡稱Bramucci，1996)的程序，從Bacillus中分離質粒DNA。非酰胺化indolicidin的氨基酸序列[NH2-Ile-Leu-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-OH](Selsted等人，1992)和殺細菌素的氨基酸序列[NH2-Arg-Leu-Cys-Arg-Ile-Val-Val-Ile-Arg-Val-Cys-Arg-OH](Romeo等人，1988)，被用于設計編碼這些肽基因的寡核苷酸。質粒pBE92-Ind被設計用于表達非酰胺化的indolicidin，其12個氨基酸的肽融合于apr信號序列；pBE92-Bac被設計用于表達殺細菌素，其13個氨基酸的肽融合于apr信號序列；而pBE92-ProBac被設計用于表達殺細菌素，其融合于B.amyloliquefaciens胞外RNA酶的pro-區域(Paddon，C.J.等人，J.Bacteriol.171(2)1185-1187(1989))(以下簡稱Paddon等人，1989)和apr信號序列。
合成的寡核苷酸(
圖1)是由Gibco-BRL Life Technologies(Long Island，NY)以200nmol規模合成并用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)純化。合成的寡核苷酸具有側翼的HindIII和NheI限制性位點，并且在兩端都有額外的6個堿基以便有效地進行限制性消化。將每種構建物的兩種完全互補的寡核苷酸重懸浮在TE緩沖液(50ng/μl)中，等摩爾地混合，在沸水中孵育3分鐘。當冷卻至室溫時，寡核苷酸在水浴中退火(約2小時)。退火的寡核苷酸用HindIII和NheI消化過夜，在-85℃用乙醇沉淀1小時，然后再懸浮于去離子的蒸餾水中。質粒載體pBE92是從大腸桿菌XL1(Blue)的細胞提取物中，用質粒midi試劑盒(QiagenInc.，Chatsworth，CA)分離出的。用HindIII、NheI和SalI在37℃同時消化DNA14小時。三重消化的載體和抗微生物劑基因插入片段，以28∶1的插入片段∶載體摩爾比，在16℃連接17小時。連接混合物用苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)萃取、乙醇沉淀，然后再懸浮于30微升ddH2O中。
Pro-殺細菌素的合成是合成兩條寡核苷酸鏈，它具有21個堿基對的互補區域并且在兩條鏈的末端有HindIII和NheI限制性位點。在終止密碼子下游還引入一個NotI位點，它用于將一個獨特位點引入pBE92。如前所述使兩條鏈退火，在Perkin-Elmer熱循環儀N801-0150(Perkin Elmer，Norwalk，CT)上，用Taq聚合酶補平互補區域(一個循環，94℃30秒，55℃30秒，和72℃2小時)。終產物用苯酚/氯仿/異戊醇萃取、在-85℃和1mM硫酸鎂存在下用乙醇沉淀1小時，然后再懸浮于50微升ddH2O中。
轉化子通過用BglI(indolicidin)、BssH II(殺細菌素)和NotI(Pro-殺細菌素)限制性消化而加以鑒別，并用改良的Boehringer-Mannhein菌落轉移分析法加以證實。將200毫微克質粒DNA(來自帶抗微生物劑基因的推定大腸桿菌轉化子的小量制備物)點樣于帶正電荷的尼龍膜上(產品編號No.1209272，Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)，按制造商說明書用抗微生物劑基因合成寡核苷酸DNA(用Boehringer Mannheim的隨機引發DNA標記方案標記)(
圖1)進行檢測。
大腸桿菌和芽孢桿菌的轉化用Smith和Iglewski的方法(Smith，A.W.等人，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)1710509(1989))，使大腸桿菌XL1(Blue)細胞變為電感受態。用基因脈沖儀/脈沖控制儀(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，用10微升連接混合物來使細菌電穿孔(1.2kV/cm，200Ohm，25μF)，然后在含100微克/毫升氨芐青霉素和40微克/毫升BCIP的LB瓊脂平板上，用藍色/白色選擇技術，選出含正確插入件(pBE92-indolicidin、pBE92-殺細菌素和pBE92-Pro殺細菌素)的克隆(帶正確插入件的轉化子產生白色菌落，而重合(reclosed)載體形成藍色菌落)。
根據Cutting和Vander Horn的兩步法(Genetic analysis，p.27-74，In C.R.Harwood和S.Cutting，M.(編)，Molecular biological methods for Bacillus，JohnWiley & Sons，New York(1990))，使枯草桿菌BE1500活化和轉化。將后指數期的感受態細胞與質粒DNA(約1微克，分離自大腸桿菌XL1(Blue))一起孵育30分鐘。培養物用1毫升10％酵母提取物稀釋，在回旋式搖床(New BrunswickScientific，Edison，NJ，25序列搖床)上37℃孵育，之后接種于含25微克/毫升卡那霉素的LB瓊脂平板上。多粘芽孢桿菌的感受態細胞是根據Rosado等人(J.Microbiol.Meth.191-11(1994))的程序制備的。用Bramucci和Nagarajan的程序(Bramucci，1996)，從枯草桿菌BE1500分離出的約1微克DNA(基于pBE92的構建物)(Nagarajan，V.等人，基因(Gene)114121-126(1992))，用于使多粘芽孢桿菌電穿孔(6.25kV/cm，200Ohm，25μF)。然后，細胞在37℃搖動孵育細胞3小時，在含150微克/毫升卡那霉素的LB瓊脂平板上加以選擇。
SDS-PAGE將含表達抗微生物肽基因、基于質粒pBE92的構建物的枯草桿菌BE1500，在25毫升LB培養液中37℃生長至后指數期(O.D.600＝0.70-1.0)。在4℃，10000×g離心10分鐘而收集細胞，然后用Speed Vac濃縮器(Model 200H，Savant Instruments Inc.，Holbrook，NY)將上清液濃縮25倍。濃縮后的上清液與2×樣品緩沖液(0.125M Tris-堿，0.4％SDS，20％甘油，和0.1毫升1毫克/毫升溴酚藍，并且對于每100微升2×緩沖液添加5微升2-巰基乙醇)混合，煮沸5分鐘，然后在16.5％Tris-Tricine凝膠(Bio-Rad，Hercules，CA)上電泳。
持續腐蝕試驗用SAE1018軟鋼試樣(直徑2.5厘米，厚1.2毫米)進行的批量培養腐蝕試驗，如前所述(Jayaraman等人，1997a)在30℃，250毫升錐形燒瓶中不搖動條件下進行三次。還用連續反應器(Jayaraman等人，1997c)在304不銹鋼上形成生物膜，并在最少2個獨立的反應器中用Solarton-Schlumberger電化學測量儀(SI1280，Schlumberger Technical Instruments Divisio，San Jose，CA)通過電化學阻抗光譜法(EIS)監測腐蝕情況。該測量儀連接于Macintosh計算機(PowerMac 7100/80，Apple Computer，Cupertino，CA)，運行EISIS電化學實驗軟件(University of California，Irvine)(也可使用類似的商業軟件THALES)。測量開路電勢(OCP)作為金屬試樣和Ag/AgCl參考電極之間的電勢，測量極化阻抗(Rp)作為低頻的阻抗值(阻抗的虛數部分為0或忽略不計)。連續培養的腐蝕速率估算為極化阻抗的反量(Macdonald，D.D.和M.C.H.McCubre，Applications ofimpedance spectroscopy，p.262-267，In J.R.Macdonald(編)，ImpedancespectroscopyEmphasizing solid materials and systems，John Wiley & Sons，NewYork(1987)；Stern，M.，Journal of Electrochemical Society，105(11)638-647(1958))。
抗微生物性分析為了測定宿主枯草桿菌BE1500和多粘芽孢桿菌對表達的抗微生物劑的敏感性，讓這些菌株從單一菌落在25毫升LB培養液中，于37℃搖動生長至O.D600為0.40-0.45。收集1毫升的等份樣品，用新鮮LB培養液洗滌，然后重新懸浮于無菌Eppendorf管中的100微升新鮮LB培養液中。加入抗微生物劑indolicidin和殺細菌素(50-100微克/毫升)，將管子在30℃不搖動地孵育1小時。將適當稀釋的各份樣品鋪在LB瓊脂平板上，在37℃孵育過夜以確定存活度。這些結果通過2次獨立實驗而加以證實。
通過將懸浮的大腸桿菌BK6暴露于濃的培養物上清液，確定indolicidin和殺細菌素在芽孢桿菌中的表達(重復2次)。大腸桿菌BK6生長至O.D600為0.20-0.25，在室溫下離心，然后再懸浮于不同體積(50或100微升)的濃縮上清液中。細胞懸浮液在不通氣下30℃孵育1小時，然后將合適的稀釋液接種于LB瓊脂平板以確定上清液的抗微生物活性。
枯草桿菌構建物上清液抑制懸液中SRB的能力，是通過將500微升后指數期D.vulgaris培養物(O.D600＝0.15-0.20)懸浮于等體積的25倍濃縮的枯草桿菌BE1500培養物上清液(抗微生物劑構建物在前面實施例中所述的厭氧條件下)而加以測定。細胞在30℃孵育1小時，存活的SRB用3管最近似值(MPN)分析法(Greenberg，1992)進行計數。
為了用3管最近似值(MPN)法測定生物膜中的活SRB數目，將生物膜在無菌水中淋洗一次以去除松散附著的細胞，從304不銹鋼試樣(直徑2.5厘米，厚1.2毫米)上刮下，再懸浮，然后在如Jayaraman等人所述的厭氧條件下以新鮮的改良的Baar培養液作系列稀釋。生物膜中的需氧細菌數目，通過將合適的稀釋液接種于LB瓊脂平板而加以確定。
結果表達宿主對抗微生物肽的敏感性在30℃暴露1小時后，與多粘芽孢桿菌相比，枯草桿菌BE1500和枯草桿菌WB600表現出對純化的抗微生物肽indolicidin(非酰胺化形式，50和100微克/毫升)的敏感性高數千倍，對純化的肽殺細菌素(50微克/毫升)的敏感性高數百倍(見表II)。因此，對于表達所測試的抗微生物肽，多粘芽孢桿菌是一種優于其他測試物種的宿主，因為它對非酰胺化indolicidin和殺細菌素有抗性。
表II.在30℃暴露1小時后，宿主菌株對純化的抗微生物劑的敏感性細胞數目的下降倍數細菌 indolicidin indolicidin殺細菌素50μg/mL 100μg/mL 50μg/mL枯草桿菌BE1500 6000 10,000 100多粘芽孢桿菌10401 4 4 2枯草桿菌WB600 20,00040,000 400用大腸桿菌穿梭載體克隆抗微生物肽用大腸桿菌穿梭載體pBE92構建細菌表達系統，以產生pBE92-Ind、pBE92-Bac和pBE92-ProBac。它們利用了apr啟動子和信號序列，從而在芽孢桿菌(Bacillus)中組成型地表達和分泌抗微生物肽。在pBE92中的堿性磷酸酶被含apr信號序列最后3個氨基酸(Ser-Ala-Ser)以及完整抗微生物劑基因的NheI-HindIII插入片段所替換。
檢測芽孢桿菌分泌的抗微生物肽純化的indolicidin(非酰胺化形式)，當以230ng/孔上樣時可用考馬斯染色檢測到，但是以23ng/孔上樣時無法檢測。純化的indolicidin和殺細菌素，以250ng/孔上樣時也無法用銀染法檢測到。用兔產生的針對indolicidin的多克隆抗體(1∶250稀釋液，使用枯草桿菌BE1500(pBE92-Ind)培養上清液(濃縮25倍)稀釋)進行Western印跡，也不能揭示出對應于indolicidin的條帶；然而，抗體對indolicidin是非特異性的并且結合于許多細胞蛋白。殺細菌素的一級氨基酸序列表明，產生多克隆抗體是非常困難的(Dr.Shing-Erh Yen，ZymedLabortories Inc.，個人交流)；因此，沒有合成針對該肽的多克隆抗體。
在芽孢桿菌培養上清中的indolicidin和殺細菌素對懸浮培養和生物膜中大腸桿菌和D.vulgaris的抗微生物活性測定了帶有抗微生物質粒的枯草桿菌BE1500的濃縮培養上清殺滅大腸桿菌BK6和D.vulgaris的能力。對于陰性對照實驗(其中使用枯草桿菌BE1500(pBE92)和枯草桿菌BE1500(pBE92-Ind)的上清液)沒有觀察到大腸桿菌BK6和D.vulgaris活力的下降(表III)；然而，用枯草桿菌BE1500(pBE92-Bac)和枯草桿菌BE1500(pBE92-ProBac)的上清液時觀察到殺滅了近93％的大腸桿菌BK6和殺滅了83％D.vulgaris。該結果表明，殺細菌素已經被表達、分泌入培養上清中，而且在胞外環境中二硫鍵被正確地處理從而形成了環狀的活性殺細菌素(在該研究中大腸桿菌被用作陽性對照，以顯示該肽被表達且具有活性，并且表明SRB的抑制是由于該肽而不是由于暴露于氧氣或其他外部因素)。
在304不銹鋼暴露于表達克隆的抗微生物劑的枯草桿菌BE1500之后5天，用三管MPN分析法(表IV)計數活SRB的數目。在枯草桿菌BE1500(pBE92-Bac)形成的生物膜中存在的SRB，比枯草桿菌BE1500(pBE92)和枯草桿菌BE1500(pBE92-Ind)所形成的生物膜中少近60倍，而用枯草桿菌BE1500(pBE92-ProBac)時發現SRB少了10倍。表III 大腸桿菌BK6和D.vulgaris對表達抗微生物劑的枯草桿菌BE1500濃縮培養上清的敏感性。數據是兩次獨立實驗的平均值E.coli BK6 D.vulgarisCFU/mL 抑制 MPN/mL 抑制(％)(％)新鮮培養液 9×1070 8.29×1050緩沖液+卡那霉素100μg/mL 4×10399.996 --枯草桿菌BE1500(pBE92)8.7×1073 8.29×1050枯草桿菌BE1500(pBE92-Ind)7.9×107128.29×1050枯草桿菌BE1500(pBE92-Bac)6×106931.43×10587枯草桿菌BE1500(pBE92-ProBac) 7×106921.43×10583表IV 5天后，在304不銹鋼上表達抗微生物質粒的枯草桿菌BE1500生物膜的需氧生物膜中，對SRB的抑制作用(用MPN法測定)。數據來自兩次獨立實驗的生物膜。質粒 活的SRB 抑制 活的枯草桿菌MPN/mL BE1500，CFU/mLpBE925.13×10502.3×108pBE92-Indolicidin3.59×10530 2.3×108pBE92-殺細菌素 8.64×10398 1.9×108pBE92-Pro殺細菌素5.13×10490 6.2×108用產生克隆的抗微生物肽的芽孢桿菌菌株進行批量和連續培養腐蝕研究研究了產生抗微生物劑的構建物對靜態搖瓶中SAE1018軟鋼上SRB生長的抑制作用。一旦將SRB(O.D600＝0.16-0.20)加至不產生抗微生物劑的P.fragi K培養液中，就在18小時內檢測到強烈的硫化氫氣味。還伴隨著形成硫化鐵黑色沉淀，這表明SRB在金屬表面上的需氧生物膜中生長和定居。與P.fragi K相比，枯草桿菌BE1500能夠延緩SRB腐蝕的發生36-48小時(以硫化鐵黑色沉淀和硫化氫氣味出現的延遲為證)。
與P.fragi K和枯草桿菌BE1500相比，所有3種產生抗微生物劑的構建物在枯草桿菌BE1500中都能延遲SRB腐蝕發生96-120小時。然而，在7天后更新生長培養液會導致所有菌株都在36小時內出現黑色沉淀。
將SRB添加到帶P.fragi K的304不銹鋼連續反應器中，使得加入SRB后36小時內，在測量的最低頻率處(1.4×10-3Hz)的阻抗值下降了5倍。該下降還伴隨著反應器出口處有硫化氫氣味，并且反應器因硫化鐵的形成而變成灰色。低頻相角也下降(c.f.，82度vs.68度)。對于陰性對照枯草桿菌BE1500(數據未給出)和枯草桿菌BE1500(pBE92)(圖3)也觀察到阻抗譜的類似變化，盡管變化也延遲了24小時。與之相反，3種產生抗微生物劑的構建物能夠減少阻抗譜變化的程度(圖3)。indolicidin構建物抑制SR表達效力最低，低頻相角從80度變為69度；然而它仍小于對照pBE92(從80度至61度)中所觀察到的變化。殺細菌素構建物(具有或不具有pro區域)比indolicidin構建物更有效，低頻相角僅下降至76度。這些結果表明，SRB在304不銹鋼上的生長受到殺細菌素構建物的明顯抑制。
用表達克隆的抗微生物劑的枯草桿菌WB600(一種6個胞外蛋白酶有缺陷的菌株)(Wu等人，1991)，也獲得了類似結果(圖4)。將SRB添加到304不銹鋼上的枯草桿菌WB600(pBE92)和枯草桿菌WB600(pBE92-Ind)生物膜上，分別使低頻相角下降了35度和17度；相應地，低頻阻抗也分別下降了7倍和5.5倍。然而，用兩種表達殺細菌素的生物膜沒有觀察到這種下降，盡管殺細菌素構建物似乎比pro-殺細菌素(原殺細菌素)構建物稍更有效(圖4)。這暗示，在該蛋白酶缺陷菌株中沒有有效地對pro-區域進行加工以釋放成熟的殺細菌素。
用除天然產生的抗微生物劑之外還產生克隆的抗微生物劑的芽孢桿菌菌株，進行批量和連續培養腐蝕研究在批量和連續培養中，研究了多粘芽孢桿菌ATCC10401(它產生抗微生物肽-多粘菌素)對SRB在軟鋼上定居的抑制作用。在批量培養中，與不產生抗微生物劑的P.fragi K相比，多粘芽孢桿菌能夠延遲SRB腐蝕的發生60小時。更換生長培養液并不導致金屬立刻被SRB占據(該現象見于P.fragi K和枯草桿菌BE1500)，并且在72小時內檢測不到黑色沉淀。因此，產生多粘菌素的多粘芽孢桿菌能延遲SRB在批量培養中的生長。
在304不銹鋼的連續反應器中，添加SRB在近250小時內并不改變阻抗譜(這與P.fragi K在36小時導致阻抗譜變化相對，圖5)。在反應器的出口處沒有檢測到硫化物氣味，而且反應器的濁度也不增加，這在P.fragi K、枯草桿菌BE1500和枯草桿菌WB600中也觀察到。因此，多粘芽孢桿菌能夠在連續反應器中抑制SRB在304不銹鋼上的生長。類似的腐蝕抑制作用，用具有抗微生物構建物的多粘芽孢桿菌中也觀察到(圖5)，而且抑制程度與野生型菌株無法區分。
討論按Piers等人，1993和Pang等人(1992)類似的方法，陽離子型抗微生物肽indolicidin和殺細菌素在枯草桿菌BE1500中，以融合于胞外堿性蛋白酶(apr)信號肽的融合形式組成型地表達。indolicidin和殺細菌素的合成寡核苷酸被設計成與信號序列精確融合，從而不會將額外的氨基酸添加到該肽的N端。這保證了表達的肽有最高活性而且避免了Pang等人(1992)觀察到的不當加工(Pang等人的表達系統在蝎子昆蟲毒素I5A的N端添加了7個氨基酸)。通過在信號肽和殺細菌素基因之間插入B.amyloliquefaciens的芽孢桿菌RNA酶的pro-部分(Paddon等人，1989)，還產生了pre-pro-肽形式的殺細菌素。類似的pre-pro-防衛素融合物，可導致完全防止分泌的肽在金黃色葡萄球菌中發生蛋白水解降解(Piers等人，1993)并且對于在陰離子的pro-區域和陽離子的肽之間形成二級結構有貢獻。
indolicidin在芽孢桿菌中以酸形式表達，而在牛嗜中性白細胞中天然存在的indolicidin在其C末端是酰胺化的。枯草桿菌的活力因indolicidin下降了4個數量級，而多粘芽孢桿菌對indolicidin并不表現出相同程度的敏感性。這暗示枯草桿菌不是一種理想的在生物膜中表達indolicidin的表達宿主，尤其是在生物膜中indolicidin并不象懸浮培養中會擴散開來并因此攻擊宿主細胞。
大腸桿菌BK6對枯草桿菌BE1500濃縮培養上清的敏感性，被用作上清液的抗微生物活性的指標，因為該細菌通常被用于評估陽離子型肽的抗微生物活性(Romeo等人，1988；Selsted等人，1992)。我們的研究表明，枯草桿菌BE1500(pBE92-Ind)的上清液不能抑制大腸桿菌，而枯草桿菌BE1500(pBE92-Bac)和枯草桿菌BE1500(pBE92-ProBac)的上清液可有效地降低大腸桿菌BK6的活力。
在我們的連續反應器試驗中，我們觀察到枯草桿菌BE1500(pBE92)和枯草桿菌BE1500(pBE92-Ind)的生長沒有差別，這暗示indolicidin的表達很差。這也得到了如下情況的證實根據阻抗譜變化推斷出，在連續反應器中用該構建物表現SRB缺乏抑制(圖3)。枯草桿菌BE1500對殺細菌素的抗性高于對indolicidin的抗性(因子為60)，這可解釋殺細菌素構建物對不銹鋼上SRB的抑制能力。
304不銹鋼連續反應器試驗清楚地表明，SRB的生長被抑制了(根據定性指標例如硫化氫氣味和硫化鐵沉淀，以及根據定量的極化阻抗Rp的下降)。殺細菌素構建物能比indolicidin構建物更有效地抑制SRB生長，這表明殺細菌素被表達且正確加工從而形成了二硫鍵，因為二硫鍵加工不正確的防衛素通常是無活性的(Piers等人，1993)。然而，很明顯SRB沒有被完全從生物膜中去除，因為所有的反應器在加入SRB后變得更渾濁，而且在含枯草桿菌BE1500(pBE92-Bac)的反應器中仍可檢測到輕微的硫化物氣味。與對照pBE92相比，產生殺細菌素的構建物對SRB的抑制作用，還得到了在7天批量培養的304不銹鋼生物膜上存活的SRB下降了36倍這一事實的證實(表IV)。然而，即使在殺細菌素存在下，仍檢測到近1×104SRB/毫升，這證實SRB沒有被克隆的抗微生物肽完全殺滅。
產生多粘菌素的多粘芽孢桿菌(野生型)也能延緩SRB在軟鋼上批量培養中的生長60小時(以及SRB所導致的腐蝕發生)。將產生抗微生物劑的質粒引入多粘芽孢桿菌并不顯著提高其殺滅軟鋼上SRB的能力。但是在連續反應器中304不銹鋼上生長的多粘芽孢桿菌，能夠完全抑制SRB的生長(可達275小時)。我們觀察到，D.vulgaris不能以單培養物形式在不銹鋼上生長(而在軟鋼上能生長)，這也能解釋這些抗微生物劑僅在不銹鋼上有效抑制SRB。
該實施例的數據表明，SRB在不銹鋼上的生長可通過在生物膜內產生肽抗微生物劑而加以控制，并且表明它可用于防止微生物引起的鋼腐蝕。多粘芽孢桿菌抑制SRB生長的有效性，提供了對與SRB型腐蝕作斗爭的雙重殺滅系統進行優化的基礎，在這些系統中，低水平的兩種抗微生物劑(天然產生的一種抗微生物劑和克隆的抗微生物劑)能夠同時抑制SRB。
實施例5用分泌克隆的抗微生物劑的細菌抑制SRB在軟鋼和不銹鋼上的定居和腐蝕該實施例表明了，通過使用分泌抗微生物劑的細菌，能在軟鋼和不銹鋼上生物膜中抑制SRB的定居和厭氧腐蝕。
常用的抗生素氨芐青霉素被用作該研究中的對照抗微生物劑，以顯示在SRB定居之前加入抗微生物劑可能是一種減少SRB引起的腐蝕的有力手段。如前面實施例中所示，10個氨基酸的環狀肽-短桿菌肽S可抑制SRB，而且它還可作為典型的肽抗生素從外部加入，以顯示在生物膜中產生肽抗微生物劑能否抑制軟鋼和不銹鋼的腐蝕。此外，用超產生短桿菌肽S的短芽孢桿菌18菌株(Azuma等人，1992)，可形成分泌短桿菌肽S并且抑制不銹鋼上SRB的生物膜。
材料和方法菌株、生長培養基和培養條件所有的需氧細菌在10毫升改良的Baar培養液(ATCC培養液1249)中，于30℃和250rpm(Series 25搖床，New Brunswick Scientific，Edison，NJ)下從單菌落生長而得，并用作形成生物膜的接種物。D.vulgaris在15毫升帶螺旋帽的試管中，與補充有100微升每種除氧劑4％硫化鈉和Oxyrase(Oxyrase Inc.，Mansfeld，OH)的10毫升改良的Baar氏培養液中培養。最初的培養物是用-85℃甘油母菌液生長而得；所有隨后的培養物用3％最初培養物的接種物，在30℃不搖動地生長。D.vulgaris在牢固密封的帶螺旋帽的試管常規培養，并暴露于空氣中的氧氣而無任何培養上的困難(如Angell和White(1995，同上)所報道的那樣)。D.vulgaris培養物還定期地在0.1％硫酸亞鐵銨存在下培養，然后通過檢測培養試管中黑色硫化鐵證實這些硫酸鹽還原菌的存在。常規地進行脫硫綠毛霉素(desulfoviridin)分析(Postgate，1984)，并在紫外線下檢測粉紅色來證實D.vulgaris的存在。短桿菌肽S得自Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)，氯霉素得自Fisher Scientific(Pittsburgh，PA)，而鉬酸銨購自Aldrich ChemicalCompany(St.Louis，MO)。
金屬試樣的制備從片材上切下用于批量培養試驗的軟鋼SAE1018試樣(直徑25.5毫米，厚1.2毫米)以及用于連續培養試驗的SAE1018軟鋼和304不銹鋼片(7.5×7.5厘米見方，厚1.2毫米)，并按以前報道的方法(Jayaraman等人，1997a)進行制備。
批量培養腐蝕試驗批量培養腐蝕試驗是如前所述(Jayaraman等人，1997a)，在30℃，250毫升錐形燒瓶中不搖動條件下進行。將暴露于D.vulgaris的軟鋼試樣(一式三份)，通過用0.01％鉻酸擦拭表面然后以溫水反復洗滌而加以清潔；所有的其他試樣都按以前所述(Jayaraman等人，1997a)進行清潔。比質量損失(mg/cm2表示的試樣總表面積，11.18平方厘米)被用作腐蝕程度的指標(假設腐蝕程度是均勻的)。每隔7天補充生長培養液，并且通過緩慢沿瓶壁加入而替換(含有合適的抗生素)。在形成需氧生物膜3天后，將3％(體積/體積)SRB接種物加至燒瓶中。
用EIS進行連續培養腐蝕試驗如前所述(Jayaraman等人，1997c)，用連續反應器在金屬表面上形成生物膜。用Solarton-Schlumberger電化學測量儀(SI1280，Schlumberger TechnicalInstruments Division，San Jose，CA)在至少2次重復試驗中用電化學阻抗光譜法(EIS)來測定阻抗數據。該儀器連接于Macintosh計算機(PowerMac 7100/80，Apple Computer，Cupertino，CA)，運行EISIS電化學實驗軟件(University ofCalifornia，Irvine)(也可使用類似的商業軟件THALES)。測量開路電勢(OCP)作為金屬試樣和Ag/AgCl參考電極之間的電勢，并且用Mansfeld等人開發的ANALEIS軟件(ASTM Special Technical Protocol 1154186(1992))測定極化阻抗作為阻抗的dc極限。用試驗的極化阻抗Rp，根據Stern-Geary等式Rp＝B/Icorr來估算連續培養腐蝕速率，其中B是基于Tafel斜率的參數而Icorr是腐蝕電流強度(可用Faraday法則將其轉化為腐蝕速率)(Mansfeld，F.，The polarizationresistance technique for measuring corrosion currents，In Fontana，M.G.，Staehle，R.W.(編)，Advances in Corrosion Science and Technology，Plenum Press，NewYork(1976))。
在形成需氧生物膜3-5天后，將3％(v/v)SRB接種物(培養時間為24-48小時)加至反應器中。根據文獻(Saleh等人，1964)中可用的最低抑制濃度，并且根據本實驗室得出的懸浮培養中SRB對各種無機物和抗微生物劑的敏感性數據，將氨芐青霉素(200微克/毫升)、氯霉素(200微克/毫升)、氨芐青霉素(200微克/毫升)和氯霉素(200微克/毫升)兩者、以及氨芐青霉素(200微克/毫升)和鉬酸銨(200微克/毫升)兩者加至反應器(在SRB定居于金屬之前或之后)，以抑制SRB。所有的抗微生物劑都以合適的濃度同時加至養料和反應器。
對生物膜中活SRB的計數在250毫升錐形燒瓶中的304不銹鋼試樣(直徑25.5毫米，厚1.2毫米)上，用改良的Baar培養液，30℃2天，產生了需氧生物膜。將1.0％(體積/體積)D.vulgaris接種物(O.D600＝0.16-0.18)加入，并讓其在生物膜上再定居4天。小心地將金屬試樣從燒瓶中取出，通過浸入蒸餾水漂洗2次而去除松散附著的細胞。用無菌刮勺將生物膜刮下，然后懸浮于500微升改良的Baar培養液中。通過平板計數確定需氧細菌，并用3管MPN分析法(Greenberg，1992，同上)計數活的SRB。
結果不產生抗微生物劑的P.fragi K和D.vulgaris對SAE1018軟鋼的批量和持續腐蝕在靜態批量培養(30℃)中，在P.fragi K和D.vulgaris存在下，檢測改良的Baar培養液中軟鋼SAE1018試樣的質量損失28天。只要D.vulgaris存在于生物膜中，試樣就覆蓋著厚的黑色沉積物并且難以清潔。與P.fragi K的單培養物相比，P.fragi K和D.vulgaris的雙重培養物在21天暴露期后腐蝕速率上升了1.8倍。然而，在兩種情況下觀察到的腐蝕速率都總低于用無菌改良的Baar培養液所觀察到的腐蝕速率(表V)。用D.vulgaris單培養物在SAE1018鋼上所觀察到的腐蝕速率高于無菌培養液中的腐蝕速率，在14天后高1.4倍，在21天后高2.5倍(根據表V推出)。當D.vulgaris在金屬試樣上定居之前將氨芐青霉素(100微克/毫升)加入燒瓶時，與將氨芐青霉素在SRB之后加入時相比，測得的質量損失下降了40％(1周)至14％(3周)(表V)。對暴露于D.vulgaris的金屬試樣的宏觀檢查揭示，對于所有試驗都存在無數的點腐蝕。
在連續反應器(頂部空間空氣流速為200毫升/分鐘)中，厭氧的D.vulgaris以單培養物形式生長，其標志是形成黑色硫化鐵沉淀和反應器出口有硫化氫氣味。與無菌對照相比，D.vulgaris在連續反應器中的生長在72小時后使Rp上升了90倍。在SRB生長后240小時加入200微克/毫升氨芐青霉素不改變Rp，而且反應器仍為黑色且排放處有硫化氫的獨特氣味(表VI)。然而，320小時后一起加入200微克/毫升氨芐青霉素和200微克/毫升鉬酸銨可使反應器上清液澄清；然而，仍檢測到硫化物氣味，這表明腐蝕速率并沒有下降而且SRB的生長沒有被抑制。
將D.vulgaris加入到連續的P.fragi K反應器中，會在36小時后使軟鋼的Rp提高3倍并改變相角的頻率相關性；反應器變為黑色而且在反應器出口檢測到硫化物的氣味(表VI和圖6)。在加入D.vulgaris之前，阻抗在低頻下達到穩定的漸近值(4.52×104Ohm·cm2)；然而，在加入SRB的24小時內，反應器變黑并檢測到硫化物的氣味，而且阻抗在低頻下(1.4×10-3赫茲)不再達到漸近值。在SRB生長120和150小時后，加入200微克/毫升氨芐青霉素(表VI)和一起加入100微克/毫升氨芐青霉素和25微克/毫升氯霉素(數據未示出)也不能使Rp回復至加入SRB之前的值，這表明對SRB沒有抑制作用。
表V在需氧細菌和代表性SRB*的雙重培養物的批量培養中，SAE1018鋼的腐蝕損失產生的抗腐蝕損失mg/cm2菌株微生物劑 3天 7天 10天 14天 21天 28天32天無菌培養液 - - 0.54±0.08 0.77±0.11- 1.03±0.04- 2.05±0.11P.fragi K 無 0.04±0.01 - 0.19±0.050.33±0.05 0.38±0.01- 0.43P.fragi K+SRB 無 0.04±0.01 - 0.35±0.010.52±0.08 0.71±0.08- 0.86±0.17P.fragi K+SRB+Amp100無 0.04±0.01 - 0.35±0.010.42±0.04 0.56±0.08- 0.65±0.07P.fragi K+Amp+SRB 無 0.04±0.01 - 0.25±0.040.33±0.04 0.49±0.07- -D.vulgaris ATCC29579無 0.095 0.191 - 1.225 - 3.83-枯草桿菌ATCC6633枯草菌素 0.13±0.01 0.45±0.08 - 0.57±0.08 - - -枯草桿菌ATCC6633+SRB枯草菌素 0.13±0.01 0.52±0.03 - 0.81±0.04 - - -短芽孢桿菌ATCC35690 伊短菌素 0.07±0.01 0.16±0.03 - 0.19±0.01 - - -短芽孢桿菌ATCC35690+SRB 伊短菌素 0.07±0.01 0.23±0.04 - 0.28±0.03 - - -短芽孢桿菌18短桿菌肽S 0.09±0.01 0.16±0.02 - 0.28±0.06 - 0.40±0.06 -短芽孢桿菌18+SRB短桿菌肽S 0.19±0.02 - 0.30±0.07 - 0.44±0.06 -*列于第1列中的次序表示了它們被加至培養物中的次序。例如“P.fragi K+SRB+Amp 100”表示將P.fragi K細菌加入培養中并讓其形成生物膜，加入SRB并讓其在生物膜中定居，然后再將氨芐青霉素加至培養液中。
表VI 在各種殺滅SRB的方法后，在需氧菌和SRB雙重培養物的連續反應器中SAE1018鋼的腐蝕行為*
*列于第1列中的次序表示了它們被加至培養物中的次序。例如“P.fragi K+SRB+Amp 100”表示將P.fragi K細菌加入培養中并讓其形成生物膜，加入SRB并讓其在生物膜中定居，然后再將氨芐青霉素加至培養液中。
注1根據可利用的等價電路模型，無法計算阻抗譜的Rp
不產生抗微生物劑的P.fragi K和D.vulgaris對S.S304不銹鋼的持續腐蝕對于暴露了近900小時后的304不銹鋼，在無菌Baar培養液和P.fragi K的阻抗譜之間沒有觀察到差別。D.vulgaris不能在304不銹鋼上以單培養物形式生長，并且將D.vulgaris加至P.fragi K反應器會在48小時內改變更低頻率處阻抗的頻率相關性(圖7)。在加入SRB后，相角顯示出最小值，這表明在非常低的頻率處出現新的時間常數(圖7)，而且相角的最大值從81度下降為69度。
阻抗譜的變化伴隨著在反應器出口處檢測到硫化物氣味，而且反應器還變灰。向雙重培養物反應器中添加200微克/毫升氨芐青霉素(圖7)、一起加入200微克/毫升氨芐青霉素和100微克/毫升氯霉素(表VII，第2列)、或一起加入200微克/毫升青霉素和200微克/毫升鉬酸銨(數據未示出)，并不能使阻抗譜變成在加入D.vulgaris之前(圖7)所觀察到的簡單的單時間常數行為，也不能使硫化氫和硫化鐵的產生停止，這表明SRB沒有被殺死。
表VII在各種殺滅SRB的方法后，在需氧菌雙重培養物的連續反應器中304不銹鋼的腐蝕行為*<
>*列于第1列中的次序表示了它們被加至培養物中的次序。例如“P.fragi K+SRB+Amp100”表示將P.fragi K細菌加入培養中并讓其形成生物膜，加入SRB并讓其在生物膜中定居，然后再將氨芐青霉素加至培養液中。
在加入D.vulgaris之前，生物膜暴露于純化的抑制SRB的抗微生物劑下的持續腐蝕速率為了確定在SRB定居之前加入抗微生物劑是否能夠有效地抑制SRB，在加入D.vulgaris之前，將SAE1018軟鋼和304不銹鋼上的不產生抗微生物劑的P.fragi K生物膜暴露于100微克/毫升氨芐青霉素或短桿菌肽S24小時。使過夜懸浮培養中生長至飽和的P.fragi K暴露于100微克/毫升的兩種抗微生物劑；因此，它不因加入這些抗微生物劑而受影響。
在加入氨芐青霉素后將D.vulgaris加至軟鋼和不銹鋼反應器時，在100小時內沒有觀察到阻抗譜和Rp的變化(圖6和7，表VI和VII)。在反應器出口沒有觀察到硫化物氣味；因此，在反應器中D.vulgaris被這種抗微生物劑完全抑制。從外部加入100微克/毫升的環狀十肽抗微生物劑-短桿菌肽S，也能完全有效地抑制D.vulgaris在304不銹鋼試驗中的生長，這可從阻抗譜的電容特性看出(圖7和表VI)；然而，對于軟鋼而言，在暴露于SRB80小時后反應器變灰盡管Rp沒有上升(圖8和表VII)。因此，與沒有短桿菌肽S存在的D.vulgaris和P.fragi K相比，D.vulgaris所引發的軟鋼腐蝕的發生被延遲了。
產生抗微生物劑的芽孢桿菌和D.vulgaris對SAE1018軟鋼和304不銹鋼的批量和持續腐蝕速率用D.vulgaris和產生抗微生物劑的芽孢桿菌生物膜(根據所報道有抗微生物肽產生，表V)對SAE1018鋼試樣進行的批量腐蝕研究表明，所有的芽孢桿菌都能在1周內限制D.vulgaris的定居(證據是與改良的Baar培養液中P.fragi K較大的1.8倍增加相比，腐蝕速率增加得較小，為1.2-1.4倍(表V)，而且不顯現黑色也不產生硫化物氣味)。然而，在7天后更換培養液時，除了短芽孢桿菌18之外的所有燒瓶都變黑，而且在24小時內檢測到硫化鐵。在該芽孢桿菌存在下D.vulgaris的腐蝕速率的增加(增加1.2-1.5倍)，與用P.fragi K和D.vulgaris所見的增加相當(增加1.6倍)。用短芽孢桿菌18和SRB時所觀察到的質量損失，與僅用P.fragi時相當，比用P.fragi K和SRB時好近2倍(表V)。在試驗過程中沒有檢測到硫化物氣味。短桿菌肽S對SRB在批量培養物中生長的抑制有效性得到了如下的證實與不產生抗微生物劑的P.fragi K生物膜相比，在生長4天后304不銹鋼上短芽孢桿菌18生物膜中檢測到的活SRB下降了3個數量級(c.f.，5.47×102/mLvs.8.47×105/mL)(用3管MPN分析法)。
用短芽孢桿菌18(一種高產生短桿菌肽S的菌株)(Azuma等人，1992)時獲得的連續培養腐蝕速率，是在SAE1018軟鋼上存在D.vulgaris下獲得的(圖9和表VI)；將D.vulgaris加入到軟鋼上的P.fragi K之后所觀察到的Rp增加，被延遲了24小時。最后，SRB似乎在生物膜上定居了，其證據是反應器出口有硫化氫氣味；然而Rp仍恒定在5.78×104Ohm·cm2(與加入SRB之前的3.43×104Ohm·cm2相對)。
圖8和表VII表明，將D.vulgaris加至304不銹鋼上的短芽孢桿菌18生物膜，在120小時后不導致Rp下降，盡管在加入D.vulgaris后48小時在反應器出口檢測到硫化物的氣味。因此，產生短桿菌肽S的短芽孢桿菌18能夠抑制SRB在304不銹鋼上定居，盡管它不能延遲SRB在SAE1018軟鋼上的生長。
討論選擇D.vulgaris作為代表性的硫酸鹽還原菌，以研究原位產生的抗微生物劑在抑制厭氧腐蝕方面的有效性，因為已報道D.vulgaris會加速腐蝕(Gaylarde，1992)，而且該物種的菌株能夠耐受氧應力(Hardy，J.A.，Hamilton，W.A.，Curr.Microbiol.6259-262(1981))。在靜態批量培養和具有氧飽和頂部空間的連續反應器中，以及在腐蝕的軟鋼試樣中，D.vulgaris表現出作為單培養物生長的出色適應性，證據是培養液的黑色褪去了(Gaylarde，1992，同上)。D.vulgaris還能在搖瓶(在液體上方的頂部空間氧氣飽和條件下)以及在連續反應器(進入反應器頂部空間的空氣流速為200毫升/分鐘)中的需氧生物膜中生長。在該研究中，D.vulgaris的生長條件與Gaylarde(1992，同上)以及Hamilton和Lee(1995)(Biocorrosion，p.243-264，In Barton，L.L.(編)，Sulfate-reducing Bacteria，Plenum Press，New York)所用的條件非常相似，并且該條件被稱為是最具侵蝕性的(當少量氧氣存在于SRB培養物中，它導致最大的腐蝕速率)。
與暴露于P.fragi K單培養物相比，暴露于P.fragi K和D.vulgaris的批量培養物的軟鋼金屬試樣表現出腐蝕速率上升，這與Jack等人(Corr.Sci.331843-1853(1992))和Gaylarde(1992，同上)所報道的情況相似。為了抑制D.vulgaris的生長而向批量培養物中加入各種組合的抗生素，并不能成功地抑制腐蝕(表V)。然而，與單培養物對照相比，產生抗微生物劑的芽孢桿菌批量培養物能夠在7天內延緩發生SRB引起的腐蝕。大多數芽孢桿菌的這種SRB抑制作用在更換了生長培養液后而大幅下降。因為大多數抗微生物劑是次生的代謝產物(Bailey，J.E.，Ollis，D.F.，Biochemical Engineering Fundamentals，2版，McGraw-Hill PublishingCompany，New York(1986))，并且是在生長穩定期中產生的(Doi，R.H.，McGlouglin，M.1992.Biology of Bacilli，Application to industry，Butterworth-Heinemann，Boston，MA(1992))，因此在7天后更換生長培養液可能會除去生物膜中的絕大部分抗微生物劑，因而使得D.vulgaris能夠在再次產生抑制水平的抗微生物劑之前在金屬表面上定居。然而，短芽孢桿菌18可在28天內完全抑制SRB生長，因為制備該菌株所用的誘變導致它過度產生短桿菌肽S(Azuma，等人，1992)。該結果表明短桿菌肽S能夠殺滅SRB，并且還表明不僅抗微生物劑能夠在SRB定居之前通過其他細菌而成功引入生物膜中，而且以這種方式引入的抗微生物劑物質能夠成功地抑制SRB生長。
軟鋼和不銹鋼的阻抗譜，被用于研究在這些金屬的連續培養中所觀察到的腐蝕行為。將D.vulgaris添加至軟鋼反應器中SAE1018上的P.fragi K時，會使Rp上升，這表明腐蝕速率降低了。這種看上去矛盾的觀察結果可以被解釋為在金屬表面上形成了氧化物層；因為改良的Baar培養液的pH為7.5(中性)，形成的鐵銹層不能象在更酸性環境中所預計的那樣溶解。鐵銹的這種積累導致Rp上升以及腐蝕速率的表觀下降。有關SRB抑制的EIS結果有效性，得到了證實，即根據批量培養的質量損失試驗計算出的Rp值與用EIS法對軟鋼獲得數值之間有良好的相關性(表VII)。
對于軟鋼上的P.fragi K以及P.fragi K+氨芐青霉素+SRB(圖6)，觀察到簡單的單時間常數(OTC)，這在中性培養液中均一腐蝕情況下是典型的(Mansfeld，F.，Lorenz，W.J.，Electrochemical impedance spectroscopy(EIS)Application incorrosion science and technology，In Varma，R.，Selman，J.R.(編)，Techniques forcharacterization of electrodes and electrochemical processes，John Wiley &amp; Sons，New York(1991))(以下簡稱Mansfeld和Lorenz，1991)，而且這兩個試驗中所獲得的Rp和電容值(C)是相似的(表VII)。對于P.fragi K和SRB在軟鋼上，在最低頻率處的相角的頻率相關性暗示，存在一新時間常數(這可能是因為點腐蝕)，而對P.fragi K+SRB+氨芐青霉素的對稱頻率相關性以及與P.fragi K相比整個阻抗曲線的位移，可能是因為更高的Rp(圖6)。類似的電容值也出現在P.fragi K+SRB以及P.fragi K+SRB+氨芐青霉素在軟鋼上的譜中；然而，不可能將這些譜與簡單的等價電路相擬合并獲得定量的Rp和C值。短芽孢桿菌18、短芽孢桿菌18+SRB以及P.fragi K+短桿菌肽S+SRB在軟鋼上的阻抗譜表現出均一腐蝕中常見的頻率相關性，而且Rp可以被確定為阻抗模量|Z|的dc限度(＝0度)(圖9)。
暴露于具有無菌培養液的反應器的不銹鋼樣品，也不能達到穩定的低頻阻抗值。在無菌對照和具有P.fragi K或短芽孢桿菌的304不銹鋼反應器之間的阻抗譜缺乏差別，這表明在此期間發生了非常少的腐蝕。該結果與Hernandez等人(1994)的觀察結果類似。對于9種鹽溶液中的軟鋼，在20天內他們沒有觀察到穩定的低頻阻抗值并將此歸咎于沒有腐蝕。
P.fragi K和P.fragi K+氨芐青霉素+SRB的304不銹鋼阻抗譜是電容式的(capacitive)，其中高的Rp值接近2×107Ohm·cm2且電容值在100和200μF/平方厘米之間。這表明了在中性培養液中不銹鋼發生的典型的均一腐蝕(Mansfeld和Lorenz，1991)。對于P.fragi K+SRB以及P.fragi K+SRB+氨芐青霉素在304不銹鋼上，觀察到類似于軟鋼的、與純電容式行為的偏差現象(圖7)，而且不可能將這些阻抗值與簡單EC相擬合。對于P.fragi K+SRB還觀察到一個新的時間常數，這以最小的值在約0.01Hz為證(圖7)。短芽孢桿菌18、短芽孢桿菌18+SRB以及P.fragi K+短桿菌肽S+SRB的阻抗譜都是電容式的，而且用短芽孢桿菌18和短芽孢桿菌18+SRB所觀察到的Rp和C值類似于用P.fragi K所觀察的數值(圖8)。
盡管在不將試驗數據與合適的等價電路相擬合的情況下，所有暴露條件下腐蝕速率變化的程度不能被精確地確定，但人們能夠得出結論在加入SRB后因硫化氫的產生會導致腐蝕速率增加。類似地，在加入SRB后304不銹鋼相角的變化(圖7b)，表明發生了額外的電化學過程并且暗示有局部的腐蝕(Mansfeld和Lorenz，1991)。因此，在加入SRB之前就存在純化的抗微生物劑時，或者在短桿菌肽S由生物膜產生時，阻抗譜缺乏變化表明了在不銹鋼上的SRB受到抑制(圖8)。
已知氨芐青霉素和氯霉素分別在1微克/毫升和3微克/毫升時能夠抑制D.vulgaris的懸浮培養物(Odom和Singleton，1993)。因為已知生物膜對生物殺傷劑的抗性大10-1000倍(Cheung和Beech，1996)，因此在該研究中使用的兩種抗生素高達200微克/毫升的劑量。然而，在SRB已定居于金屬表面之后加入時，這些添加物質不能停止硫化物的進一步產生，也不能使兩種鋼的腐蝕速率下降。這與Franklin等人(1991)(Corrosion 47128-134)的觀察結果相符(他們觀察到SRB能夠在暴露于鹵素型生物殺傷劑后存活至少26小時)，并且也與Franklin等人(1989)(An analogue MIC system with specific bacterial consortia，to test effectivenessof materials selection and countermeasures，Presented at the Corrosion 89，NewOrleans，LA，National Association of Corrosion Engineers，Houston，TX)的觀察結果相符(他們報道，在加入生物殺傷劑后生物膜菌群下降了3-4個數量級，但是注意到在停止生物殺傷劑后24小時內菌群就恢復到處理前的密度)。對于該研究中的軟鋼反應器，也觀察到類似的結果；當含氨芐青霉素的培養液停止后，在36小時內明顯發生了SRB引起的腐蝕。
實施例6對水冷卻塔進行接種以防止SRB相關腐蝕的用法本實施例顯示了將本發明用于“接種”水冷卻塔以防止SRB引起的腐蝕。一個新的水冷卻塔被安裝在發電廠。當塔準備投入使用時，將多粘芽孢桿菌培養物(該菌已重組改造以分泌濃度約1-10微克/毫升的殺細菌素)，以約103至106細胞/毫升的濃度加至水源中(較佳地該菌被置于稀釋的價廉復合營養肉湯(如LuriaBertani培養液)中)，然后通過水塔循環。在用于“接種”塔的水干燥之前，將正常的自來水源接于水塔，然后塔開始正常的運作。
實施例7用于保護現有設施的用法本實施例顯示了處理早已投入使用的管線的方法。從表面上刮下管道潮濕部分，然后培養管道的生物膜中的細菌。根據標準(例如遺傳轉化和培養的方便性和可靠性)，選擇一種或多種培養的革蘭氏陽性菌品種(它們是優選的，因為這種細菌僅有一層細胞膜，通過該細胞膜可分泌抗微生物劑或抗腐蝕劑或者兩者)。然后，通過與編碼殺細菌素基因的染色體插入載體(如pCNB5)結合，而轉化選定的革蘭氏陽性菌。轉化后的細菌被培養然后測試，以證實抗-SRB劑的分泌。使抗-SRB劑分泌測試中呈陽性的培養物大量生長，然后將等份的所得的培養物以約103至106細胞/毫升的終濃度，定期地引入管線。
在本說明書中提及的所有出版物和專利申請都在此全部引用作為參考，就好象每個出版物或專利申請被具體和單獨地指明被引用作為參考。
盡管為了清楚理解，已通過闡述方式和實施例詳細地描述了上述的本發明，然而對于本領域的一般技術人員而言，很明顯在本發明教導之后，可以在不背離所附權利要求的精神和范圍的情況下，對本發明進行某些改變或修改。
權利要求
1.一種抑制硫酸鹽還原菌在選自易腐蝕材料和易降解材料的材料上生長的方法，其特征在于，該方法包括在該材料上施用細菌，該細菌分泌數量足以抑制硫酸鹽還原菌在該材料上生長的化學物質。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該易腐蝕材料是金屬。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，該金屬是鋼。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，該鋼是軟鋼。
5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，該鋼是不銹鋼。
6.如權利要求2所述的方法，其特征在于，該金屬是鋁或鋁合金。
7.如權利要求2所述的方法，其特征在于，該金屬是銅或銅合金。
8.如權利要求2所述的方法，其特征在于，該金屬選自下組鈦、鎳、鈦合金和鎳合金。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該易降解材料是混凝土。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該易降解材料是鋼筋混凝土。
11.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該易降解材料是水泥。
12.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該細菌是需氧細菌。
13.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該細菌是假單胞菌屬。
14.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該細菌是芽孢桿菌屬。
15.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該化學物質是施用于該材料的細菌物種的野生型細菌不分泌的。
16.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該細菌已經過重組改變，從而分泌比該細菌物種的野生型細菌更高水平的化學物質。
17.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該化學物質是抗生素。
18.如權利要求16所述的方法，其特征在于該抗生素選自下組短桿菌肽S、indolicidin、多粘菌素和殺細菌素。
19.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該化學物質是聚天冬氨酸。
20.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該化學物質是聚谷氨酸。
21.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該化學物質是聚甘氨酸。
22.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該化學物質是鐵載體。
23.一種抑制材料腐蝕的系統，該材料選自易腐蝕材料和易降解材料，其特征在于，該系統包括在表面上有生物膜的材料，所述生物膜包含細菌，該細菌分泌數量足以抑制硫酸鹽還原菌在該材料上的生長的化學物質。
24.如權利要求23所述的系統，其特征在于，該易腐蝕材料是金屬。
25.如權利要求24所述的系統，其特征在于，該金屬是鋼。
26.如權利要求25所述的系統，其特征在于，該鋼是軟鋼。
27.如權利要求25所述的系統，其特征在于，該鋼是不銹鋼。
28.如權利要求24所述的系統，其特征在于，該金屬是鋁或鋁合金。
29.如權利要求24所述的系統，其特征在于，該金屬是銅或銅合金。
30.如權利要求24所述的系統，其特征在于，該金屬選自下組鈦、鎳、鈦合金和鎳合金。
31.如權利要求23所述的系統，其特征在于，該易降解材料是混凝土。
32.如權利要求23所述的系統，其特征在于，該易降解材料是鋼筋混凝土。
33.如權利要求23所述的系統，其特征在于，該易降解材料是水泥。
34.如權利要求23所述的系統，其特征在于，該細菌是芽孢桿菌屬。
35.如權利要求23所述的系統，其特征在于，該細菌是假單胞菌屬。
36.如權利要求23所述的系統，其特征在于，該化學物質是施用于該材料的細菌物種的野生型細菌不分泌的。
37.如權利要求23所述的系統，其特征在于，該細菌已經過重組改變，從而分泌比該細菌物種的野生型細菌更高水平的化學物質。
38.如權利要求23所述的系統，其特征在于，該化學物質是抗生素。
39.如權利要求38所述的系統，其特征在于該抗生素選自下組短桿菌肽S、indolicidin、多粘菌素和殺細菌素。
40.如權利要求23所述的系統，其特征在于，該化學物質選自下組聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚甘氨酸和鐵載體。
全文摘要
本發明涉及通過使用分泌殺菌化學物質的細菌來防止或預防降解或腐蝕的領域。具體地,本發明涉及可天然地或通過使用重組技術而分泌化學物質的細菌的用途,這些化學物質可抑制硫酸鹽還原菌在金屬、混凝土、灰漿或其他易腐蝕或降解的表面上的生長。
文檔編號A01N63/00GK1273509SQ99801093
公開日2000年11月15日 申請日期1999年5月3日 優先權日1998年5月6日
發明者T·K·伍德, A·賈亞拉曼, J·C·厄斯曼 申請人:加利福尼亞大學董事會