專利名稱：自動脫葉的植物的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有新的和改良特性的棉屬植物(Gossypium hirsutumL)，尤其是具有自動脫葉之特性的棉屬植物。本發明還涉及決定自動脫葉之特性的一個或多個基因。
背景技術：
在包括澳大利亞的很多國家，棉花生產是主要的工業。所有的棉花纖維都是由Gossypium屬植物產生。種植最多的棉屬植物品種是Gossypiumhirsutum(American Upland棉花)，該品種產生中等纖維長度的棉花，在可得到充分灌溉的美國，澳大利亞，巴基斯坦和其它國家可以種植該品種。埃及棉花具有較細長的纖維，是由Gossypium barbadense產生的，在埃及和蘇丹得以廣泛種植。在印度，巴基斯坦和其它亞洲國家無法灌溉的地區種植的是草棉和樹棉，它們產生較粗短的纖維。
商購種子貯存物的純度被小心地管理著以避免品種之間的雜交或種子混合造成的問題。
然而，傳統意義上的棉屬植物培養需要高強度的農業實踐，包括深灌溉和使用殺蟲劑。如Heliothis caterpillar的多種害蟲和多種棉鈴蟲使棉屬植物趨向于病害和侵擾，迄今為止，控制這些害蟲需要廣泛使用化學殺蟲劑。另外，由于需要機械收獲，在收獲前需使用脫葉劑以除去植物的葉，使棉鈴易于進入收獲的機械。
因此，棉花種植業成為相當嚴重的環境污染的誘因，該行業處于減少向環境中釋放化學物質的強大壓力之下。人們越來越多地使用一體化的害蟲管理技術，經基因工程的技術被改造成對病害具有抗性，或可表達細菌來源的天然殺蟲劑蘇云金芽孢桿菌毒素的棉屬植物逐漸為棉花種植者所用。然而，迄今為止尚無可替代收獲前使用化學脫葉劑的方法。
盡管據說多年生棉花的野生種，如G.aridum D4，G.GossypioidesD6和G.trilobum D在旱季到來時會失去在雨季時長出的葉，但迄今為止未在商業種植的棉株中發現自動脫葉現象。
多年以來，人們盡量使用傳統的繁殖方法以鑒定和選擇對侵擾這些植物的主要昆蟲和真菌病害具有改良抗性或具有其它所需特性的棉株。同時，繁殖的計劃針對的是產生自動生色的棉花，這樣就不需要在織物加工的過程中使用化學染料了。
前蘇聯技術科學研究院成員Vitor Fursov教授于1962年3月倡導了棉屬植物發展計劃。
1962至1993年之間的計劃涉及開發在商業條件下繁殖和受試的，具有特別之特征的棉株。它們包括具有綠色，米色，棕色和雪白等多種顏色的棉株。人們驚奇地發現自動生成米色和棕色的棉株對主要的昆蟲和真菌病害具有超級抗性并具有殺細菌的特性。
在澳大利亞進行的對棉株的進一步開發，產生和選擇鑒定出某些具有自動脫葉之特性，而無需使用化學脫葉劑的棉株。
發明簡述本發明一方面提供了自動脫葉的棉屬植物。在一個實施方案中，植物具有經激活后可影響棉屬植物自動脫葉的基因或其功能性片段。
特別優選的實施方案中提供了棉株(Gossypium hirsutum)，其特征在于植本發明還提供了自動脫葉的植物，其包括經激活后可影響棉屬植物自動脫葉的核酸或其功能性片段。
本發明的第二方面涉及自動脫葉的棉屬植物，其具有如圖3所示的DNA指紋圖。植物含有決定棉株自動脫葉的核酸序列(脫葉基因)，該基因可被化學處理和放射照射激活。優選核酸序列含有SEQ ID NO2所示的序列。更優選基因被哌嗪(Aziridine)處理和電離輻射所激活。
本發明的第三方面提供了激活棉株脫葉基因的方法，所述方法包括下列步驟用哌嗪和電離輻射處理所述棉株的種子。優選用0.1％v/v哌嗪水溶液將選定的具有所需特征或性狀的親本棉屬植物雜交產生的雜種種子處理10小時，接著用20,000倫琴吸收劑量的γ射線放射照射所述種子50秒，優選劑量為4000倫琴。通過將種子暴露于鈷60γ射線源，如MPX-γ3以進行適當的放射照射。
本發明的第四方面涉及表現出自動脫葉的棉屬植物，負責自動脫葉的基因可被化學和放射照射方法所激活，或者可由親本植物遺傳得到。
優選棉花纖維的顏色選自米色，雪白，棕色和綠色。也優選棉屬植物對Thielaviopsis babicola，Fusarium vasinfectum和/或Bemisia tabaci引起的一種或多種病害具有抗性。
在特別優選的實施方案中，植物品種選自本文所述的Rainbow 34，Rainbow39，Rainbow38和Rainbow 37。顯然，這些品種的主要特征性差異是棉花纖維的顏色。
整個植株，種子和得自植株的其它可繁殖材料，包括插條和原生質體皆為本發明的一部分。另外，得自棉屬植物的產物，包括棉花纖維和由此產生的織物也是本發明的一部分。
另一方面，本發明提供了被本發明的自動脫葉基因轉化的棉屬植物。具體地說，經基因工程改造的棉株及其生產方法是已知的。Agracetus和Monsanto的研究人員有大量專利和文獻出版物描述了轉化棉屬植物的方法和表達外源蛋白質，如蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白的轉基因棉屬植物。這種轉基因的棉屬植物已被廣泛地用于田間試驗，一些棉株已用于商業生產。
為了本說明書的目的，術語“自動脫葉”被理解為指的是在110天至135天的生長周期內，葉從植株的較低區域至較高點自動脫落，此時澆水可延遲生長周期。
約在第110至135天時，棉鈴全部張開。
術語“激活”指的是將休眠的脫葉基因轉變為其表達或表達產物能使含有此轉變基因的植物自動脫葉的基因。激活包括通過突變或除去封閉劑或抑制其活性使休眠基因解封閉。也包括將按上述方式激活的基因遺傳下去。
貫穿本說明書的描述部分和權利要求書，“含有”一詞指的是包括但不限于，而不排除其它添加劑，組分，整數或步驟。
發明詳述僅參照下列非限制性的實施例和圖以詳細描述本發明，其中


圖1包括本發明優選實施方案之植株Rainbow 34(
圖1A)和Rainbow39(
圖1B)的照片。
圖2闡明了與非自動脫葉的比較棉株Sicala-34相比，Rainbow 39在棉鈴張開時自動脫葉的方式。
圖3顯示出Rainbow 39和比較棉株Sicala-34的DNA指紋圖。
圖4是顯示Rainbow 34，Rainbow 39和Sicala-34之單向方差分析結果的方框圖。
實施例1產生雜種種子以激活脫葉基因對棉屬植物的系譜數據的分析表明最初的親本品種5476I和7631I的雜交可能在雜種后代中產生了具有高紡績和技術參數的白色和淺米色纖維。
首先，在每個變種中，使選定原種或P種子經受不少于1000-1500個種子結實率為75％的授粉花相互雜交，F2植株與F3植株雜交。在第二代雜種中，通過播種并對植株進行本領域技術人員所熟悉的子代測驗譜系法以選擇所需的特征。從異基因復合體中挑選分離的親緣株，產生具有精確測定之主要特征的后代。具體地說，將對真菌和細菌疾病和害蟲的抗性，棉花纖維的顏色用作選擇標準。1978至1993年在俄羅斯進行了這一選擇計劃，1995至1996年，澳大利亞政府與悉尼大學簽約執行此選擇計劃。
使均一的家系雜交以形成新的品種，即俄羅斯技術科學研究院的Fursov教授培育出的“Genetic 1”，該品種于1978年被記載于Turkmenistan棉花選擇學會的選擇目錄中。之所以選擇此品種是因為其產生的棉花纖維的技術和紡績性能。實施例2處理雜種并選擇自動脫葉通過暴露于0.1％的哌嗪水溶液10小時以處理按實施例1所述產生的雜種。
所使用的哌嗪水溶液的濃度為0.025-0.05，和0.1-0.4％(v/v)。
使用不同濃度的此誘變劑會導致不同程度的突變。處理后，對突變程度的定量分析和定性分析的結果表明誘變劑對最近選擇的品種“young”的作用最大，但雜種的產量也特別高。在誘變劑的水平一定時，基因型越不均一，突變的程度越大。哌嗪的最適濃度為0.1％。
用0.1％的哌嗪處理10小時之后，用鈷60γ射線源MPX-γ3以20,000倫琴的劑量對雜種進行γ-放射照射50秒，優選劑量為4000倫琴。用多劑量的γ-放射照射，以-0.25-0.05，-1.0-2.0，-3.0-5.0的水平放射照射棉花種子。10.0-20.0的劑量是半-致死劑量，30.0-60.0的劑量是超致死劑量。然而，在儲存中，半致死劑量不是絕對有害的，需仔細觀察種子的恢復。
將經處理的種子置于紗布袋中，于室溫下儲存18個月。
儲存18個月之后，將選定家系的種子播種于第三代雜種中，選擇原種植株，包括那些表現出自動脫葉之能力的植株，使它們相互雜交。夏天播灑儲存的種子，秋天時進行挑選，將每個植株放在各自的袋中。將畸變的百分比測定為因γ-放射照射所致的表型變化，形態修飾，畸形和其它非遺傳的新生長的頻率。選擇并記錄因突變所致的表型變異和任何可見的改變之后，將引起各個表型的種子各軋成皮棉，保存為獨立的家系以待來年播種。
以下簡述了產生本發明之棉屬植物的系譜方案F3(7631-I×5476-I)×F2(5476-I×7631-I)然后用0.1％的哌嗪將這些親代的天然雜種子代處理10小時。從經處理的種群中選擇種子以形成種子的M2和M3代。然后從中選擇最好的品系進行雜交。實施例3繁殖能產生有色纖維的自動脫葉的棉株；Rainbow系列將按實施例2所述進行處理的最佳種子品系頂交，選擇母本形式最為顯著的4個棉株。其余棉株被當成父本形式雜交。
通過表型的顯性化測定自動脫葉的第一代遺傳特征。通過個別選擇搜集到所有的特征。在第二代中，測定種群不均一性或可遺傳性的系數。多基因性導致第一代雜種中出現顯性表型。
使用這一選擇方法產生了具有天然白色和淺米色纖維的，完全能自動脫葉的棉花品種，如Rainbow 34[淺米色]和Rainbow 39[白色]。
分別被稱為Rainbow 38和Rainbow 37的兩個其它的棉株也被選擇用于開發。這些品種的特征示于表1。
表1本發明的優選的品系的特征Rainbow 34 Rainbow 38 Rainbow 37形狀散布 散布 散布葉密度 中等 中等 中等高度(av.) 中等高度92cm 中等高度60-112cm 中等高度68-105cm節數/枝條(av.) 5-6 2-52-5葉形和大小(av.) 掌形17700mm2掌形15400mm2掌形16080mm2腺/蜜腺 ++ +花瓣色 奶油色 米色 米色纖維色 米色 棕色 綠色棉鈴大小(av.) 46mm×32mm 48mm×34mm 50mm×32mm棉鈴形 橢圓囊狀 橢圓囊狀 橢圓囊狀棉鈴絨纖維的含量高 高 高棉鈴絨纖維的顏色奶油色 棕色 綠色纖維長度(av.) 36mm 35mm 35mm纖維細度(av.)單位？ 細3.65 細3.88 細3.80棉鈴張開時 94％ 89％ 91％自動脫落棉株Rainbow 34和Rainbow 39的植株示于
圖1，Rainbow 39在棉鈴張開時失去葉的方式示于圖2。
使用本領域現有技術進行獲得所需結果所必需的大量試驗以再現本發明是可行的。根據布達佩斯條約的規定，于1998年7月2日將Rainbow 39種子的樣品保藏于澳大利亞政府分析實驗室中，保藏號為NM 98/06259。這些種子也被保藏于悉尼大學的保藏中心，澳大利亞Cobbitty，N.S.W的植物研究和檢疫站。
選擇白色和突變顏色的，自動脫葉之棉株的方法和限定自動脫葉之方法的一般原理如下第一年為了繁殖最初形式的兩種棉花G.hirsutum和G.peruvianum Cav，對后代進行如實施例2所述的處理，選擇通過任何特征表現出早期天然脫葉基因型的顯性突變體。
第一年期間產生任一最初形式或品種，以使攜帶所選性狀之種子的總數在異源品種群中不少于105-106。將種子用突變劑1，4二重氮乙酰丁烷(bisdiazoacetyl butane)的0.1％(v/v)濃度水溶液處理20分鐘，然后以流水沖洗2小時，取一份樣品在重度施肥田中按每個洞4-5cm深處3個種子進行播種。4-5cm深處的土壤溫度優選12-15℃。預期60cm×20-25cm的試驗田含有3株植物或90cm×15cm的試驗田含有3株植物。
出苗后，一個洞中只剩下2株植物。出現兩片真正的葉子后，進一步減小試驗區的密度，使一個洞中只含有一株植物。
在植物生長期間進行測量和發育表型觀察，以揭示供體型并將之標記以備后續選擇。
在開花期和棉鈴成熟期，花、葉、莖絨毛、花粉顏色及棉鈴形狀的所有形態學變異都于未處理植物的相比較，有任何發現均作記錄。
棉鈴張開時，經個體選擇選出突變的所有克隆形式。對所收集的材料進行分析、軋棉機軋并貯藏直至來年。
第二年第一年的、顯示有所需特征的種子經貯藏并于第二年播種，以便選擇經減數分裂產生的、相對于未經突變劑處理而正常產生之種子的多個突變。然后進行形態觀察和自動脫葉動力學檢驗。
隨時間變化的脫葉百分指數非常重要首先，現象應是可以觀察到并明確定性的。
其次，數量指數是任何比較或離散因素分析所必需的。
經個體選擇收集所選自動脫葉植株的產物，分析棉鈴質量、纖維產量、波長、纖維指數、1000種子質量、米數、長纖維斷裂長度、蜿蜒度、光澤、顏色等。貯藏種子直至來年播種。
第三年在第三年培養期間檢驗所選自動脫葉株和其它供體型之間的穩定性和遺傳純度。遺傳的、同源的突變體百分數按所測確定品系。所有這些品系都經過個體選擇，并進行文庫級定量檢驗。
第四年及隨后諸年對有前景并有競爭力的新品系完成最終研究后，進行綜合品系級檢驗(comprehensive varietal grade test)，對穩定型進行仔細檢查以確保所需早期天然脫葉、白色和自然成色纖維等特征得以保留。
這些特征通常經證實在第三個培養年的開始保留了一致性。有了精確的播種日志，品系中任何不明顯特征或污染物種的等級均做了標記。然后用表現出的兩個優秀特征的隨后定級進行育種研究(選擇)。排除品質不良的或易受粉虱攻擊的品系，并終止對它們的進一步篩選。
留下的植株同時選自最高產品系，并用于檢驗品系純度，和用以確保對粉虱危害的持久抗性。
培養最優良育種品系，以人工刺激物為本底進行等級檢驗和研究。為此，取10份棉鈴樣品進行復合分析。然后由所選組群提供2.5-3.0kg的純級種子并凍存以備后用。
棉株脫葉率以兩種方法規定1.主莖脫落的葉子(果節葉棱數)對總葉數的比率，包括一定時間內已主莖上已脫落葉子的百分數。
這些比率可以如下公式表示D＝(Cf/F)×100％(一個植株的脫葉)D＝[Cf/(Cf+con f)]×100％在F＝Cf+con f其中D 脫葉Cf葉棱數(來自Latin瘢葉(Latin-cicatris folii)F 總葉數con f 死葉子和保留的葉子棉株自動脫葉最好與棉鈴張開和成熟同時發生，而這一特征越早被檢測到，就越有商用價值。
自第二代篩選穩定、可早期自動脫葉的優良植株。它們代表顯性和隱性突變，這些突變可以是自動脫葉棉株變種的祖先，無需解開對基因的封閉。表現早期天然自動脫葉的植株命名為“Fc”，源自Latin foliumcaolucus(落葉)。
本發明的化學誘變法可對進步型突變進行快速、常規篩選。
此外，有效誘導自動脫葉的最大可能性由與DNA有化學親和的試劑的化學作用確保。雖然所觀察到的優點與任何已知機制均無關，但據信化學物如哌嗪的親和力連同放射照射處理可逆轉對休眠或“跳躍”脫葉基因(顯性同隱性一樣)的封閉，由此活化之。
使用本領域現有技術進行獲得所需結果所必需的大量試驗以再現本發明是可行的。
本發明的其它數據示于表2-5。表2Gossipium品種1995“Rainbow 39”與比較者(*)的比較品種名稱比較RAINBOW-39 SICALA-34*植株高度(mm)平均 1305.0 778.00標準差156.99 169.85LSD(0.01)/顯著性 120.18 P≤0.01葉形 掌形掌形葉棉子酚腺有 有葉蜜腺有 有花色奶油色 奶油色棉球大小cm3(1)平均 39.90 30.70標準差9.899 6.292LSD(0.01)/顯著性 2.674 P≤0.01棉球形橢圓囊狀橢圓囊狀棉球形狀H/W(2)平均 1.8765 1.587標準差0.1618 0.1114LSD(0.01)/顯著性 2.674 P≤0.01梗長(mm)平均 11.20 18.50標準差1.8525 2.0283LSD(0.01)/顯著性 2.674 P≤0.01纖維顏色白色白色(1)以最老的未開的棉球符合的理論圓錐的體積表示棉球大小(2)以高/寬的比代表棉球形狀(*)在檢疫溫室中表2續Gossipium品種的比較(*＝比較者)RAINBOW-39 SICALA-34*植株高度(mm)平均 906.70910.4標準差 127.91158.64LSD(0.01)/顯著性 47.13 NS葉寬(mm)平均 161.72142.1標準差 21.76 18.53LSD(0.01)/顯著性 7.98 P≤0.01葉長(mm)平均 124.72108.10標準差 16.11 14.51LSD(0.01)/顯著性 5.35 P≤0.01棉鈴高mm平均 52.79 47.45標準差 4.73 5.76LSD(0.01)/顯著性 1.97 P≤0.01棉鈴形狀H/W平均 1.38 1.37標準差 0.095 0.174LSD(0.01)/顯著性 0.0486NS梗長(mm)平均 26.24 27.37標準差 5.323 7.15LSD(0.01)/顯著性 2.085 NS表2續Gossipium品種的比較(*＝比較者)RAINBOW-39 SICALA-34*絨纖維(％)平均 31.835.98標準差 1.413.71LSD(0.01)/顯著性 5.32NS纖維長(ins)平均 1.261.142標準差 0.0182 0.0249LSD(0.01)/顯著性 0.0607 P≤0.01纖維強度(g/tex)平均 32.24 46.58標準差 2.512.5094LSD(0.01)/顯著性 7.73P≤0.01穩定性特征育種者一代平均值一代平均值平均值同(S)信息 或狀態或狀態的差異(D)？脫落是是是 S葉形成 掌形 掌形 掌形S葉棉子酚腺 有有有 S葉蜜腺 有有有 S花色奶油色奶油色奶油色 S棉鈴形 橢圓囊狀 橢圓囊狀 橢圓囊狀S絨纖維色白色 白色 白色 S表2續一致性-異花傳粉種以下方差比作為一致性的證據特征 新品種的方差 參比品種的方差新/參比的比‘Rainbow-39’ ‘Sicala’植株高安街16360 25090 0.65棉鈴長22.28 33.18 0.67棉鈴形9.025-030.029 0.31梗長 28.3 51.12 0.55絨纖維％ 0.74 4.88 0.15纖維長3.31-046.2-040.53表3Gossipium品種1995“Rainbow 39”的比較品種名稱 比較RAINBOW-39 SICALA-34*植株高度(mm)平均906.70 910.4標準差 127.91 158.64LSD(0.01)/顯著性47.134 NS葉大小cm2(1)平均101.44 77.93標準差 26.008 18.904LSD(0.01)/顯著性8.61 P≤0.01葉形掌形 掌形葉形H/W(2)平均1.31 1.33標準差 0.1022 0.1551LSD(0.05)/顯著性1.968 NS葉棉子酚腺 有 有葉蜜腺 有 有花色 奶油色 奶油色棉球大小cm3(1)平均62.855 47.092標準差 15.842 11.713LSD(0.01)/顯著性2.593 P≤0.01棉球形 橢圓囊狀 橢圓囊狀棉球形狀H/W(4)平均1.3818 1.3610標準差 0.0948 0.1726LSD(0.01)/顯著性2.593 NS表3續梗長(mm)平均 26.24 27.25標準差5.3227 7.0559LSD(0.01)/顯著性 2.593 NS纖維顏色白色 白色(1)以最老的葉的高和寬所成的三角形面積測定葉的大小(2)寬/高的比代表葉的形狀(3)以最老的未開的棉球符合的理論圓錐的體積表示棉球大小(4)以高/寬的比代表棉球形狀纖維細度值平均 2.67 3.52標準差 0.11 0.38LSD(0.01)/顯著性 0.15 P≤0.01纖維延伸(％)平均 5.9 6.14標準差 0.51 0.055LSD(0.01)/顯著性 0.864NS纖維一致性指數(％)平均 89.2687.8標準差 1.17 1.15LSD(0.01)/顯著性 3.24 NS表3續個別特征葉形 掌形掌形葉棉子酚腺有 有葉蜜腺有 有花色 奶油色 奶油色棉鈴形橢圓囊狀橢圓囊狀纖維色白色白色一致性-異花傳粉種以下方差比作為一致性的證據特征 新品種的方差 參比品種的方差 新/參比的比‘Rainbow-39’‘Sicala-34’植株高度16360.97 25166.65 0.65葉形0.01 0.0240.42棉球形 8.98704-030.03 0.31梗長28.3349.790.57STATTISTIC 4.1單向AOVR34 R39 SIC來源 DF SS MS F P間2 34719.0 17359.531.45 0.0000內297 1.639E+05551.927總299 1.986E+05CHI-SQ DFP等偏差的BARTLETE ------ -------------檢測 11.012 0.0041COCHRAN Q 0.4085最大VAR/最小VAR 1.8928組間偏差的成分168.076有效的CELL大小100.0變量 平均 樣本大小 組間標準差R34100.00 10024.941R39101.44 10026.008SIC77.932 10018.904總 93.123 30023.493300例丟失0例表4續STATTISTIC 4.1LSD(T)平均值的配對比較變量 平均值 同類組R39 101.44 IR34 100.00 ISIC 77.932 ..I有兩組中的平均值與另一組的無顯著差異臨界T值 2.592 干擾水0.010比較的臨界值 8.6133比較的標準差 3.3224
表4續STATTISTIC 4.1描述統計R34R39 SICN 100100 100丟失 0 00總和 1.000E+04 1.014E+047793.2LO 95％CI 95.054 96.275 74.181平均值 100.00 101.44 77.932UP 95％CI 104.95 106.60 81.683SD 24.941 26.008 18.904SE平均值 2.4941 25.640 24.257C.V. 24.940 25.640 24.257最小 51.920 51.300 43.6101ST QUARTI 84.025 83.585 64.190中值 94.400 99.120 78.1003RD QUARTI 109.20 111.24 91.412最大 183.06 222.00 131.95MAD11.800 13.650 13.845偏差 615.81 669.63 353.78偏移 1.0511 1.6782 0.3960峰值 1.3222 5.0449 -0.2032
表5Gossypium hirsutum‘Rainbow-39’異名‘Genetic 39’說明植株散布；中等高度；密葉；結果枝長。葉；帶有短柔毛的中脈的掌形并且有棉子酚腺和蜜腺并且在成熟時脫落。花奶油色。棉鈴是帶有26.24mm的梗的橢圓囊壯。纖維長在“鯊皮法”測定時為1.26英寸。纖維一致性指數89.26％，延長5.9％，強度32.24g/tex而細度值為2.7。
起源通過輻射育種系‘Turkmenistan Genetic 1’的種子誘發突變。育種者V.N.Fursov，Ashgabat，Turkmenistan教授。在下文中，用世代譜系法選擇早熟的帶有長纖維的自落葉植株直到建立穩定的品種。
比較實驗比較者Sicala-34。1994/95在Rydalmere的國家檢疫站的溫室中，1995/96在Sydney大學，植物育種所，Narrabri進行。測量值來自重復四次的隨機安排的完全區組的實驗中隨機選擇的95個植株。纖維質量數據來自通過“鯊皮法”的絨纖維，測試重復5次。溫室生長的植株也呈現出長纖維。
適應性‘Rainbow-39’可在棉花可生產的任何地區生長。
實施例4 其它實施方案種間雜種-以前在F1中-用5種濃度的哌嗪水溶液處理，連同對照品種一起播種于0.25公頃的試驗田中。
然后在實驗室的試驗中培養新獲得的品種的育種株/后代F3-Chem3，對最佳突變品系用頂交法重新授粉，每個白色或米色基因型還帶有100％自動脫葉特征。
為限定F1中項交的脫葉性狀的遺傳特征而測定表型顯性度P。
這些F1雜種顯示，當與所選最優自動脫葉突變品系雜交時，最初形式的自動脫葉特征具有顯性，培育出本文命名為“BD”的品種，作為篩選方法的產物。
在F2中，限定了雜種之自動脫葉特征的遺傳可能性。突變后代中和雜種F2-F3代群體中的不均勻程度可用遺傳可變性或由Allard公式計算的遺傳能力系數確定，公式如下h2 任一特征的遺傳能力系數G2 P1 第一親代離散性G2 F1 雜種F1代離散性G2 P2 第二親代離散性G2 F2 雜種F2代離散性h2=G2F2-G2F1+G2P1+G2P23G2F2]]>實施例5Rainbow 39的DNA指紋圖由政府分析實驗室的分子生物學實驗室按合同在DNA指紋圖試驗中比較了Rainbow 39的DNA提取物與Sicala-34(比較株)的DNA。
從兩株Gossypium hirsutum品種(Rainbow 30和Sicala 34)中以鯨蠟基三甲基溴化銨(CTAB)法提取基因組DNA樣品。CTAB是破壞細胞壁與核酸形成復合體的一種去污劑。CTAB-核酸復合體隨后可從碳水化合物中純化并分離(Brian等1994，Scott等1994)。將CTAB提取的DNA再進一步純化以去除DNA聚合酶抑制物。首先，向CTAB提取液中加入聚吡咯烷酮乙烯(PVP)。PVP可促進多酚和其它有機物質的沉淀(Kim等，1997)。其次，將所得DNA沉淀團用市售DNA純化基質InstaGene MatrixTM(BIO-RAD)溫育。此基于樹脂的基質能有效吸附干擾PCR擴增過程的細胞裂解產物。結果顯示，用按照這一新方法提取的棉株DNA獲得了令人滿意的PCR擴增。從40個隨機選擇的10體引物篩選出用于產生DNA指紋圖的合適10體引物。
產生棉株的DNA指紋圖需要大量的基因組DNA。因此需用新鮮幼齡葉片組織提取DNA。不新鮮的棉株葉片組織DNA水平極低，而多酚和其它抑制物的水平很高。
提取的DNA用隨機擴增的多形性DNA聚合酶鏈式反應(RAPD PCR)技術分析。
RAINBOW 39和SICALA 34的DNA指紋圖顯示，有三個引物單獨使用后產生的RAINBOW 39和SICALA 34指紋圖具有顯著性差異，而大多數引物產生的指紋圖相同。這說明RAINBOW 39和SICALA 34是密切相關的棉花品種。但如圖3所示，有一個引物(引物z11)產生的RAINBOW 39和SICALA 34的指紋圖具有可遺傳的差異。用引物z11產生的DNA指紋圖凝膠分布圖顯示RAINBOW 39和SICALA 34之間有不同的RAPD PCR表現(第四泳道和第六泳道)。DNA大小用DNA standard GENESCAN-2500指示。
獲得DNA指紋圖的方案詳述如下從Gossypium hirsutum中提取基因組DNA脫氧核糖核酸(DNA)從新鮮幼齡棉株葉片中經下述方案提取。
(1)250mg棉株組織在研缽中與20μl 2-巰基乙醇(SIGMA，M-3148)一起研磨直至植物組織具有乳脂狀稠度。
(2)600μl 2X提取液加入組織中，繼續研磨直至組織溶液變清亮(2X提取液2.0％鯨蠟基三甲基溴化銨，1.4M NaCl，100mMTris-HCl pH 8.0，20mM乙二胺四乙酸，1.0％聚吡咯烷酮乙烯)。
(3)將組織液轉移至1.5ml微管中，于65℃溫育5分鐘。
(4)向組織液中加入600μl氯仿/異戊醇(24∶1)，用渦流混合器徹底混合以形成乳液。然后將微管在10,000xg離心5分鐘。
(5)將上層水相中的溶液轉移至新微管，每管含600μl異丙醇，顛倒混合直至白線樣DNA鏈形成可見的團塊。
(6)將微管冰浴10分鐘，于5,000xg離心2分鐘。
(7)用移液管去除上清。
(8)加入400μl高鹽TE緩沖液于65℃溫育10分鐘使DNA裂解(高鹽TE緩沖液10mM Tris-HCl pH 8.0，1.0mM乙二胺四乙酸pH 8.0，1.0M NaCl)。
(9)加入800μl無水乙醇使DNA沉淀，顛倒混合直至線樣DNA鏈形成可見團塊。
(10)將微管冰浴10分鐘，于5,000xg離心2分鐘。
(11)用移液管去除上清。
(12)室溫下使微管敞于空氣中1小時使DNA沉淀干燥。
(13)加入200μl 10％(w/v)Chelex100樹脂(BIO-RAD)的TE液并于55℃溫育30分鐘使DNA重新裂解。(TE緩沖液10mMTris-HCl pH 8.0，1.0mM乙二胺四乙酸pH 8.0)。
(14)重新裂解的DNA溶液于12,000xg離心10分鐘。
(15)將DNA上清轉移至新的微管。
(16)樹脂沉淀懸浮于200μl TE緩沖液，室溫放置20放置。然后重復第(14)和第(15)步。
(17)核糖核酸(RNA)從DNA溶液中去除的方式是向微管中加入2μl Rnase(20mg/ml)并于37℃溫育30分鐘。
(18)用溴乙錠熒光定量法測量DNA濃度和量。
(19)此時的DNA可用于RAPD PCR分析或貯于4℃。用隨機擴增的多形性DNA聚合酶鏈式反應(RAPD PCR)產生DNA指紋圖本方案用隨機擴增的多形性DNA聚合酶鏈式反應(RAPD PCR)技術產生DNA指紋圖，其中用到一個任意序列的10體寡聚核苷酸引物來擴增棉屬植物Gossypium hirsutum品種(RAINBOW 39和SICALA 34)的基因組DNA。用GeneScan 672軟件分析RAPD PCR產物。(i)RAPD PCR過程RAPD PCR在25μl體積中進行，其中有近25ng棉屬植物基因組DNA，100pM單一10體引物z115｀-CTCAGTCGCA-3｀(SEQ ID NO1)2.0mM MgCl2，10mM Tris-HCl，，pH 8.3，16.6mM(NH4)2SO4，100μg/ml明膠，0.45％Triton-X100，100μM dATP，100μM dCTP，100μM dGTP，100μM dTTP，0.1μM dUTP，1.0單位Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer)。反應在0.5ml的覆蓋有礦物油的微管中進行。在預熱至95℃的熱循環儀(HYBAID，OmniGene，U.K.)中循環。共執行45個循環，每個循環為94℃1分鐘，36℃1分鐘和72℃2分鐘，分別用于DNA變性、引物退火和引物延伸。PCR產物貯于-20℃。(ii)RAPD PCR產生的DNA指紋圖用AB1 GeneScan 672軟件在DNA測序儀373系統上分析。
電泳條件用9ml 40％丙烯酰胺N，N｀-甲叉-雙-丙烯酰胺＝19∶1貯存液(BIO-RAD)、16ml 5x TBE緩沖液(5x TBE緩沖液1升54gTris堿基，27.5g硼酸，20ml 0.5M乙二胺四乙酸pH 8.0)、55ml蒸餾水、400μl 10％過硫酸銨、45μl N，N，N｀，N｀-四-甲基-乙二胺配制4.5％的非變性聚丙烯酰胺凝膠溶液。
緩沖液為1x TBE(280ml 5x TBE緩沖液，1120ml蒸餾水)。于700v電壓下電泳18小時。RAPD PCR產物用蒸餾水稀釋為1∶10。1μ稀釋的產物與1μ內道DNA大小標準GeneScan-2500 ROX和3μl加樣液混合(AB1 GeneScan試劑盒)。混合樣品再上樣于上述凝膠。DNA指紋圖結果可由Ab1 373自動DNA測序儀用GeneScan 672軟件自動分析并報道，見圖3。
實施例6 對Rainbow 39測序用下述多形性隨機擴增的DNA聚合酶鏈式反應(RAPD PCR)從棉屬植物Gossypium hirsutum品種(Rainbow 39)中擴增得到一個227bp的基因組DNA片段。該DNA片段不是用該試驗從另一個非自動脫葉棉屬植物品種(Sicala 34)中擴增出來的。將227bp DNA片段克隆進一個質粒載體并用ABI 373自動DNA測序儀測序。測出片段的DNA序列，示于SEQ ID NO2。
實驗方案1.用隨機擴增的多形性DNA(RAPD)試驗進行PCR對棉屬植物Rainbow 39和Sicala 34品種的基因組DNA進行RAPD-PCR反應。每個擴增反應在25μl體積中進行，其中有近25ng基因組DNA，25ng單一10體引物，2.0mM MgCl2，10mM Tris-HCl，，pH8.3，16.6mM(NH4)2SO4，100μg/ml明膠，0.45％Triton-X100，100μM各種dNTP，1.0單位Taq DNA聚合酶。反應在0.5ml的覆蓋有礦物油的微管中進行。共擴增45個循環，每個循環在熱循環儀(HYBAID，OmniGene，U.K.)上分別用94℃1分鐘，36℃1分鐘和72℃2分鐘進行DNA變性、退火和引物延伸。每次進行RAPD PCR時均包括空白對照(PCR反應中未加DNA而以水代替)。PCR產物的分析是在1.4％的瓊脂糖凝膠上電泳，經溴乙錠染色顯示并照相。
2.RAPD PCR片段的純化DNA帶在1.2％的低熔點瓊脂糖凝膠上分離，用溴乙錠染色，從凝膠上切下所需片段。將這段切出的含DNA片段的凝膠放入1.5ml Eppendorf管中，以TE緩沖液覆蓋，然后在70℃加熱15分鐘熔化凝膠。熔化好的凝膠溶液用苯酚/氯仿抽提，再用氯仿抽提。加入0.1體積的3M醋酸鈉和1體積的異丙醇在-20℃放置過夜以沉淀DNA。在10,000g離心15分鐘收集DNA，重新懸浮于無菌水中。DNA濃度通過在有量化DNA分子大小標準物的凝膠上電泳測量。
3.DNA克隆(a)連接pGEM-T載體(Promega)也用于克隆PCR帶。按廠商建議將PCR產物用這些載體連接。
(b)轉化將10％的連接反應物，或5ng未切斷的對照載體，與100？感受態細胞在Eppendorf管中混合，冰浴1小時。于42℃水浴中加熱振蕩Eppendorf管2分鐘，然后冰浴20分鐘。接著加入1ml LB至管中，細胞在垂直旋轉輪上于37℃溫育30-40分鐘。用微量離心管在1,500g離心10分鐘收集細菌細胞，重新懸浮于含30mg/ml X-gal和20mg/ml IPTG的200？LB中。將細菌溶液涂布于含100？/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在37℃烘箱中干燥2小時，然后將瓊脂平板在37℃倒置培養過夜。
(c)重組克隆子的篩選含重組載體的細菌菌落為白色，不含重組載體的為藍色。選出5個白色菌落進行下述質粒制備。切下的插入子和載體隨后在1.2％的瓊脂糖凝膠上電泳分離。對照插入子和線性載體DNA也在同一凝膠上電泳。正確的重組質粒因既有插入子又有載體帶而得到鑒定。
1.制備進行DNA測序用的質粒DNA大腸桿菌菌株JM109的轉化單菌落在含10？/ml氨芐青霉素的5ml LB肉湯中于37℃振蕩培養過夜(約16小時)。三份樣品按每份1.5ml在1.5ml Eppendorf管中于1,500g微量離心10分鐘以沉淀。將大腸桿菌沉淀徹底懸浮于200？GET緩沖液(50mM葡萄糖/25Mm EDTA/20MmTris-HCl，pH8.0)，接著在1,500g離心10分鐘。將大腸桿菌沉淀懸浮于含10mg/ml溶菌酶的50？GET中。冰浴30分鐘后，加入150？0.5MNaOH/1.0％SDS裂解大腸桿菌。蛋白質和基因組DNA因加入200？3M醋酸鉀pH 5.2而沉淀。將上清轉移至新的Eppendorf管。然后質粒因加入等體積異丙醇并在10,000g離心10分鐘而沉淀。質粒沉淀經70％乙醇漂洗，風干1小時。質粒DNA溶于含10？/ml Rnase的200？TE緩沖液中，37℃溫育1小時。DNA溶液用苯酚∶氯仿(1∶1)抽提兩次。質粒DNA然后因加入0.1體積的3M醋酸鈉pH 5.2和2.5體積的無水乙醇而沉淀。冰浴30分鐘后，質粒DNA在10,000g離心10分鐘。DNA沉淀用70％乙醇漂洗并按上述風干。質粒DNA最后溶于50？水中，-20℃貯存。
2.DNA測序在ABI自動DNA測序儀(373型，UAS)上用AmpliTaq DNA聚合酶染料終止物循環測序試劑盒按Perdin Elmer建議的條件進行雙脫氧鏈終止測序。用ABI測序分析軟件得到DNA序列的數據。
本發明的優選實施方案在一個優選實施方案中，本發明的棉屬植物是名為“BD”的品種，它有雪白的棉花纖維，在生長末期表現自動脫葉。
此品種表現為合軸分枝，為錐形灌木，有0-2個高達100-110cm的單軸灌木，棉鈴重約5.5g。該灌木產量很高、抗倒伏、被絨毛且莖上的曬斑到秋季加重。葉子均為柔和的淡綠色，分3-5瓣。花為五角形、中等大小、不含花色素斑點。天然纖維為白色、色澤鮮艷或略帶淡點，均緊裹在棉鈴中不會掉出，適于用手或機器采摘。
纖維產量達34-36％，長36/38mm。
至生長期末，脫葉達100％。該植物頂部易干，變成某種“自動凸起”的植物。
白色和有色纖維均不受日光影響。
纖維對生態有利，即其表面不含毒素，而且該品種有95-100％早期天然自動脫葉。
本發明經此詳細描述已明確并得到理解。本領域技術人員可在不脫離本發明的范圍的前提下實施其它形式和實施方案。
本文引用的參考文獻列在下一頁，并借此引入本文。
參考文獻1.Kim SC等(1997)核酸研究251085-1086。
2.Brian H等(1994)植物分子生物學和生物技術中的方法第37-47頁。
3.Scott O等(1994)植物分子生物學手冊D11-8。
序列表(1)一般資料(i)申請人(A) 姓名Virgin Cotton Company Pty Ltd(B) 街名1 Percival Road(C) 城市Stanmore(D) 州名NSW(E) 國家澳大利亞(F) 郵編2048(i)發明題目自動脫葉的植物(ii)序列數2(iii)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機可兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(i)當前申請信息申請號AU P08174(1)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度10個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(i)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“PCR引物”(ii)假設有(iii)反義無(iv)片段類型N-末端(v)來源(A)生物體Gossypium hirsutum(B)植株RAINBOW 39(xi)序列描述SEQ ID NO1CTCAGTCGCA10(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度227個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設無(iv)反義無(v)片段類型內在(vi)來源(A)生物體Gossypium hirsutum(B)植株RAINBOW 39(C)組織鏈型葉(xi)序列描述SEQ ID NO2GTCTAAAATG CAGGAGGACC AGAACTAACT CAACGCCACT CAACACTATACCTCGGATCC 60CACAGGAGCC CTGGCTTGTC CCTCTGTGCT CACTCATCCT TTCCCGTGTCGTTAACTAAT 120GTCTGCCTAC AGGAGGGAGT TGTTGCAGTC AAGGGAAATG ATCCCTAAAATTCTCTACGC 180TGCACCATTC CCCGATCAAG ACCATGTGAT TCATGAAAAT TATAACA22權利要求
1.一種自動脫葉棉屬植物。
2.權利要求1的植物，其中該棉屬植物含有經激活后可影響此棉屬植物自動脫葉的核酸序列或其功能性片段。
3.權利要求2的棉屬植物，其中該核酸序列由化學處理和放射照射激活。
4.權利要求3的植物，其中該核酸序列用哌嗪處理和電離輻射激活。
5.權利要求2-4之任一項的植物，其中該核酸序列或其片段含有SEQ IDNO1所示序列。
6.權利要求5的植物，其中該序列為SEQ ID NO2所示序列的功能性片段。
7.權利要求1-6中任一項的植物，其中該棉屬植物為Gossypium hirsutum植株的。
8.權利要求1的植物，其中該植物選自Rainbow 34，Rainbow 39，Rainbow38和Rainbow 37組成的組合。
9.權利要求1-8中任一項的植物，其中該植物在棉鈴張開時自動脫葉。
10.權利要求2的植物，其中該植物的種子具有AGAL保藏號NM 98/06259的生物學特性。
11.權利要求2的棉屬植物，具有選自米色、雪白、棕色和綠色之組合的棉花纖維顏色。
12.權利要求11的棉屬植物，其中該植物可抵抗由Thielaviopsisbabicola、Fusarium vasinfectum和/或Bemisia tabaci所致的一種或多種疾病。
13.權利要求12的棉屬植物，其中該植物含有經激活后可影響此棉屬植物自動脫葉的核酸序列或其功能性片段。
14.已用賦予了自動脫葉能力的核酸序列轉化、并含有SEQ ID NO2所示核苷酸序列的棉屬植物。
15.權利要求1-14中任一項之植物的后代或其衍生的棉屬植物，可自動脫葉，附帶條件是此后代不是本文所述Rainbow 34或Rainbow 39。
16.激活棉屬植物中脫葉核酸序列的方法，步驟包括用哌嗪和電離輻射處理棉屬植物的種子。
17.權利要求16的方法，其中這些種子均為雜交種子，產自經篩選攜帶所需特征或性狀的親代棉屬植物的雜交，且這些種子均用哌嗪處理了10小時隨后以約20,000倫琴的吸收劑量進行了γ-射線照射。
18.權利要求17的方法，其中γ-射線照射的劑量為4,000倫琴，50秒。
19.權利要求18的方法，其中這些種子含有帶SEQ ID NO2之DNA片段的核酸序列或其功能性片段。
20.權利要求16-19中任一項的方法，其中這些種子具有AGAL保藏號NM98/06259的生物學特性。
21.含有與SEQ ID NO2所示序列相關的序列，并且當在棉屬植物中存在時具有自動脫葉的能力的核酸分子。
22.權利要求21的核酸分子，其中該相關序列表達在棉屬植物中。
23.含有權利要求21或22的核酸序列的載體或質粒。
24.含有權利要求21或22的核酸序列的植物細胞。
25.含有權利要求24的植物細胞的植物。
26.權利要求1-15、權利要求24或25中任一項之棉屬植物的產物，選自下組可繁殖材料、種子、插條、幼苗、原生質體、葉、莖、花、棉花纖維和織物。
全文摘要
本發明涉及自動脫葉的棉屬植物,以及其后代、可繁殖材料、種子、插條、幼苗、原生質體、葉、莖、花、和棉花。還涉及用這樣的植物的棉花生產的纖維和織物,以及含有與自動脫葉特征有關的序列的核酸分子。
文檔編號A01H1/06GK1270496SQ98809091
公開日2000年10月18日 申請日期1998年7月20日 優先權日1997年7月22日
發明者維克特·弗索夫, 卡米拉·哈爾曼 申請人:純棉有限公司