本發明涉及植(zhi)物(wu)組(zu)(zu)織(zhi)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)技術領域，具(ju)體來說(shuo)是一種(zhong)用(yong)于培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)金花葵愈傷組(zu)(zu)織(zhi)增殖的(de)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)基及其培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)方法。

背景技術：

金花(hua)葵(hibiseumanihotl.)，又名菜芙(fu)蓉，是一種(zhong)生長在深山崖隙間的(de)野(ye)生瀕危(wei)稀有(you)(you)花(hua)卉。明(ming)朝憲宗成(cheng)化年間順德(de)府志記(ji)載：順德(de)府有(you)(you)特產植物金花(hua)葵。因國內(nei)現代文獻資(zi)料均無從查找(zhao)，其在1984年全國農業資(zi)源普查時被確認(ren)已滅絕。然而2003年8月，全國各地陸續報道發現金花(hua)葵的(de)蹤跡，經(jing)(jing)多位專家確認(ren)，金花(hua)葵是野(ye)芙(fu)蓉三個(ge)種(zhong)群(qun)中(zhong)的(de)一個(ge)種(zhong)群(qun)，具有(you)(you)很高的(de)經(jing)(jing)濟價值。

金花葵植株中富含金絲桃苷(gan)、槲皮(pi)素(su)-3-洋槐糖苷(gan)、槲皮(pi)素(su)-3-葡(pu)萄糖苷(gan)、槲皮(pi)素(su)和楊梅(mei)素(su)5種活性黃(huang)(huang)酮(tong)(tong)單體，是植物界中天然(ran)黃(huang)(huang)酮(tong)(tong)含量較高(gao)的(de)(de)品種。其總(zong)黃(huang)(huang)酮(tong)(tong)含量比目前黃(huang)(huang)酮(tong)(tong)生產廣為(wei)應用(yong)的(de)(de)原料銀杏、大豆(dou)等(deng)高(gao)數十倍。金花葵總(zong)黃(huang)(huang)酮(tong)(tong)具有清(qing)熱、利濕、消(xiao)炎(yan)、解毒、鎮(zhen)痛等(deng)功效，對人體急(ji)性心肌(ji)缺(que)血、腦缺(que)氧損傷具有保護作(zuo)用(yong)；金花葵總(zong)黃(huang)(huang)酮(tong)(tong)可以降低急(ji)性心肌(ji)梗塞(sai)(sai)的(de)(de)梗塞(sai)(sai)面積，對心肌(ji)損傷有一定保護作(zuo)用(yong)。愈(yu)傷組織增殖培養(yang)基的(de)(de)篩選(xuan)為(wei)下(xia)一步(bu)進(jin)行大規模(mo)的(de)(de)懸浮細(xi)胞培養(yang)奠定基礎(chu)。

技術實現要素：

本發(fa)明的(de)目的(de)是(shi)提供一種(zhong)用于(yu)培(pei)養(yang)金(jin)花葵愈傷組織(zhi)增(zeng)殖的(de)培(pei)養(yang)基及其培(pei)養(yang)方法(fa)，專(zhuan)門適(shi)用于(yu)金(jin)花葵愈傷組織(zhi)增(zeng)殖培(pei)養(yang)。

為實現上述(shu)目的，本發明采用的技術(shu)方(fang)案(an)是：一(yi)種用于培(pei)養金花(hua)葵愈傷組織(zhi)的增殖培(pei)養基(ji)(ji)，其配方(fang)為：ms基(ji)(ji)礎培(pei)養基(ji)(ji)、6-芐(xia)氨基(ji)(ji)嘌(piao)呤0.5-1.5mg/l、萘(nai)乙酸0.1-1mg/l、2，4二氯苯氧乙酸0.5-2mg/l、蔗(zhe)糖30g/l和植物瓊脂(zhi)7-8g/l。

進(jin)一步(bu)的，培養基(ji)的ph5.8-6.0。

本發明還提(ti)供一種利用(yong)上述培(pei)養基增殖培(pei)養金花葵愈傷組織(zhi)的方法(fa)，步驟包(bao)括：

(1)將未開放的(de)花蕾在洗(xi)衣(yi)粉水中漂洗(xi)10-15min后，在流水下(xia)沖洗(xi)20-30min，在超(chao)凈工作(zuo)臺上用(yong)70％-75％的(de)無水乙醇消(xiao)毒30-45s，然后用(yong)2％naclo消(xiao)毒8-10min,再(zai)用(yong)無菌(jun)水沖洗(xi)5-6次，備用(yong)；

(2)初(chu)代愈傷組織誘(you)導(dao)：將消(xiao)毒好的(de)花蕾用鑷(nie)子(zi)和(he)刀(dao)將花瓣(ban)分(fen)離出來，接種于(yu)添(tian)加6-芐(xia)基腺嘌呤0.5mg/l+萘乙(yi)酸(suan)0.5mg/l+2，4二氯苯(ben)氧乙(yi)酸(suan)1.5mg/l+30g/l蔗糖+8g/l瓊(qiong)脂的(de)ms培養基中，光(guang)強(qiang)1500～2000lx，每(mei)日(ri)光(guang)照時數12～14h，25±2℃培養20d，誘(you)導(dao)出初(chu)代愈傷組織；

(3)繼代培養(yang)：將培養(yang)20d的(de)初(chu)代愈傷(shang)組(zu)織切成大小為(wei)0.25g的(de)小塊，接入ms基礎培養(yang)基、6-芐氨基嘌呤0.5-1.5mg/l、萘(nai)乙(yi)酸0.1-1mg/l、2，4二(er)氯苯氧(yang)乙(yi)酸0.5-2mg/l、蔗糖30g/l和植物瓊脂7-8g/l中培養(yang)15d。

本(ben)發明中，ms培養基作為(wei)本(ben)技(ji)術方案的基本(ben)培養基，為(wei)本(ben)領域技(ji)術人員的公知(zhi)常(chang)識，所(suo)含(han)有的組(zu)分(fen)及(ji)含(han)量如表1：

表1ms培養基的配方(fang)

具體實施方式

下(xia)面將(jiang)結(jie)合(he)本發明實(shi)(shi)施(shi)(shi)例(li)，對本發明實(shi)(shi)施(shi)(shi)例(li)中的技術方案(an)進行清楚、完(wan)整地描述，顯然，所(suo)描述的實(shi)(shi)施(shi)(shi)例(li)僅(jin)僅(jin)是(shi)(shi)本發明一部(bu)分實(shi)(shi)施(shi)(shi)例(li)，而不是(shi)(shi)全(quan)部(bu)的實(shi)(shi)施(shi)(shi)例(li)。基(ji)于(yu)本發明中的實(shi)(shi)施(shi)(shi)例(li)，本領域普通技術人員(yuan)在沒有(you)作出(chu)創造性勞動前提下(xia)所(suo)獲得的所(suo)有(you)其他實(shi)(shi)施(shi)(shi)例(li)，都屬于(yu)本發明保護的范圍。

實施例1

一種增殖培(pei)養(yang)金花葵愈(yu)傷組(zu)織的方(fang)法，具體(ti)按照下列步驟進行(xing)：

a、將(jiang)未開放的花蕾在(zai)(zai)洗(xi)衣粉水中漂洗(xi)10-15min后，在(zai)(zai)流(liu)水下沖洗(xi)20-30min，在(zai)(zai)超(chao)凈工作臺上用(yong)(yong)(yong)70％-75％的無水乙(yi)醇(chun)消毒30-45s，然后用(yong)(yong)(yong)2％naclo消毒8-10min,再用(yong)(yong)(yong)無菌水沖洗(xi)5-6次，備用(yong)(yong)(yong)；

b、初(chu)(chu)代愈(yu)傷(shang)組織誘導：將消毒好(hao)的花蕾用鑷(nie)子和刀將花瓣分離出(chu)(chu)來，接種于添加6-芐基(ji)腺(xian)嘌呤0.5mg/l+萘(nai)乙酸0.5mg/l+2，4二氯苯(ben)氧乙酸1.5mg/l的ms培養基(ji)中，光(guang)強1500～2000lx，每日光(guang)照(zhao)時(shi)數12～14h，25±2℃培養20d，誘導出(chu)(chu)初(chu)(chu)代愈(yu)傷(shang)組織。

c、將(jiang)培(pei)(pei)養(yang)20d的初代(dai)愈傷(shang)組(zu)織切成(cheng)大小平均為(wei)0.25g的小塊，接入表2正交旋轉組(zu)合試(shi)驗(yan)設計的培(pei)(pei)養(yang)基中進行(xing)(xing)繼代(dai)培(pei)(pei)養(yang)，每個處理接種5瓶，每瓶4塊，每個處理總(zong)計20塊，總(zong)質量為(wei)5g，即(ji)初始鮮(xian)(xian)重(zhong)(zhong)為(wei)5g。接種15d以后(hou)，將(jiang)愈傷(shang)組(zu)織取出(chu)進行(xing)(xing)鮮(xian)(xian)重(zhong)(zhong)的稱量即(ji)為(wei)最終(zhong)鮮(xian)(xian)重(zhong)(zhong)，以凈增鮮(xian)(xian)重(zhong)(zhong)(即(ji)最終(zhong)鮮(xian)(xian)重(zhong)(zhong)-初始鮮(xian)(xian)重(zhong)(zhong))為(wei)指(zhi)標進行(xing)(xing)培(pei)(pei)養(yang)基的篩選。

表1正交旋轉組(zu)合試驗設計方案及結(jie)果

通(tong)過上述試驗(yan)可(ke)以確定，用(yong)于培養(yang)金花葵愈(yu)傷組織增(zeng)殖的(de)培養(yang)基的(de)配方為：ms基礎培養(yang)基、6-芐(xia)氨基嘌呤(ling)0.5-1.5mg/l、萘(nai)乙(yi)酸0.1-1mg/l、2，4二(er)氯苯氧乙(yi)酸0.5-2mg/l、蔗糖30g/l和(he)植物瓊(qiong)脂7-8g/l，培養(yang)基的(de)ph5.8-6.0。

實施例2

一種用于(yu)培養金花葵愈傷組織的增(zeng)殖培養基，其配方為：ms基礎培養基、6-芐氨(an)基嘌呤1.3mg/l、萘乙(yi)酸0.82mg/l、2，4二氯(lv)苯氧(yang)乙(yi)酸1.7mg/l、蔗(zhe)糖30g/l和植物瓊脂7g/l，培養基的ph5.8。

利(li)用該(gai)培(pei)養基增(zeng)殖培(pei)養金花葵愈傷組織(zhi)的方法，具體按照下列步驟進行：

(1)將未開放的(de)花(hua)蕾在洗衣粉水中(zhong)漂洗10min后，在流(liu)水下(xia)沖(chong)洗30min，在超凈工作臺上用(yong)(yong)(yong)75％的(de)無(wu)水乙醇消毒30s，然(ran)后用(yong)(yong)(yong)2％naclo消毒10min,再用(yong)(yong)(yong)無(wu)菌(jun)水沖(chong)洗5次，備用(yong)(yong)(yong)；

(2)初代(dai)愈傷(shang)組織(zhi)(zhi)誘(you)導：將(jiang)消毒好(hao)的(de)(de)花(hua)蕾用鑷(nie)子和刀將(jiang)花(hua)瓣分離出來，接種于(yu)添加(jia)6-芐基(ji)腺(xian)嘌呤1.3mg/l+萘乙(yi)酸0.82mg/l+2，4二氯苯氧(yang)乙(yi)酸1.7mg/l+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂的(de)(de)ms培養基(ji)中(zhong)，光(guang)強1500lx，每日(ri)光(guang)照時(shi)數14h，25±2℃培養20d，誘(you)導出初代(dai)愈傷(shang)組織(zhi)(zhi)；

(3)繼代培(pei)養(yang)：將培(pei)養(yang)20d的初(chu)代愈傷組(zu)織(zhi)切成大小(xiao)為(wei)0.25g的小(xiao)塊，接入ms基礎(chu)培(pei)養(yang)基、6-芐氨基嘌呤0.5mg/l、萘(nai)乙酸(suan)0.1mg/l、2，4二氯苯氧乙酸(suan)0.5mg/l、蔗糖(tang)30g/l和(he)植物瓊脂7g/l中培(pei)養(yang)15d，結果凈增鮮重為(wei)15.59g。

實施例3

一(yi)種(zhong)用于(yu)培養(yang)金花葵愈傷組織的(de)增(zeng)殖培養(yang)基，其配方為：ms基礎培養(yang)基、6-芐氨(an)基嘌呤1.0mg/l、萘乙酸0.55mg/l、2，4二氯苯氧乙酸0.5mg/l、蔗糖30g/l和植物瓊(qiong)脂8g/l，培養(yang)基的(de)ph5.8。

一種(zhong)利用上(shang)述培養基增殖培養金花葵愈傷組織的方(fang)法，步驟包括：

(1)將(jiang)未開放(fang)的花蕾在洗(xi)(xi)衣(yi)粉水(shui)中漂洗(xi)(xi)15min后(hou)，在流水(shui)下沖(chong)洗(xi)(xi)20min，在超凈工(gong)作臺上(shang)用75％的無水(shui)乙醇(chun)消(xiao)毒45s，然后(hou)用2％naclo消(xiao)毒8min,再用無菌水(shui)沖(chong)洗(xi)(xi)6次(ci)，備(bei)用；

(2)初代愈(yu)傷組(zu)織誘導(dao)：將(jiang)(jiang)消毒好(hao)的花蕾(lei)用鑷子和刀將(jiang)(jiang)花瓣分離出來，接種于添加6-芐(xia)基腺嘌呤0.5mg/l+萘乙酸0.5mg/l+2，4二氯苯氧乙酸1.5mg/l+30g/l蔗(zhe)糖+8g/l瓊(qiong)脂的ms培養(yang)基中，光強2000lx，每(mei)日光照(zhao)時數(shu)12h，27℃培養(yang)20d，誘導(dao)出初代愈(yu)傷組(zu)織；

(3)繼代培(pei)養：將培(pei)養20d的(de)初代愈傷(shang)(shang)組織切成大(da)小(xiao)為0.25g的(de)小(xiao)塊(kuai)，接入ms基礎(chu)培(pei)養基、6-芐(xia)氨(an)基嘌(piao)呤(ling)1.0mg/l、萘(nai)乙酸(suan)(suan)0.55mg/l、2，4二氯苯(ben)氧乙酸(suan)(suan)0.5mg/l、蔗(zhe)糖30g/l和(he)植(zhi)物瓊脂8g/l中培(pei)養15d得到愈傷(shang)(shang)組織，結果(guo)凈增鮮重為36.84g。

實施例4

一種用于(yu)培(pei)養金花葵愈(yu)傷組織(zhi)的(de)增殖培(pei)養基(ji)(ji)，其配(pei)方(fang)為：ms基(ji)(ji)礎培(pei)養基(ji)(ji)、6-芐氨基(ji)(ji)嘌呤0.7mg/l、萘乙(yi)(yi)酸0.28mg/l、2，4二氯苯(ben)氧乙(yi)(yi)酸0.8mg/l、蔗糖(tang)30g/l和植物瓊脂7.5g/l,培(pei)養基(ji)(ji)的(de)ph5.9。

一種利用上述培(pei)(pei)養基(ji)增(zeng)殖(zhi)培(pei)(pei)養金(jin)花(hua)葵愈傷組織的方(fang)法(fa)，步驟(zou)包括：

(1)將未開放的花(hua)蕾在洗(xi)(xi)衣粉(fen)水(shui)中漂(piao)洗(xi)(xi)12min后，在流水(shui)下(xia)沖洗(xi)(xi)25min，在超凈工作臺上用(yong)(yong)73％的無水(shui)乙(yi)醇消毒(du)40s，然后用(yong)(yong)2％naclo消毒(du)9min,再(zai)用(yong)(yong)無菌水(shui)沖洗(xi)(xi)6次，備用(yong)(yong)；

(2)初代(dai)愈傷組織(zhi)誘導(dao)：將(jiang)消毒(du)好的花蕾用(yong)鑷(nie)子和刀將(jiang)花瓣分離(li)出來(lai)，接種于(yu)添加6-芐基腺嘌呤0.5mg/l+萘(nai)乙(yi)酸0.5mg/l+2，4二氯苯氧乙(yi)酸1.5mg/l+30g/l蔗糖+8g/l瓊(qiong)脂的ms培養基中，光(guang)強1750lx，每(mei)日光(guang)照(zhao)時數13h，23℃培養20天，誘導(dao)出初代(dai)愈傷組織(zhi)；

(3)繼代培(pei)(pei)養(yang)：將培(pei)(pei)養(yang)20d的初代愈傷組織切成大小(xiao)為(wei)(wei)0.25g的小(xiao)塊，接入ms基(ji)礎(chu)培(pei)(pei)養(yang)基(ji)、6-芐氨基(ji)嘌(piao)呤0.7mg/l、萘(nai)乙酸(suan)0.28mg/l、2，4二(er)氯苯(ben)氧(yang)乙酸(suan)0.8mg/l、蔗糖30g/l和植物瓊脂7.5g/l中培(pei)(pei)養(yang)15d，得到愈傷組織，結(jie)果凈增鮮重為(wei)(wei)24.78g。