專利名稱：抗真菌植物的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有萵苣盤梗霉抗性的栽培萵苣[即Lactuca sativa(栽培萵苣)]植物。
真菌，萵苣盤梗霉是“霜霉病”病害的致病因子，這種病害每年都侵襲大批量的萵苣作物。萵苣育種者們已經嘗試了許多年，試圖繁育出對該真菌顯示有抗性的萵苣，并且僅在將對萵苣盤梗霉的全身抗性導入到農藝學上重要的萵苣植物方面取得部分成功。
萵苣盤梗霉的一個特點是它能在相對短的時間間隔內產生新的菌株。新的萵苣盤梗霉菌株正不斷地涌現。近來，至少已知有16個稱為NL種的萵苣盤梗霉(36 Beschrijvende Rassenlijst voor Groentegewassen voor de Teelt onder Glas(1992)Eds.Aalbersberg IJ and Stolk J H，Centrum voor Plantenverdelingsen Reproductieonderzoek，Wageningen)并且也鑒別了其他種類的萵苣盤梗霉(Bonnier F J M等人(1992)Euphytica 61203-211)。已知的顯示出對某些萵苣盤梗霉菌株有抗性的商品萵苣品種通常在其基因組中包含顯性的抗性(Dm)基因，據認為其中的基因按基因至基因的系統起作用，該系統中的Dm基因或幾個Dm基因與病原菌的顯性無毒基因相一致(Bonnier，上文)。Dm是霜霉病的縮寫;大寫字母D表示該基因是顯性的。只要沒有證明抗性因子是由一個單個基因產生的，就將其特征記作為R。已經測定出對應于大多數R因子的Dm基因(R18因子例外)。在本文中使用的Dm基因術語也包含這樣的R因子。
UPOV規則中描述的檢測萵苣TG/13/4(1992年的最新修訂本)和TG/13/7(1993年10月26日的最新修訂本)的特異性、均勻性和穩定性的規定是指有用的Dm基因以及是指適合于測定萵苣中Dm基因存在的試驗。UPOV中列舉的有用的Dm基因是Dm2、Dm3、Dm4、Dm5/8、Dm6、Dm7、Dm10、Dm11、Dm16并且還包括R18因子。UPOV聲明只有這些基因的測試應在常規方法基礎上進行，并且檢測Dm1、Dm4、Dm15和Dm10的存在需要特殊的試驗。
向萵苣植物基因組中導入一個以上Dm基因并不產生顯示出對萵苣盤梗霉有全身的和持續的抗性的萵苣類型。含有一個或多個能提供對特定萵苣盤梗霉菌株抗性的Dm基因的萵苣植株可顯示出對其他萵苣盤梗霉菌株有很小的或沒有抗性。
迄今在農藝學上重要的萵苣類型中的萵苣盤梗霉抗性(盤梗霉抗性)已在規定時間以外缺乏持久性。
為了所有這些原因，育種者們已經找到了另一種來源的盤梗霉抗性。這種抗性所基于的遺傳機理并不依賴于Dm基因介導的抗性的遺傳機理(在下文中將這種類型的抗性稱為“非-Dm基因介導的抗性”)。
在一個野生萵苣品種Lactuca saligna(似柳樹萵苣)中識別出非-Dm基因介導的抗性來源已有許多年了(Gustafsson I.(1989)Euphytica 40∶227-232;Netzer D.等人(1976)Hortscience 11(6)612-613)。已知非-Dm基因抗性至少在某些似柳樹萵苣植株類型中能有效地抗所有已知萵苣盤梗霉菌株，尤其是抗所有可由有用的Dm基因和R18因子控制的菌株(參見UPOV，上文)。
在本領域內也將非-Dm基因介導的盤梗霉抗性稱作為“水平抗性”和“免疫性”，即指它獨立于Dm基因介導的抗性機理而起作用。從上面描述可得出，將非-Dm基團介導的抗性轉移到商業上可接受的即栽培萵苣植株中是非常理想的。先前從未報道過這種形式的盤梗霉抗性被成功地轉移到栽培萵苣中。將栽培萵苣和似柳樹萵苣雜交的嘗試導致產生了有不好的植物習性和繁殖力的表現型植株(de Vries I.M.(1990)Pl.Syst.Evol.171233-248)。
育種者所遇到的困難是由各種因素引起的，包括抗性基因的特性以及將來源于具盤梗霉抗性的不同類型的栽培萵苣(如野生型萵苣例如似柳樹萵苣)的非-Dm基因介導的盤梗霉抗性成功地轉移到可栽培的并由此而是農藝學上(和商業上)可接受的萵苣中的困難。的確非-Dm基因介導的盤梗毒抗性(如由似柳樹萵苣中存在的非-Dm基因介導的盤梗霉抗性)被認為有隱性特性。再者，為了將非-Dm基因介導的盤梗霉抗性繁育到L.cativa中，首先必須使適用于育種程序的植株完全與栽培萵苣即農藝學上和商業上可接受的重要萵苣植株相一致。
現在已發現通過在F2水平上選擇適合的萵苣盤梗霉抗性植株可以將與栽培萵苣不同源的非-Dm基因介導的盤梗霉抗性成功地轉移到栽培萵苣植株中。再者，這些現象似乎表明在F2代具有非-Dm基因介導的抗性的植株和植株缺乏生長活力(這種活力是使用篩選出的F2植株與商品品種之間回交以恢復植株活力所必需的)之間有聯系。F2群體至少在對萵苣盤梗霉抗性的特性方面有分離。可將從包含非-Dm基因介導的抗性的F2中選出的萵苣植株與農藝學上重要的萵苣品系進行雜交，然后雜交產物可用于進一步育種。
本發明涉及栽培萵苣植物，該植物與具有僅基于Dm基因介導的抗性的抗萵苣盤梗霉抗性的栽培萵苣植株相比，能提供具有更寬響應性及更穩定的對萵苣盤梗霉的抗性。
本發明提供了具有抗萵苣盤梗霉抗性能力的栽培萵苣植株(本發明的栽培萵苣植株)，該植株的抗萵苣盤梗霉的抗性包含非-Dm基因介導的抗性。
非-Dm基因介導的抗性優選來源于似柳樹萵苣。合適的是，本發明的栽培萵苣植株是完全可育的。
本發明的栽培萵苣植株在其基因組中可包括一種或多種Dm基因或者不包括之。
本發明的栽培萵苣植株即L.sativa植株是適合于食用的萵苣植株。本發明的栽培萵苣植株的所有種子本質上都能產生顯示有對萵苣盤梗霉的非-Dm基因介導的抗性的栽培萵苣植株。所述植株的表現型特征是足夠均勻的以致于為商業所接受并且符合商業主管當局所提出的標準。
本發明的栽培萵苣植株本質上可以是四倍體(2n＝2x＝36)或二倍體(即2n＝2x＝18)，但優選的是二倍體。本文中所述的術語“植物”包含植株部分、細胞和種子。
植株部分的例子包括適用于消費的部分(萵苣頭和其葉)以及適合于植物產生的部分，例如器管組織(例如葉、莖、根、芽等)、原生質體、體細胞胚胎、花藥、雄蕊、葉柄和培養細胞等。利用植物組織培養技術也可以從植株部分栽培或繁殖本發明的栽培萵苣植株。這些技術是本領域內已知的。
在受到萵苣盤梗霉菌株侵襲和/或感染時，本發明的栽培萵苣植物與本身具有一個Dm基因或幾個Dm基因介導的抗性的萵苣植株相比，能夠表現出抗更寬范圍的萵苣盤梗霉菌株的抗性。因此，在試驗條件下能夠觀察到非-Dm基因介導的抗性，并且在正常的田間或溫室條件下也能觀察到這種抗性。
本發明的栽培萵苣植株可由下列方法獲得ⅰ)進行初始的雜交，其中一個親本的遺傳物質是由在子葉和真葉中顯示有非-Dm基因介導的萵苣盤梗霉抗性的野生型萵苣植株提供的，另一親本的遺傳物質是由對萵苣盤梗霉無抗性的栽培萵苣植株提供的，接下來進行自花授粉產生F2代，選擇在子葉期和真葉期具有抗萵苣盤梗霉菌株抗性的植株(R退化植株);然后ⅱ)a)將R退化植株與具有所需表現型的栽培萵苣植株進行雜交;
b)自花授粉以至少產生F2代;
c)選擇產生的R退化植株以及d)如果需要，重復步驟a)至c)，直到獲得與栽培萵苣植株相適應的萵苣植株;以及ⅲ)e)將從相適應的萵苣植株中選擇出的R退化植株與顯示有所需表現型的不同栽培萵苣植株進行雜交;
f)自花授粉以至少產生F2代;
g)選擇產生的R退化植株，并且h)如果需要，重復步驟e)至g)以便獲得栽培萵苣植株，以及
ⅳ)將ⅲ)中獲得的植株自花授粉以至少獲得F4代。
其中在進行雜交的所述方法中的任何階段，阻止欲雜交的雌性親本自花授粉。
通常，獲得本發明植株的育種方法包括鑒別一種在子葉期和真葉期顯示有抗萵苣盤梗霉抗性的合適的野生型萵苣植株。優選的是，野生型萵苣植株是一種攜帶非-Dm基因介導的抗萵苣盤梗霉抗性的似柳樹萵苣植株。這一結論通過例如，栽培野生型植株群體并且用萵苣盤梗霉菌株的混合物感染這些植株，或者將這些植株在子葉發育階段與各個萵苣盤梗霉菌株接觸一段時間，然后在真葉期用萵苣盤梗霉再感染，并且選擇出在兩個階段都顯示有抗性的那些植株。如果葉子上沒有顯示可見的孢子形成則證明有抗性。如果在育種程序中使用這樣一個步驟稱為R退化試驗，即顯示有抗萵苣盤梗霉抗性的植株是R退化的。然后將選擇出的在兩個葉發育階段都顯示有抗性的野生型萵苣植株生長為成熟植株并且與對萵苣盤梗霉無抗性的栽培萵苣植株進行雜交。適用于初始雜交的栽培萵苣植株類型適合選自于顯示有所需的農藝學特征的栽培萵苣植株。選擇所有植株類型都可基于其表現型。通過簡單地將雜交植株產生種子，收集F1種子并且播種以產生隨后自花授粉的植株，制造F2代可以獲得初始雜交的子代。
在另一種可選方法中，可使用胚狀體挽救技術，其中可從胚狀體階段的雜交植株中收獲初始雜交產物并且在合適培養基中將其培養直到已經形成根和芽。一旦已經形成了足夠的根和芽，然后可將得到的小植株轉移到土壤中并且在合適的溫室條件下生長，直到已經建立起一個植株群，然后從中可以選出合適的植株進一步用于育種程序。適用于胚狀體挽救方法的方案是本領域內已知的，例如Maisonneuve B.，Agronomie(1987)，7(5)313-319。然后如前所述使F1代自花授粉產生F2代，并且根據表現型從中選擇合適的植株。然后按本文概述的方案將合適的F2植株進行R退化試驗，并且將R退化植株與攜帶了農藝學上所需特征的合適的栽培萵苣植株進行雜交以特別用于恢復生長活力，自花受粉產生F2代，從中再次選出合適的植株進行R退化試驗。重復該步驟，直到獲得與栽培萵苣相適應的萵苣植株。然后可將由此獲得的含有非-Dm基因介導的盤梗霉抗性的相適應的植株作為原始品系用于任何進一步的可栽培萵苣育種程序中。一種相適應性的萵苣植株是一種容易與栽培萵苣類型進行雜交并且是自我可育的。由于萵苣是自花授粉植株，因此建立含有非-Dm基因介導的萵苣盤梗霉抗性的合適的原始品系是重要的。為了確立一個相適應的品系是否顯示有非-Dm基因介導的抗性，按本文對于野生型萵苣植株所作描述在子葉期和第一個真葉期時將其用萵苣盤梗霉菌株進行感染。因此，優選的是，提供一種與在基因組中包含非-Dm基因介導的萵苣盤梗霉抗性的栽培萵苣相適應的萵苣植株。一旦獲得與栽培萵苣相適應的植株，重復R退化試驗步驟，以及選擇用于與栽培萵苣植株進行雜交的R退化植株，并且自花授粉以至少產生F2代，直到獲得一個在其基因組中摻入了非-Dm介導的基因抗性的農藝學上吸引人的栽培萵苣類型。將篩選出的含有非-Dm基因介導的抗性的植株品系重復地進行自花授粉直到獲得栽培萵苣植株。進行自花授粉是為了至少獲得F4代，優選地是獲得F5代，更優選的是獲得F6代，據認為其中一代或多代中，非-Dm基因介導的抗性是穩定地摻入到基因組中。據認為這樣的植株適合于生產可銷售量的能產生在其基因組中包含非-Dm基因介導的萵苣盤梗霉抗性的栽培萵苣植株的種子。
自花授粉植株的雜交要求阻止用作為雌性親本的植株進行自我繁殖。通過用手摘除能承受用手工摘除的再生器官的雄性部分或者通過化學方法和/或使用花中的水完成去除雄性部分而完成上述工作。所述上述去雄方法是本領域內公知的。
本領域內熟練的技術人員將會認識到上面概述的育種程序將占用許多年并且上面概述的育種程序適合于各種類型的可栽培萵苣(包括室內、溫室、室外田間萵苣等等)的育種。
下面給出了進一步闡明本發明的實施例。同時也要理解到所述實施例不應看作是要以任何方式限制本發明。
實施例1通過將包含萵苣盤梗霉菌株的混合物的接種物應用到播種后第六天的葉上，并且分別在播種后13天和18天時觀察子葉以及植株成年期的第一批葉的方法，從而檢測S3113和S3114抗萵苣盤梗霉菌株N11到N116，以及其他分離到的內部命名為TV、ITA1和GER的盤梗霉真菌菌株的萵苣盤梗霉抗性。證明S3113和S3114對所檢測的所有萵苣盤梗霉菌株都有抗性，如表1所示，其中通過Dm基因本身產生的抗性對至少一個萵苣盤梗霉菌株敏感。
在表1中，-和(-)分別表示對萵苣盤梗霉有抗性或部分抗性，以及(+)表示對萵苣盤梗霉敏感。
表1重要的Dm基因 盤梗梅NL種 S&G分離物 2 - - - - - - - + + - + - + + - + - - - + + + + + +- 3 - - - - - - - + - - + - + + + - - + + + + + + +- - 5/8 - - - - - - + + + - + - + + + + + + + + + + +- - - 6 - - - - - + + - - - + + + + + - + (-) + + - +- - - - 7 - - - - - + + + - + + + + + + - + + + + +- - - - - 11 - - - - - - - + - - - (-) + + + + + - + +- - - - - - 16 - - - - - - - - - - + + - - - + + - +- - - - - - - 18 - - - - - - - - - - - - - - - - + +S 3113 - - - - - - - - - - - - - - - - - -S 3114 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 2 - - - 7 - - - - - - + - - + - + - - - - + + + + +2 - - - - 11 - - - - - - - + - - - - - - + + + - + +- 3 - - 7 - - - - - - - + - + + + - - + + + + + + +- 3 - - - 11 - - - - - - - - - - - - - + + + + - + +- - 5/8 - 7 - - - - - + + - - - + + + + + - + + + + +- - 5/8 - - 11 - - - - - - - + - - - - (-) + + + + + + +- - - 6 - 11 - - - - - - - - - - - (-) + - + (-) + - - +2 3 - - 7 - - - - - - - - - + - + - - - - + + + + +2 3 - - - 11 - - - - - - - - - - - - - - + + + - + +- 3 5/8 - 7 - - - - - - - - - - + + - - + + + + + + +- 3 - 6 - 11 - - - - - - - - - - - - - - + (-) + - + +- - 5/8 6 - 11 - - - - - - - - - - - - + - + (-) + - - +2 - - - - - 16 - - - - - - - - - - - - - - - + + - +- 3 - - - - 16 - - - - - - - - - - - - - - - + + - +- - - - - 11 16 - - - - - - - - - - (-) + - - - + - - +- 3 - - - 11 16 - - - - - - - - - - (-) - - - - + - - +- - - - - - - 18 - - - - - - - - - - - - - - - - + +- - - 6 - - - 18 - - - - - - - - - - - - - - - - - +S 3113 - - - - - - - - - - - - - - - - - -S 3114 - - - - - - - - - - - - - - - - - -
實施例2用單個的萵苣盤梗霉菌株，以及NL16、GER和TV萵苣盤梗霉菌株的混合物分別檢測S3113和S3114的抗萵苣盤梗霉抗性，并且與僅含有一個Dm基因介導的抗萵苣盤梗霉抗性的不同的商品萵苣品種的抗性進行比較。如從表2中所看到的，S3113和S3114對檢測的所有萵苣盤梗霉菌株都有抗性，而僅含有Dm基因介導的抗性的萵苣類型對某些萵苣盤梗霉菌株敏感。
表2品種 Dm基因 NL16 Ita 1 TV、NL16和GER的混合物Dandie Dm 3 + + +UCDm 2 Dm 2 + + +Judy Dm 3,Dm 11 + + +Ramona Dm 3,Dm 11 + + +Safier Dm 3+Dm 7+Dm 16 + - +Capitan Dm 11 + + +Mariska R 因子 18 - + +S3113 - - -S3114 - - -接種物NL 16，Ita 1，NL 16+GER+TV的混合物在子葉期感染播種后0+6天觀察子葉播種后0+13天觀察葉播種后0+18天-抗性+敏感已于1993年5月19日將S3113和S3114保存于蘇格蘭的國際保藏機構，工業和海洋細菌有限公司的國家收集處(National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd，International Depository Authority，Scotland)，并且分別給予保藏號為NCIMB40556和NCIMB40557。
育種計劃育種計劃1該計劃描述了一個最初將非-Dm基因介導的萵苣盤梗霉抗性導入到栽培萵苣中的育種程序的實施例。可將得到的植株S3113用于進一步的自花授粉。S3113在基因組中既含有非-Dm基因介導的盤梗霉抗性基因也含有Dm基因、Dm3和Dm11。
在這個育種程序中產生的雌性植株在圖的左邊，雄性植株在圖的右側。已將似柳樹萵苣標記為“B28”，一種機構內部的命名，結果表明該植株含有一種經鑒定的對萵苣盤梗霉的非-Dm基因介導的全身抗性，B28-60是命名第一個農藝學上重要的萵苣品系的機構內部命名，在該品系中，導入了非-Dm基因介導的萵苣盤梗霉抗性，并且該品系與栽培萵苣相適應(即自我適應、完全可育、容易與栽培萵苣雜交)，并且可以在隨后的所有育種程序中用作為原始品系。B28-60是由F2×Palmyran雜交后自交得到的F3。命名“Novir”是指第一個從INRA得到的對任何萵苣盤梗霉菌株沒有抗性的萵苣。其它命名“Palmyran”、“Jessy”、“Ramona”、“Judy”、“Thirana”和“Penny”是指在其基因組中含有Dm基因、Dm3和Dm11的S&G Seeds BV商品品種。“E-207”、“E-99”是指機構內部制備的S&G種子試驗品系。Ramsal-19是另一個可以在短時間的條件下生長，并且含有B28抗性的農藝學上重要的萵苣品系的機構內部命名。Ramsal-19用作為所有溫室萵苣類型的原始系，并且是由F2×Ramona雜交后自交得到的F3。上述列出的所有品種與從至少是含有抗萵苣盤梗霉的非-Dm基因介導的抗性的F2選出的植株雜交。在整個育種計劃的雜交和/或自交中使用的所有F2植株都是篩選出的R退化植株。將F2×Thirana，和F4×Judy雜交以便導入在商業上有吸引力的、經改善的商品表現型，借助于早期導入的B28抗性，該商品表現型還含有一個穩定導入的B28抗性。自交產生的F6即S3113被認為是作為在其基因組中穩定地導入B28抗性的品種。
育種計劃2基本上按照育種計劃1中選擇的育種方式，所不同的是F2×E-207，即從雜交篩選得到的(自交得到的)F2植株與不同類型“E-99”、F2R(也是一種S&G Seeds B.V.試驗品種)雜交，從F2R退化自交得到的F4與其它的商品類型“Penny”(一種S&G Seeds B.V.商品類型)雜交，并且自交得到來自于選定的的F2R退化植株的F6，即S3114。
育種計劃1植株品系材料似柳樹萵苣×栽培萵苣
育種計劃2植株品系材料似柳樹萵苣×栽培萵苣
權利要求
1.對萵苣盤梗霉有抗性的栽培萵苣植株，其特征在于它們在其基因組中包含非-Dm基因介導的萵苣盤梗霉抗性。
2.根據權利要求1所述的栽培萵苣植株，其特征在于非-Dm基因提供了抗荷蘭盤梗霉種NL1-7、NL9-16、TV和ITA1的抗性。
3.根據權利要求1或2所述的栽培萵苣植株，其中非-Dm基因是從似柳樹萵苣中獲得的。
4.根據權利要求1-3中任何一項所述的栽培萵苣植株，其中可栽培的萵苣植株是完全可育的。
5.根據權利要求1-4中任何一項所述的栽培萵苣植株，該植株在其基因組中包含一個非-Dm基因和一個或多個Dm基因。
6.獲得權利要求1-5所述的栽培萵苣植株的方法，該方法包含ⅰ)進行初始的雜交，其中一個親本的遺傳物質是由在子葉和真葉中顯示有非-Dm基因介導的萵苣盤梗霉抗性的野生型萵苣植株提供的，另一親本的遺傳物質是由對萵苣盤梗霉抗性的栽培萵苣植株提供的，接下來進行自花授粉產生F2代，選擇在子葉期和真葉期具有抗萵苣盤梗霉菌株抗性的植株(R退化植株);然后ⅱ)a)將R退化植株與具有所需表現型的栽培萵苣植株進行雜交;b)自花授粉以至少產生F2代;c)選擇產生的R退化植株以及d)如果需要，重復步驟a)至c)，直到獲得與栽培萵苣植株相適應的萵苣植株;以及ⅲ)e)將從相適應的萵苣植株中選擇出的R退化植株與顯示有所需表現型的不同栽培萵苣植株進行雜交;f)自花授粉以至少產生F2代;g)選擇產生的R退化植株，并且h)如果需要，重復步驟e)至g)以便獲得栽培萵苣植株，以及ⅳ)將ⅲ)中獲得的植株自花授粉以至少獲得F4代。其中在進行雜交的所述方法中的任何階段，阻止欲雜交的雌性親本自花授粉。
7.根據權利要求6所述的方法，其中起始雜交的雄性親本是一種栽培萵苣植株，并且雌性親本是一種似柳樹萵苣植株。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其中雜交中所用的雄性親本是栽培萵苣植株，并且雌性親本攜帶來自于似柳樹萵苣的非-Dm基因介導的抗萵苣盤梗霉抗性。
9.根據權利要求6-8中任何一項所述方法獲得的栽培萵苣植株。
10.根據權利要求1-5和9中任何一項所述的栽培萵苣植株的頭或葉。
11.根據權利要求1-5和9中任何一項所述的栽培萵苣植株的種子或其它繁殖物質。
全文摘要
本發明公開了抗萵苣盤梗霉的、并且在其基因組中包含非-Dm基因介導的萵苣盤梗霉抗性的栽培萵苣植株，以及生產所述的抗萵苣盤梗霉抗性的萵苣的方法。
文檔編號A01H5/10GK1099800SQ9410593
公開日1995年3月8日 申請日期1994年5月26日 優先權日1993年5月27日
發明者B·M·D·莫羅 申請人:山道士有限公司