本發明(ming)屬于玉(yu)米育種，具(ju)體(ti)涉及一種提高玉(yu)米單倍體(ti)誘(you)導(dao)系誘(you)導(dao)率的方法(fa)。

背景技術：

1、玉(yu)米雜交育(yu)種(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)關鍵在(zai)于快速(su)獲得性(xing)狀(zhuang)優良且(qie)穩定的(de)(de)(de)純(chun)系親本(ben)。傳統育(yu)種(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)過程中(zhong)，自交系的(de)(de)(de)選(xuan)育(yu)周期長、效(xiao)率低(di)，難(nan)以(yi)適應當今育(yu)種(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)產業化的(de)(de)(de)激烈(lie)競(jing)爭(zheng)要求。而基(ji)于單倍(bei)(bei)體誘導(dao)系的(de)(de)(de)單倍(bei)(bei)體育(yu)種(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)技(ji)(ji)術(shu)具有(you)成本(ben)低(di)、效(xiao)率高(gao)、純(chun)合快等優勢，可以(yi)快速(su)獲得雙(shuang)單倍(bei)(bei)體(double?haploid，dh)系，大(da)大(da)縮短(duan)了育(yu)種(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)年限。由于單倍(bei)(bei)體只有(you)一套染(ran)色體，隱性(xing)基(ji)因跟(gen)顯性(xing)基(ji)因都能在(zai)當代(dai)顯現(xian)出來(lai)，所以(yi)在(zai)早代(dai)可以(yi)進行優良性(xing)狀(zhuang)的(de)(de)(de)篩選(xuan)，及時淘汰不(bu)良性(xing)狀(zhuang)，有(you)利于產量、抗性(xing)等有(you)利基(ji)因的(de)(de)(de)快速(su)聚合，提高(gao)選(xuan)育(yu)的(de)(de)(de)效(xiao)率及準確(que)性(xing)。玉(yu)米單倍(bei)(bei)體育(yu)種(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)技(ji)(ji)術(shu)在(zai)商業化育(yu)種(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)中(zhong)扮演著越來(lai)越重要的(de)(de)(de)角(jiao)色，與(yu)分子育(yu)種(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)技(ji)(ji)術(shu)、轉(zhuan)基(ji)因技(ji)(ji)術(shu)等已成為現(xian)代(dai)玉(yu)米育(yu)種(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)核心技(ji)(ji)術(shu)。

2、目前，利用玉(yu)米(mi)(mi)(mi)stock6種(zhong)(zhong)質(zhi)衍(yan)生(sheng)的(de)單倍(bei)(bei)(bei)體誘(you)(you)導(dao)(dao)系(xi)在體內進(jin)行(xing)玉(yu)米(mi)(mi)(mi)母(mu)(mu)(mu)本(ben)單倍(bei)(bei)(bei)體的(de)誘(you)(you)導(dao)(dao)，是生(sheng)產實(shi)踐(jian)中運用最廣(guang)泛(fan)的(de)一種(zhong)(zhong)玉(yu)米(mi)(mi)(mi)單倍(bei)(bei)(bei)體獲取途徑。1959年(nian)，玉(yu)米(mi)(mi)(mi)stock6單倍(bei)(bei)(bei)體誘(you)(you)導(dao)(dao)系(xi)首次被報(bao)道，當(dang)時該(gai)株(zhu)系(xi)僅(jin)有2.3％-3.2％的(de)母(mu)(mu)(mu)本(ben)單倍(bei)(bei)(bei)體誘(you)(you)導(dao)(dao)率，但stock6的(de)花粉能夠誘(you)(you)導(dao)(dao)母(mu)(mu)(mu)本(ben)材(cai)料產生(sheng)3％左右的(de)單倍(bei)(bei)(bei)體植株(zhu)，這個重要發現為雜(za)交誘(you)(you)導(dao)(dao)單倍(bei)(bei)(bei)體生(sheng)殖育(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)種(zhong)(zhong)方法(fa)奠定了理論基礎(chu)。隨后在數十(shi)年(nian)間，世界各地育(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)種(zhong)(zhong)家通過雜(za)交和回交手段對stock6誘(you)(you)導(dao)(dao)系(xi)進(jin)行(xing)改良，選(xuan)育(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)出(chu)了多個具有優(you)良農藝性狀且誘(you)(you)導(dao)(dao)率得到顯(xian)著提升(7.0％-16.0％)的(de)玉(yu)米(mi)(mi)(mi)母(mu)(mu)(mu)本(ben)單倍(bei)(bei)(bei)體誘(you)(you)導(dao)(dao)系(xi)，使基于stock6種(zhong)(zhong)質(zhi)的(de)玉(yu)米(mi)(mi)(mi)單倍(bei)(bei)(bei)體育(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)種(zhong)(zhong)技術在玉(yu)米(mi)(mi)(mi)商業化育(yu)(yu)(yu)(yu)(yu)種(zhong)(zhong)中得到成功的(de)推廣(guang)應用。

3、截至2016年(nian)，全球已(yi)開發出50多種(zhong)(zhong)(zhong)單(dan)(dan)倍(bei)(bei)體(ti)誘(you)(you)導系(xi)(xi)品(pin)系(xi)(xi)，所(suo)有(you)這(zhe)些(xie)(xie)品(pin)系(xi)(xi)都(dou)直(zhi)接或間接來源于stock6。較(jiao)多被(bei)報道應(ying)用(yong)的(de)(de)(de)(de)誘(you)(you)導系(xi)(xi)為(wei)德國的(de)(de)(de)(de)rws、uh400、pk6、hzi1；蘇聯的(de)(de)(de)(de)kms、zms、kems；法(fa)國的(de)(de)(de)(de)ws14；摩爾多瓦的(de)(de)(de)(de)zms、mhi；羅馬尼亞的(de)(de)(de)(de)phi；印(yin)度的(de)(de)(de)(de)5329c；cimmyt的(de)(de)(de)(de)tails；中國農業大(da)(da)(da)學的(de)(de)(de)(de)農大(da)(da)(da)高誘(you)(you)1號、農大(da)(da)(da)高誘(you)(you)5號，但這(zhe)些(xie)(xie)高誘(you)(you)導系(xi)(xi)的(de)(de)(de)(de)材料多伴有(you)結實率(lv)低、標記性狀模糊等缺(que)陷。2013年(nian)，中國農業大(da)(da)(da)學陳(chen)紹(shao)江課題組利(li)用(yong)stock6種(zhong)(zhong)(zhong)質改良選育(yu)出了一(yi)個(ge)優(you)良玉(yu)米單(dan)(dan)倍(bei)(bei)體(ti)誘(you)(you)導系(xi)(xi)cau5，近(jin)年(nian)來在(zai)玉(yu)米商業化(hua)單(dan)(dan)倍(bei)(bei)體(ti)育(yu)種(zhong)(zhong)(zhong)流程中被(bei)廣(guang)泛適用(yong)，其單(dan)(dan)倍(bei)(bei)體(ti)誘(you)(you)導率(lv)大(da)(da)(da)約在(zai)8％-10％，并且含有(you)r1-nj顏色基因，便(bian)于在(zai)誘(you)(you)導產(chan)生(sheng)的(de)(de)(de)(de)后(hou)代籽粒中進行(xing)單(dan)(dan)倍(bei)(bei)體(ti)的(de)(de)(de)(de)鑒定。2021年(nian)，中國農大(da)(da)(da)開發了一(yi)種(zhong)(zhong)(zhong)新(xin)(xin)的(de)(de)(de)(de)高油單(dan)(dan)倍(bei)(bei)體(ti)誘(you)(you)導品(pin)系(xi)(xi)choi4，平均hir高達15.8％。基于stock6的(de)(de)(de)(de)新(xin)(xin)品(pin)種(zhong)(zhong)(zhong)單(dan)(dan)倍(bei)(bei)體(ti)誘(you)(you)導系(xi)(xi)的(de)(de)(de)(de)不斷問世，玉(yu)米單(dan)(dan)倍(bei)(bei)體(ti)誘(you)(you)導系(xi)(xi)誘(you)(you)導產(chan)生(sheng)單(dan)(dan)倍(bei)(bei)體(ti)的(de)(de)(de)(de)生(sheng)殖育(yu)種(zhong)(zhong)(zhong)方(fang)(fang)法(fa)取得(de)跨越式(shi)發展，沿用(yong)了長(chang)達百年(nian)的(de)(de)(de)(de)傳(chuan)統系(xi)(xi)譜育(yu)種(zhong)(zhong)(zhong)法(fa)正在(zai)逐(zhu)步被(bei)單(dan)(dan)倍(bei)(bei)體(ti)誘(you)(you)導系(xi)(xi)的(de)(de)(de)(de)方(fang)(fang)法(fa)所(suo)替換。

4、近(jin)(jin)些年(nian)，研(yan)究(jiu)人員進(jin)一(yi)步對誘(you)(you)導(dao)機理進(jin)行(xing)(xing)深入(ru)(ru)研(yan)究(jiu)，成功地(di)鎖(suo)(suo)定(ding)(ding)(ding)(ding)了誘(you)(you)導(dao)基(ji)(ji)因(yin)，并進(jin)一(yi)步研(yan)究(jiu)其功能作用。2017年(nian)，陳紹江研(yan)究(jiu)團(tuan)隊發(fa)現，誘(you)(you)導(dao)過(guo)程中(zhong)(zhong)染色體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)排除是單(dan)(dan)(dan)倍(bei)(bei)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)形成的(de)(de)(de)(de)(de)重要機理，并鎖(suo)(suo)定(ding)(ding)(ding)(ding)了磷脂(zhi)酶(mei)基(ji)(ji)因(yin)zmpla1，該(gai)基(ji)(ji)因(yin)第4外顯子(zi)4個堿基(ji)(ji)cgag的(de)(de)(de)(de)(de)插入(ru)(ru)導(dao)致原有功能缺失，突(tu)變(bian)基(ji)(ji)因(yin)功能異常作用于細胞膜，花(hua)粉管萌發(fa)過(guo)程中(zhong)(zhong)，由于細胞膜異常而導(dao)致配子(zi)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)異常，從而產生一(yi)定(ding)(ding)(ding)(ding)比(bi)例的(de)(de)(de)(de)(de)母本單(dan)(dan)(dan)倍(bei)(bei)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)胚(pei)。2019年(nian)，該(gai)團(tuan)隊又鎖(suo)(suo)定(ding)(ding)(ding)(ding)編碼duf679結構域膜蛋白(bai)(duf679?domain?membrane?protein)基(ji)(ji)因(yin)zmdmp及其功能位點(dian)，zmdmp與(yu)(yu)(yu)zmpla1具(ju)有一(yi)定(ding)(ding)(ding)(ding)的(de)(de)(de)(de)(de)相似性(xing)，均在成熟的(de)(de)(de)(de)(de)花(hua)粉中(zhong)(zhong)表(biao)達和(he)定(ding)(ding)(ding)(ding)位在細胞膜上，在單(dan)(dan)(dan)倍(bei)(bei)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)誘(you)(you)導(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)過(guo)程中(zhong)(zhong)參與(yu)(yu)(yu)相同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)通路。在zmpla1突(tu)變(bian)的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)礎(chu)上，zmdmp起始(shi)密碼子(zi)下游(you)單(dan)(dan)(dan)堿基(ji)(ji)替(ti)換會導(dao)致氨基(ji)(ji)酸的(de)(de)(de)(de)(de)錯譯，從而提(ti)升2～3倍(bei)(bei)的(de)(de)(de)(de)(de)單(dan)(dan)(dan)倍(bei)(bei)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)誘(you)(you)導(dao)率；將其完全敲除，并且通過(guo)同(tong)時突(tu)變(bian)mtl/zmpla1/nld基(ji)(ji)因(yin)能夠(gou)將單(dan)(dan)(dan)倍(bei)(bei)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)誘(you)(you)導(dao)率增加5～6倍(bei)(bei)。近(jin)(jin)兩年(nian)，li等(deng)人在對花(hua)粉高(gao)表(biao)達的(de)(de)(de)(de)(de)磷脂(zhi)酶(mei)家族(zu)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)進(jin)行(xing)(xing)研(yan)究(jiu)再次發(fa)現新的(de)(de)(de)(de)(de)單(dan)(dan)(dan)倍(bei)(bei)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)誘(you)(you)導(dao)基(ji)(ji)因(yin)，玉米zmpld3單(dan)(dan)(dan)倍(bei)(bei)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)誘(you)(you)導(dao)基(ji)(ji)因(yin)，該(gai)基(ji)(ji)因(yin)功能缺失突(tu)變(bian)可以(yi)誘(you)(you)導(dao)產生母本單(dan)(dan)(dan)倍(bei)(bei)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti),其誘(you)(you)導(dao)率與(yu)(yu)(yu)zmpla1基(ji)(ji)本一(yi)致。與(yu)(yu)(yu)zmpld3單(dan)(dan)(dan)突(tu)變(bian)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)相比(bi),zmpld3與(yu)(yu)(yu)zmpla1基(ji)(ji)因(yin)雙突(tu)變(bian)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)zmpld3/mtl的(de)(de)(de)(de)(de)單(dan)(dan)(dan)倍(bei)(bei)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)誘(you)(you)導(dao)率能夠(gou)提(ti)高(gao)3倍(bei)(bei)，而zmpld3/mtl/zmdmp三突(tu)變(bian)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)與(yu)(yu)(yu)單(dan)(dan)(dan)突(tu)變(bian)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)單(dan)(dan)(dan)倍(bei)(bei)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)誘(you)(you)導(dao)率相比(bi)能夠(gou)提(ti)高(gao)5～6倍(bei)(bei)。

5、目前，最普遍地提(ti)高hir的手(shou)段(duan)仍是通過基因編(bian)輯等技術，所需時間較長，成本較高，較為浪費(fei)，且編(bian)輯產物的誘導率提(ti)升效率未(wei)知，也不一(yi)定適應于所有誘導系(xi)。

技術實現思路

1、技術問題：

2、單(dan)倍(bei)體誘(you)(you)導(dao)(dao)(dao)系(xi)誘(you)(you)導(dao)(dao)(dao)率(lv)(lv)的(de)(de)提(ti)升(sheng)過程較(jiao)為(wei)繁瑣(suo)，提(ti)升(sheng)效率(lv)(lv)也(ye)較(jiao)低(di)，且(qie)目(mu)前已經(jing)達到瓶頸期。即使誘(you)(you)導(dao)(dao)(dao)基(ji)因相繼被克隆，但(dan)是單(dan)純的(de)(de)將(jiang)誘(you)(you)導(dao)(dao)(dao)基(ji)因進行組(zu)合也(ye)并(bing)沒有收獲高(gao)誘(you)(you)導(dao)(dao)(dao)率(lv)(lv)的(de)(de)誘(you)(you)導(dao)(dao)(dao)系(xi)材(cai)料。傳(chuan)統授粉方式產生單(dan)倍(bei)體的(de)(de)比(bi)例完全依(yi)賴于(yu)誘(you)(you)導(dao)(dao)(dao)系(xi)的(de)(de)誘(you)(you)導(dao)(dao)(dao)率(lv)(lv)，但(dan)我們(men)可以通(tong)過改變授粉方式來(lai)進一步地提(ti)升(sheng)誘(you)(you)導(dao)(dao)(dao)率(lv)(lv)，且(qie)提(ti)升(sheng)效率(lv)(lv)顯(xian)著；

3、開發新的誘(you)(you)導(dao)系(xi)不僅(jin)需(xu)結(jie)合技術(shu)手段(duan)加以改良還浪費人力物力，周(zhou)期較長且效果甚微，通(tong)過直接優(you)化(hua)授粉方式能間接快速地顯著提高單倍體誘(you)(you)導(dao)率，最大地發揮高誘(you)(you)導(dao)率誘(you)(you)導(dao)系(xi)的誘(you)(you)導(dao)性能。

4、常(chang)見的玉米單倍體誘(you)(you)導(dao)系(xi)，如cau5誘(you)(you)導(dao)系(xi)為(wei)熱帶種(zhong)質(zhi)資源，其(qi)發芽(ya)率(lv)低(di)，且自交果穗敗育率(lv)高(gao)，繁種(zhong)較(jiao)困難。充分利用其(qi)花粉特性最大限度發揮其(qi)誘(you)(you)導(dao)性能(neng)，有助于(yu)進一步保護、節約(yue)種(zhong)質(zhi)資源。

5、因此，本(ben)發明(ming)的(de)(de)目的(de)(de)在于提(ti)供一種提(ti)高(gao)玉(yu)米單倍體(ti)誘(you)導系(xi)(xi)誘(you)導率的(de)(de)方(fang)法，所(suo)述方(fang)法包括提(ti)高(gao)玉(yu)米單倍體(ti)誘(you)導系(xi)(xi)花粉(fen)中(zhong)中(zhong)、低(di)活(huo)力花粉(fen)占比的(de)(de)步驟，然后以玉(yu)米單倍體(ti)誘(you)導系(xi)(xi)花粉(fen)為(wei)父(fu)本(ben)給(gei)母本(ben)授粉(fen)，收獲(huo)雜交當代玉(yu)米單倍體(ti)籽粒。

6、進一步地，提高(gao)玉米單倍體誘導系花粉中中、低(di)活力花粉占比(bi)的(de)方法包括采用活性(xing)炭(tan)處(chu)理玉米單倍體誘導系花粉；

7、所述(shu)處理是于密封容器中將(jiang)所述(shu)花粉和(he)活性(xing)炭隔離儲存1～4天。

8、更進(jin)一步(bu)地，所述儲存的溫度為3～5℃。

9、更進(jin)一步(bu)地，所述容器包括(kuo)帶蓋的離心管。

10、更(geng)進一步地(di)，所述隔離(li)儲存是將(jiang)花粉置于離(li)心(xin)管底部，活性(xing)炭用紗布包(bao)裹后置于離(li)心(xin)管中(zhong)部。

11、更進一步地，處理的(de)時期為玉米單(dan)倍體誘導系的(de)散粉期。

12、進一步地，提高玉米單倍體(ti)誘導系花(hua)粉中(zhong)中(zhong)、低活力花(hua)粉占比的(de)方法包括延遲授粉；

13、所(suo)述延(yan)遲授粉是(shi)于田(tian)間(jian)將米單(dan)倍(bei)體誘(you)導(dao)(dao)系(xi)的雄穗套(tao)袋隔離1～4天，然后(hou)以玉(yu)米單(dan)倍(bei)體誘(you)導(dao)(dao)系(xi)花粉為父本給母(mu)本授粉。

14、進一步地，套袋(dai)隔離(li)的時(shi)期(qi)為玉米單(dan)倍體誘導系的散粉期(qi)。

15、本發明具有如下有益效果(guo)：

16、本發(fa)明的授粉方法(fa)能顯著提高現有玉米單(dan)倍(bei)體誘導(dao)系的誘導(dao)率(lv)。

17、1)本發明提供的方法可以有(you)效提高現有(you)玉米單(dan)倍體誘導系的誘導率。

18、現(xian)有的(de)單倍體誘(you)導率(lv)的(de)提(ti)升(sheng)手段(duan)主要是依靠誘(you)導基(ji)(ji)因或一些(xie)與花(hua)粉發(fa)育(yu)相(xiang)關(guan)基(ji)(ji)因的(de)改良進行的(de)，提(ti)升(sheng)效果(guo)甚微。而本(ben)發(fa)明(ming)提(ti)供的(de)技術手段(duan)可以將現(xian)有誘(you)導系的(de)誘(you)導率(lv)通(tong)過簡(jian)單的(de)處理花(hua)粉的(de)方(fang)式提(ti)高，簡(jian)便易行的(de)同(tong)時(shi)，提(ti)升(sheng)效果(guo)顯著；

19、2)本發明提供的(de)方法可以應用(yong)于任何物(wu)種的(de)誘導系(xi)，具有廣適(shi)性。

20、單倍(bei)體誘(you)(you)導(dao)(dao)基因越發廣泛(fan)的應(ying)用于(yu)不(bu)(bu)同的單雙(shuang)子(zi)葉植物中，而(er)這些(xie)僅僅是起步(bu)階段，單純(chun)的誘(you)(you)導(dao)(dao)基因僅能提供很低的誘(you)(you)導(dao)(dao)率(lv)。而(er)本(ben)發明(ming)提供的方(fang)法可以應(ying)用于(yu)任何一個低誘(you)(you)導(dao)(dao)率(lv)的誘(you)(you)導(dao)(dao)系(xi)品種，不(bu)(bu)局(ju)限與(yu)物種。這樣(yang)大大方(fang)便(bian)了一些(xie)小作物或(huo)者蔬菜作物的單倍(bei)體應(ying)用過程中，受限于(yu)自(zi)花授粉或(huo)者種子(zi)小不(bu)(bu)易識(shi)別等(deng)特點而(er)影(ying)響的單倍(bei)體誘(you)(you)導(dao)(dao)率(lv)的提升。

21、3)本(ben)發明提供的方法操(cao)作簡單易行、成本(ben)較低、效果顯著。

22、相比于傳統(tong)的(de)利用(yong)誘導基因(yin)的(de)組合或(huo)者改(gai)良方法提升單倍體誘導率，本發明提供的(de)方法簡單易行，成本低廉，且在(zai)散粉期可以批量處理，也不(bu)會(hui)影響(xiang)果穗的(de)熟(shu)期。