使用最適化的低鹽培養基培養破囊壺菌屬微生物的方法
【專利摘要】本發明涉及使用最適化的低鹽培養基培養Thraustochytriales屬微生物的方法，按照該方法將微生物培養在不添加鈉鹽和氯鹽并且總鹽含量少于3.5g/L(相當于少于海水鹽含量的10%)的低鹽培養基中，隨后從微生物和/或培養基中分離PUFAs。本發明特別涉及具有大大降低的總鹽含量，尤其是特別降低的NaCl含量的新的最適化培養基。通過使用不同鹽類的新的組合物作為培養基的成分，可以極大地增加并顯著簡化PUFAs的生產，而這種培養基中離子的總重量比率不超過1.75g/L。此外，在優選情況下該培養基中完全不添加鈉鹽和氯鹽，這有助于防止由含有鹽的廢水所引起的環境破壞。
【專利說明】使用最適化的低鹽培養基培養破囊壺菌屬微生物的方法
[0001]本申請是申請日為2004年11月10日、中國國家申請號為200480035832.1、發明名稱為“使用最適化的低鹽培養基培養Thraustochytriales屬微生物的方法”申請的分案申請。
[0002]各種不同的PUFAs(多不飽和脂肪酸)，特別是ω-3脂肪酸(η_3脂肪酸)是人類營養的必需成分。
[0003]然而，已知在大多數工業化國家中，η-3脂肪酸的供給是不足的。與此相反，飲食中的總脂肪比例，以及飽和脂肪酸和η-6脂肪酸的攝入太高。這是由于我們的飲食結構發生的變化，特別是在最近的大約150年間發生的變化所引起的，并與各種不同的文明化所帶來的慢性病，例如工業化國家主要的死亡原因——心血管疾病的出現相關聯(Simopoulos, A.P., 1999, Am.J.Clin.Nutr.70, 560-569)。同時，大量的研究顯不，通過定向地增加η-3脂肪酸，特別是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的攝入，有可能顯著降低心血管病的風險(GlSS1-Prevenz1ne 研究人員(Gruppo Italiano per 1 Stud1della Sopravvivenza nell1 Infarto m1cardico), 1999,在心肌梗塞后通過飲食補充η-3多不飽和脂肪酸和維生素E:GISSI_prevenz1ne試驗的結果，Lancet354, 447-455 ；Burr等，1989，脂肪、魚類和纖維攝取量的變化對死亡和心肌梗塞的影響:飲食和再次梗塞試驗(DART)，Lancet2, 757-761)。因此，許多不同的組織(WHO、FA0、AHA、ISSFAL、不列顛營養基金會等)推薦大量增加η-3脂肪酸的攝入量(Kris-Eherton等，魚類消費量、魚油、ω-3 脂肪酸和心血管疾病，Circulat1n2002, 2747-2757)。
[0004]生產PUFAs以及特別是η-3脂肪酸的源泉為上述所有的海洋冷水魚類以及從它們中提取的油，此外還為海洋微生物，這些海洋微生物與魚類相比的優勢在于，它們可在成本效應和受控條件下進行發酵以生產PUFAs。發酵生產不存在任何污染的危險，而對于魚類或從其中提取的魚油來說卻經常被描述發生這樣的問題(Olsen SF.1nt JEpidem1l.2001:1279-80)。此外，提取的魚油的成分必然會受到對魚的種類和培養條件的選擇的影響，而不易受到季節變化的影響，正如對于魚類和魚產品所描述的那樣(Gamez-Meza et al.Lipidsl999:639-42)。
[0005]已經發現了許多適合于生產n-3PUFA的微生物，例如弧菌(Vibr1)屬的細菌(例如海產弧菌(Vibr1 marinus))或甲藻(Dinophyta),特別是隱甲藻(Crypthecodinium)屬中的微生物例如寇氏隱甲藻(C.cohnii),或原生藻菌例如Pingu1phyceae中的微生物例如 Glossomastix、Phaeomonas> Pingu1chrysis、Pingu1coccus 和 Polydochrysis。優選的用于發酵生產PUFA的微生物屬于Stramenopiles (或Labyrinthulomycota),特別是Thraustochytriales 目(Thraustchytriidea)中的微生物，又特別是 Japonochytrium、裂壺菌(Schizochytrium)、破囊壺菌(Thraustochytrium)、Althornia、Labyrinthuloides、Aplanochytrium 和 Ulkenia 屬中的微生物。
[0006]已經知道一些上面提到的微生物可以用于工業化生產脂肪酸，相應的工藝方法已經被描述。因此，國際專利申請WO 91/07498 Al公開了使用破囊壺菌和裂壺菌屬的生物體來生產PUFAs。WO 91/11918 Al公開了使用寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)生產PUFAs,W096/33263 Al和相應的歐洲專利申請EP O 823 475 Al描述了使用裂壺菌屬的微生物生產PUFAs，而專利申請WO 98/03671公開了使用Ulkenia屬的微生物生產PUFAs。
[0007]上面描述的微生物特別是網粘菌門(Labyrinthulomycota)的自然棲息地是海洋棲息地。因此，這些微生物通常培養在含鹽的培養基中，對本發明來說，海水的鹽濃度被定義為32-35g/L，和90-95%含量的鈉和氯。用于培養海洋微生物例如破囊壺菌或裂壺菌的典型培養基是基于海水(例如ATCC(美國典型培養物保藏中心)的790By+培養基[酵母提取物1.0g,蛋白胨1.0g, D+葡萄糖5.0g,海水IL]) O但是,也已經知道Thraustochytriales目的微生物可以在具有非常低鹽度的培養基中存活。但是，當鹽含量低于7.5-15g/L的限度，對應于鹽度7.5-15%。時，它的生長被描述為只是非常低，在低鹽度范圍內沒有中間最大值。最適生長速度只在高于上面提到的鹽度限度時才能獲得(Fan等，BotanicaMarina45, 2002, 50-57 頁)。
[0008]然而對于廣鹽性微生物的商業化發酵來說，已經描述了使用大約50-60%低鹽含量的海水。按照Henderson的“生物學術語字典”，廣鹽性生物是指那些能夠調整自身適應廣范圍鹽含量的生物(Henderson W.D.，Lawrence, Ε.，Henderson生物學術語字典(Henderson’ s dict1nary of b1logical terms),第十版，1992,173 頁)。
[0009]已經描述了屬于原生藻菌(Stramenopiles)(或Labyrinthulomycota)的廣鹽性微生物可以在含有低量鈉離子(60%的海水)的發酵培養基中生產較大量的PUFA(美國專利N0.6，451，567)。此外也描述了低氯含量培養基的使用，其目的是為了降低氯對發酵設備的腐蝕作用(美國專利No6，410，281)。有報道對于例如破囊壺菌和裂壺菌屬的微生物來說，使用了所含氯濃度低于3g/L的發酵培養基(美國專利Pat.No5, 340，742，美國專利No6, 451，567，美國專利No6，410, 281)。也已經知道培養也可能在與鹽水相比鹽含量較低的條件下進行。具體的參考文獻參見專利文件WO 98/03671 AUEP O 823 475 Al、美國專利No 6，451，567、美國專利 No 6,410,281。
[0010]此外還知道對于裂壺菌屬的微生物(Schizochytrium sp.S31;ATCC20888)的發酵來說，脂肪酸相對產量的最大值在氯化鈉濃度為1.75g/L時獲得。其中使用的鹽的總量不到海水鹽含量的10%，但是主要包含鈉和氯離子(EP O 512 997 BI和美國專利No5，518，918)。
[0011]但是，到目前為止所有描述的方法都有缺點。發酵工藝的效率特別受到可達到的生物質和單位生物質的產物含量的限制。此外，產生的油可能部分以不一定對應于所需產物的脂肪酸形式存在，而必須首先對工藝進行修飾。某種程度上在單位生物質的產物含量低的情況下，加工通常是復雜的，因為為了獲得相對少量的產物必須對相對大量的生物質進行加工。此外，上面描述的所有方法都在培養基中包含了相對高的總鹽含量。這不僅會在產品處理過程中導致大量的問題，而且表現出極端的環境劣勢，因為不僅產生了大量的生物質，而且產生了含有大量鹽的廢水，它們必須被處理。
[0012]因此，根據本【技術領域】的現狀，本發明的一個目的是提供新的、簡單和經濟的使用含有低鹽含量的培養基培養Thraustochytriales的方法。除了成本效應之外，本方法還應該易于實施，并能夠高產高純度的PUFAs或含有PUFA的產品。
[0013]該任務以及其它雖沒有明確地描述但可以從引言所討論的關系中毫不費力地得出或推演出的任務，可以通過在本發明的權利要求中限定的目標來實現。
[0014]權利要求1中限定的方法提供了一種有優勢的培養Thraustochytriales的方法。該方法包括將Thraustochytriales目的微生物在不添加固體或溶液形式的鈉或氯離子的低鹽培養基中培養，該培養基的總鹽含量與海水相比少于10%,即總鹽含量少于大約3.5g/L0
[0015]本發明還包括了生產高純度PUFAs的方法。
[0016]按照本發明，優選的PUFAs是DHA、DPA和EPA。
[0017]具體來說，通過上述方法培養的微生物表現出大于10%，優選情況下大于14%，更優選情況下大于18%DHA/干生物質的產量。
[0018]具體來說，通過上述方法培養的微生物表現出大于5%，優選情況下大于7%，更優選情況下大于10%DPA/干生物質的產量。
[0019]通過在培養后從微生物(生物質)和/或培養基中分離PUFAs，可以獲得高產量和高純度的PUFAs。
[0020]此外，本發明提供了生產生物質的方法，其中生物質是通過本發明的培養方法提供的。
[0021]該生物質可以以所有可以想象得到的方式使用。具體來說，該生物質可以以例如干燥的形式(干生物質)使用，直接作為食品或動物飼料使用。
[0022]此外，本發明還包括油狀的形式，它是通過實施本發明的培養方法，然后從微生物(生物質)和/或培養基中分離該油狀物而獲得的。
[0023]具體來說，這是除了許多其它優選應用之外，可以方便地用于人類營養的油狀物。
[0024]在本發明的條件下，微生物每單位重量干生物質表現出大于30wt%，優選情況下大于35wt%油狀物的產量。
[0025]根據本發明，油狀物被理解為含有至少70%中性脂和至少2%磷脂，與本領域的專業人員所熟知的正常Thraustochytriales脂肪酸形式相一致。其中的中性脂含有至少80%的甘油三酯和其它化合物例如二酰基甘油、留醇等。此外，甘油三酯的重量分數包括大約95%脂肪酸和5%甘油。在相當于不到10%典型海水鹽含量的如此低鹽濃度下發酵海洋微生物的可能性，特別是可完全免除添加在海水中占支配地位、一般來說占海水中可用離子的大約90%的Na+和Cl—離子這個事實，是絕對令人吃驚的。
[0026]令人吃驚的是，不僅發酵本身是可能的，而且當使用本發明的低鹽培養基時，生物質中的PUFA比例顯著提高了。更令人吃驚的是，這種效應不僅補償而且超出了生物質產量的輕微降低(實施例2)。與在培養基I (50%海水鹽含量)中進行的對比發酵相比，單位干生物質的主要PUFA——DHA的比例增加了 10%以上。較高的產物濃度和較低的鹽污染使得產品的加工簡化，所有這些在總體上提高了空間-時間產量。
[0027]在本發明以前,沒有已知的發酵工藝可用于在Thraustochytriales目的微生物中使用如此低鹽濃度并且不添加鈉和氯的培養基來生產η-3脂肪酸。
[0028]PUFAs是多不飽和長鏈脂肪酸，鏈長大于C12，含有至少兩個雙鍵。可以按照本發明的方法生產的PUFAs具體來說是η-3脂肪酸和η-6脂肪酸。
[0029]在本發明中，η-3脂肪酸(ω-3脂肪酸)被理解為多不飽和長鏈脂肪酸，鏈長大于C12，含有至少兩個或以上雙鍵，其中第一個雙鍵位于從烷基末端開始的C3和C4碳原子之間。因此，對于η-6脂肪酸來說，第一個雙鍵位于從烷基末端開始的C6和C7碳原子之間。
[0030]屬于Labyrinthulomycota組的微生物被考慮用于按照本發明的方法生產PUFAsο Thraustochytriales (Thraustchytriidea)目的微生物是優選的(Lewis, T.E., Nichols, P.D., McMeekin, T.A., Thraustochytrids 的生物技術潛力，海洋生物技術，1999,580-587頁；和Porter，D，原生生物手冊中的網粘菌門:動物、植物和真菌之外的真核微生物及其后裔的結構、培養、棲息地和生活史:藻類、纖毛蟲、有孔蟲、sprOTozoa、水霉和其它原生生物指南。Margulis, L, Corliss, J.0., Melkonian, Μ.和 Chapman, D.J.主編，McKhann, H.1.協編，Jones and Bartlett Publishers, ISBN0-86720-052-91990, 388-398頁)o 特別優選的是 Japonochytrium、Labyrinthuloides、Aplanochytrium Althornia、裂壺菌、破囊壺菌和Ulkenia屬的微生物。其中，裂壺菌、破囊壺菌和Ulkenia是最特別優選的。特別優選的是:Japonochytrium sp.ATCC28207, Thraustochytrium aureum(特別是 ATCC28211 和 ATCC34304), Thraustochytrium roseum ATCC28210, Thraustochytriumsp.ATCC20890、ATCC20891、ATCC20892 和 ATCC26185，Schizochytrium aggregatumATCC28209, Schizochytrium sp.ATCC20888 和 ATCC20889，Schizochytrium SR21,以及Ulkenia sp.SAM2179 和 SAM2180。
[0031]適合用于本發明的方法的微生物可以是野生型的，也可以是突變體和從它們衍生的菌株以及相應生物的重組菌株。本發明特別包括了用于提高PUFA產量的突變或重組菌株。
[0032]本發明的微生物通過用這些生物體的預培養物接種液體或固體培養基來進行培養。
[0033]適合于Thraustochytriales目的微生物的培養技術對本【技術領域】的專業技術人員來說是眾所周知的。一般但不是絕對地來說，培養是通過在相應的容器中進行含水發酵來完成的。用于這種類型發酵的典型容器的例子包括搖瓶或生物反應器，例如STRs(攪拌釜式反應器)或泡罩塔。培養一般在溫度為10°C到40°C之間，優選為20°C到35°C之間，特別優選為25°C到30°C之間，更特別優選為27°C和29°C之間進行，特別是在28°C下進行。
[0034]在本發明的另一個實施方案中，低鹽培養基含有的總鹽少于1.5g/L。
[0035]在本發明的另一個優選實施方案中，低鹽培養基的總鹽含量相當于海水鹽含量值的15%以下，優選情況下相當于12%以下，更優選情況下相當于10%以下。非常特別優選的是總鹽含量為海水鹽含量的8%以下。
[0036]在低鹽培養基中不添加鈉鹽。在本發明的低鹽培養基中也不添加氯化物鹽類。
[0037]按照本發明，添加意味著以溶解和固體的形式加入。例如，按照本發明，加入海水，即使是最少量的海水，也屬于加入了鈉和氯鹽。在本發明的培養基中加入不常用的培養基成分，如果這些不常用的培養基成分中含有相應的鈉或氯離子，也被理解為加入了這些鹽。然而，對于本【技術領域】的專業人員來說很明顯的是，常用的(以及最需要的，即必需的)培養基成分水(自來水)、酵母提取物、玉米漿或類似物含有非常少量的、無法避免的鈉和氯。因此根據本發明，加入這樣的常用培養基成分不被理解為加入了鈉和氯鹽。
[0038]例如，酵母提取物含有少于2wt%的NaCl。因此，如果以常用量即10到20g/L之間，在培養基中加入酵母提取物，NaCl含量的增加少于0.2g/L。根據本發明這不被當作添加了 NaCl。
[0039]在具體的優選實施方案中，因此該培養基無鈉和/或氯鹽的添加。
[0040]低鹽培養基的總鈉含量在優選情況下少于2g/L，在優選情況下少于500mg/L，和非常特別優選情況下少于150mg/L。低鹽培養基的總氯含量在優選情況下少于2g/L，在優選情況下少于500mg/L，和非常特別優選情況下少于250mg/L。
[0041]Na離子和Cl離子的重量分數總和在特別優選情況下少于1.75g/L。
[0042]此外，低鹽培養基優選含有一種或多種碳源，以及一種或多種氮源。對于本【技術領域】的專業技術人員來說，可用做培養Thraustochytriales目的微生物的碳源和氮源的物質是眾所周知的。
[0043]可以使用的碳源例如碳水化合物例如葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、可溶淀粉、巖藻糖、葡萄糖胺、葡聚糖、谷氨酸、糖蜜、甘油或甘露醇、或脂肪和油類或植物水解產物。
[0044]可以使用的天然氮源例如蛋白胨、酵母提取物、麥芽提取物、牛肉提取物、酪蛋白氨基酸、玉米漿或大豆，可以使用的有機氮源例如谷氨酸和尿素，無機氮源例如乙酸銨、碳酸氫銨、硫酸銨或硝酸銨也可以被用做氮源。
[0045]低鹽培養基可以含有本領域的專業技術人員所熟知的能夠協助Thraustochytriales目的微生物培養的所有其它成分,特別是例如Ca、Mg、K、Fe、N1、Co、Cu、Mn、Mo或Zn的無機鹽。可以列舉的例子有磷酸鹽例如磷酸氫鉀，或碳酸鹽例如碳酸鈣，硫酸鹽例如硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鐵或硫酸銅。其它可以使用的無機鹽例如鹵化物，例如溴化鉀或碘化鉀。
[0046]在適合的情況下，培養基可以含有添加的大量或微量營養素，例如氨基酸、嘌呤、嘧啶、玉米漿、蛋白水解物、(水溶性和/或水不溶性的)維生素，以及其它本領域的專業技術人員所熟知的培養基成分。如果需要也可以加入消泡劑。培養基可以含有復雜成分，也可以是化學上確定的。
[0047]每種成分的量可以變化，只要對微生物的生長或生產率沒有負面影響就行。本領域的專業技術人員可以根據微生物的需要容易地確定每種情況下所需的成分。一般來說，碳源的添加濃度是50到300g/L，氮源的添加濃度為I到30g/L。在優選情況下，氮的含量依賴于培養基中碳的含量來進行調整。
[0048]當情況允許的時候，特別優選的低鹽培養基除了其它成分例如營養性成分之外，還含有至少一種鹽類，該鹽從含有硫酸鎂、碳酸鈣和磷酸鉀的組中選擇，其中每種鹽的添加濃度優選不超過3g/L，特別優選每種不超過lg/L，并且不超過本發明的總鹽含量。當硫酸鎂、碳酸鈣和磷酸鉀被添加到培養基中時，這是特別優選的。
[0049]優選的營養性成分是常用量的葡萄糖、酵母提取物和/或玉米漿以及其它本領域的專業技術人員所熟知的常用營養性成分。
[0050]培養基的pH值通過加入相應的酸或堿被設定在3到10的范圍內，優選為4到8，特別優選為5到7，非常特別優選為6。
[0051]然后將培養基進行滅菌。對培養基進行滅菌的技術對本領域的專業技術人員來說是熟知的，可以舉出的例子包括高壓滅菌和除菌過濾。
[0052]正如本領域的專業技術人員所通常了解的那樣，培養可以以分批培養、補料分批培養或連續培養的方式進行。
[0053]分批培養或補料分批培養進行的時間通常為I到12天，優選為2到10天，特別優選為3到9天。
[0054]培養基成分可以單獨地或作為混合物加入到低鹽培養基中，事先制備的混合物也能夠使用。培養基成分，特別是碳源和氮源或特別的培養基添加物可以在培養前或培養過程中加入。成分的加入可以重復一次或幾次，也可以連續地進行。
[0055]生產出的PUFA —般為中性脂肪的形式例如三酰甘油，或極性脂的形式例如磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺或磷脂酰肌醇。
[0056]但是對于本發明來說，術語PUFA、η-3脂肪酸或η_3活性物質被理解為其中可以存在相應脂肪酸的所有可能的形式，即游離脂肪酸以及酯、甘油三酯、磷脂或其它衍生物。所有這些物質都在下文中進行了概述，使用的術語具有同樣的意義。此外，在從培養物中分離之前或之后，PUFAs可以通過化學的或生物催化的轉酯反應方式進行轉化和濃縮，例如在適當的酶(脂酶)的幫助下。
[0057]從發酵的微生物或培養基中分離PUFAs以及對脂肪酸形式的分析可以使用本領域的專業技術人員所熟知的常用方法來進行[Wanasundara, U.N., ffanasundara, J., Shahidi, F., ω-3脂肪酸濃縮物:生產技術綜述，海洋食品一質量、技術和營養藥物應用，2002，157-174頁]。
[0058]圖1顯示了 DHA的生產與鹽濃度的依賴關系。在本發明的范圍內的最大值可以被清楚地看見(數據來自實施例1)。
[0059]圖2顯示了生物質和DHA含量與鹽濃度的依賴關系。在這種情況下在本發明的范圍內的最大值也可以被清楚地看見(數據來自實施例1)。
[0060]構成了本發明方法的基礎的發酵培養基在下文中以一些實施例的方式進行描述。然而，發酵培養基以及本發明并不限于這些實施例。
[0061]實施例1:培養基中不同的鹽量對Ulkenia sp.SAM2179生產PUFA的影響
[0062]SAM2179 菌株(Ulkenia sp.BP-5601 ；W09803671)被培養在含有 50ml 培養基的300ml帶有擋板的錐形燒瓶中(溫度:28°C，轉速:150rpm)。
[0063]培養某1:DH1培養某
[0064]單水葡萄糖(g/L):56.25
[0065]酵母提取物(g/L):12.5[Difco]
[0066]Tropic Marin 海鹽(g/L): 16.65 [Dr.Biener GmbH, ffartenberg, Germany]
[0067]用HCl將pH值調整到6.0
[0068]培養基2 =ΡΗ2培養基(不含鹽)
[0069]單水葡萄糖(g/L):56.25
[0070]酵母提取物(g/L):12.5[Difco]
[0071]用HCl將pH值調整到6.0
[0072]培養基I中的鹽(Tropic Marin)以下述的濃度使用:1X(培養基I)，0.75X(培養基1.1)，0.5X (培養基1.2)，0.25X (培養基1.3)以及0.1X (培養基1.4)。
[0073]在培養48小時后通過離心收獲細胞。然后將細胞冷凍干燥并確定干生物質。通過在10%甲醇鹽酸中于60°C熱處理2小時(同時攪拌)來進行細胞裂解和脂肪酸測定。酯通過氣相色譜進行分析以測定脂肪酸成分(Wanasundara, U.N., ffanasundara, J., Shahidi, F., ω-3脂肪酸濃縮物:生產技術綜述,海洋食品一質量、技術和營養藥物應用，2002，157-174頁)。
[0074]表1:不同的鹽含量對發酵參數的影響
[0075]
【權利要求】
1.一種培養裂壺菌(Schizochytrium)或Ulkenia屬的微生物的方法,其中將微生物培養在不添加鈉鹽和氯鹽的發酵培養基中，其中Na+和Cl—離子的重量分數之和少于1.75g/L并且總鹽含量少于3.5g/L，其中的微生物每干生物質產生多于10%的DHA。
2.權利要求1的方法，其中向培養基中加入最多3g/LCaC03。
3.權利要求1或2的方法，其中的微生物每干生物質產生多于14%的DHA。
4.權利要求1-3任何一個的方法，其中的微生物每干生物質產生多于5%的DPA。
5.權利要求1-4任何一個的方法，其特征為發酵培養基的總鹽含量在小于海水鹽含量的8%的范圍內 。
6.權利要求1-5任何一個的方法,其特征為發酵培養基的總鈉含量少于150mg/L。
7.權利要求1-6任何一個的方法,其特征為發酵培養基的總氯含量少于250mg/L。
8.權利要求1-7任何一個的方法，其特征為發酵培養基含有葡萄糖、酵母提取物、硫酸鎂、碳酸鈣和磷酸鉀。
9.權利要求1-8任何一個的方法，其特征為發酵培養基含有葡萄糖、玉米漿、硫酸鎂、碳酸鈣和磷酸鉀。
10.權利要求8或9的方法，其特征為發酵培養基含有的硫酸鎂、碳酸鈣和磷酸鉀每種少于3g/L。
11.權利要求1-10任何一個的方法，其特征為發酵培養基的pH值在3到10之間。
12.權利要求1-11任何一個的方法，其特征為培養在10°C和40°C之間進行。
13.權利要求1-12任何一個的方法，其特征為培養進行I到10天。
14.權利要求1-13任何一個的方法，其特征為微生物是Ulkeniasp.SAM2179。
15.權利要求1-13任何一個的方法,其特征為微生物是Schizochytriumsp.SR21。
16.含有至少10%DHA的油，其能通過如下步驟獲得: a)將裂壺菌(Schizochytrium)或Ulkenia屬的微生物培養在不添加鈉鹽和氯鹽的發酵培養基中，其中Na+和Cl—離子的重量分數之和少于1.75g/L并且總鹽含量少于3.5g/L， b)從所述微生物獲得生物質和/或培養液，以及 c)從培養液和/或其中含有的生物質中分離油。
17.含有至少5%DPA的油，其能通過如下步驟獲得: a)將裂壺菌(Schizochytrium)或Ulkenia屬的微生物培養在不添加鈉鹽和氯鹽的發酵培養基中，其中Na+和Cl—離子的重量分數之和少于1.75g/L并且總鹽含量少于3.5g/L， b)從所述微生物獲得生物質和/或培養液，以及 c)從培養液和/或其中含有的生物質中分離油。
18.含有生物質的動物飼料,通過將裂壺菌(Schizochytrium)或Ulkenia屬的微生物培養在不添加鈉鹽和氯鹽的發酵培養基中，其中Na+和CF離子的重量分數之和少于1.75g/L并且總鹽含量少于3.5g/L,以及從所述微生物產生生物質。
19.含有生物質的人類營養食品,通過將裂壺菌(Schizochytrium)或Ulkenia屬的微生物培養在不添加鈉鹽和氯鹽的發酵培養基中，其中Na+和CF離子的重量分數之和少于1.75g/L并且總鹽含量少于3.5g/L,以及從所述微生物產生生物質。
20.從裂壺菌(Schizochytrium)或Ulkenia屬的微生物生產油的方法,所述微生物表現出每干生物質產生多于10%的DHA，其特征為，a)將微生物培養在不添加鈉鹽和氯鹽的發酵培養基中，其中Na+和Cr離子的重量分數之和少于1.75g/L并且總鹽含量少于3.5g/L， b)從所述微生物獲得生物質和/或培養液，以及 c)分離生物質和/或培養液中所含的油。
21.從裂壺菌(Schizochytrium)或Ulkenia屬的微生物生產多不飽和脂肪酸的方法，其特征為， a)將微生物培養在不添加鈉鹽和氯鹽的發酵培養基中，其中Na+和Cr離子的重量分數之和少于1.75g/L并且總鹽含量少于3.5g/L， b)從所述微生物獲得生物質和/或培養液， c)分離生物質和/或培養液中所含的油，以及 d)從所獲得的油分離其中所含的多不飽和脂肪酸。
22.權利要求21的方法，其中多不飽和脂肪酸是DHA。
23.權利要求22的方法，其中DHA的純度為至少90%。
24.權利要求23的方法，其中多不飽和脂肪酸是DPA。
25.權利要求24的方法，其中DPA的純度為至少90%。
【文檔編號】A23K1/16GK104073442SQ201410052133
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2004年11月10日 優先權日:2003年11月10日
【發明者】馬西亞斯·魯辛, 馬爾庫什·盧伊 申請人:努特諾瓦營養產品及食品成分有限公司