專利名稱：茄子花青素合成相關轉錄因子SmMYB的基因序列的制作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種生物技術領域的基因序列，具體是一種茄子花青素合成相關轉錄因子SmMYB的基因序列。
背景技術：
花青素在自然界廣泛存在，屬于類黃酮類物質，通常與葡萄糖等糖類形成糖苷，稱為花色苷。因為花青素具有抗氧化、清除自由基等生化藥理作用，自80年代以來，全世界對其研究日益廣泛深入。茄子是起源于亞洲在全世界廣泛種植的蔬菜作物，其不同品種在形狀及顏色上差異很大，而紫茄是市場上最普遍的品種。紫茄果皮富含飛燕草素-3-蕓香糖苷，是一種穩定性很強的花色苷，營養價值豐富。如今，提高植物體內類黃酮(花青素)類物質已經成為了植物育種的一個重要的方向。Paz-Ares等在《EMBO J》1987年第6卷第3553-3558頁發表的《The regulatory cllocus of Zea mays encodes a protein with homology to myb proto-oncogene productsand with structural similarities to transcriptional activators〉〉中，第一次報道了從玉米中鑒定出的編碼MYB轉錄因子的基因Cl。之后Espley、Takahash1、Dal Cin等多位研究者相繼從擬南芥、蘋果、矮牽牛等植物中分離出多個與花青素合成相關MYB基因。Albert 等在《Plant J》2011 年第 65 卷第 771-784 頁發表的《Members of an R2R3-MYBtranscription factor family in Petunia are developmentalIy and environmentalIyregulated to control complex floral and vegetative pigmentation patterning)) 一文中，提出MYB蛋白、bHLH蛋白、WD40蛋白協同調控矮牽牛花青素合成的模式，為人們探究植物花青素合成調控機制提供理論基礎。目前對茄科作物花青素生物合成調控的研究主要集中在矮牽牛、馬鈴薯、番茄中，對茄子花青素的研究還集中于抗氧化性評價及關鍵酶基因篩選，對轉錄因子的基因克隆及調控機制研究尚未見報道。本發明分離克隆茄子花青素合成相關MYB轉錄因子基因SmMYB，對其時空表達特性進行分析，為探究茄子花青素生物合成調控機制提供理論基礎，也為茄子果色育種及茄子保健作用的進一步開發提供條件。經對現有技術文獻的檢索，尚未發現與本發明相同或者相似的技術主題。

發明內容
本發明的目的是提供一種茄子花青素合成相關轉錄因子SmMYB的基因序列。該基因序列cDNA全長1035bp，編碼區位置在69bp_905bp之間，推導出278個氨基酸，其編碼及推導的氨基酸序列為 :IMNTATVAKSLGVRKGAffT EEI ATGAATACTGCTACTGTTGCTAAGTCATTGGGAGTGAGGAAAGGTGCATGGACTGAAGAA21 EDLLLRKCMDKYGEGKffHLV6I GAAGATTTACTATTGAGGAAATGTATGGACAAGTATGGTGAAGGCAAGTGGCATCTTGTT
41 PTRSGLNRCRKSCRLRffLNY121 CCCACTAGATCAGGTCTAAATAGATGCCGAAAGAGTTGTAGACTAAGATGGTTGAATTAT61 LRPHIKRGDFAPDEIDLILR181 TTAAGACCACATATCAAAAGAGGTGACTTTGCTCCGGACGAAATAGATCTCATTTTGAGA81 LHKLLGNRffSLIAGRFPERT241 CTTCATAAGCTTCTAGGCAACAGATGGTCACTTATTGCTGGAAGATTTCCGGAAAGAACA101 ANDVKNYffNTHIQKKLTNSR301 GCAAACGATGTGAAAAACTATTGGAACACACACATACAAAAAAAGTTAACAAATTCGCGG121PQMQERKHNNALKITKNTIL36I CCTCAGATGCAAGAGAGAAAGCACAATAATGCCCTCAAGATCACCAAAAACACCATACTA141RPQPRPPPPPPPPPPPPPRT42I AGACCTCAACCTCGACCTCCACCTCCACCTCCACCTCCACCTCCACCTCCACCTCGGACC161 FSSAKNVSffCTNKNMNITNT48I TTCTCAAGTGCAAAGAATGTTTCTTGGTGCACCAATAAAAATATGAATATCACAAACACA181LDKDNERHKEIGVNTCEKPK54I TTAGATAAAGATAACGAACGCCACAAAGAAATTGGAGTAAATACATGTGAGAAGCCAAAA201 GDATSSSIDDDGVQffffTSLL60I GGTGATGCAACATCGTCGTCTATAGACGATGATGGAGTTCAATGGTGGACAAGTTTGCTG221ENCNEIEEEATAVLSFEEEN66I GAAAATTGCAATGAAATTGAGGAAGAAGCAACAGCAGTACTGAGCTTTGAGGAAGAAAAT241KFLPNLLHEENNSPPMQQGQ721 AAGTTTTTACCAAATTTGTTGCATGAAGAAAATAATTCACCACCCATGCAACAAGGACAA261NDGWDDFSVDIDLWNLFN*78I AATGATGGTTGGGATGACTTTTCAGTGGATATTGACCTATGGAATCTATTTAATTAG本發明是通過以下技術方案實現的:一種茄子花青素合成相關轉錄因子SmMYB的基因序列，其具有SEQ ID N0.1中從核苷酸第1-1035位所示的核苷酸序列。所述的基因序列編碼的多肽具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。所述的茄子花青素合成相關轉錄因子SmMYB基因在獲得高花青素含量及抗性品質優良的茄子品種中的應用。本發明根據Genebank數據庫，運用生物信息學手段，通過同源序列比較設計出簡并引物，用分子克隆的方法，克隆出紫色茄子中MYB (SmMYB)基因；經過序列分析，確定是茄子MYB基因；組織表達分析發現，茄子花青素合成相關轉錄因子SmMYB基因在紫茄果皮中表達量明顯高于紫茄其它組織及白茄各組織；套袋遮光處理后，熒光半定量檢測發現茄子果皮花青素含量變化與該SmMYB基因表達量變化趨勢相似，說明該基因與茄子花青素合成相關。本發明涉及的大腸桿菌DH5a，BL_21菌株已在《薩姆布魯克J，拉塞爾DW.分子克隆實驗指南[M].黃培堂，王嘉璽，朱厚礎，等譯.第3版.北京:科學出版社，2002》中公開；大腸桿菌DH5a， BL-21可通過公開市售的商業渠道取得，如上海天根生物公司，公司地址:上海市漕溪路258弄27號航星商務樓I號樓606室。本發明的MYB轉錄因子基因為茄子花青素合成的關鍵調控基因，該基因通過結合順式元件調節下游基因的表達，從而調控花青素合成。本發明具有如下有益效果:利用本發明所述的茄子花青素合成相關轉錄因子SmMYB的基因，可篩選出受其調控的與花青素合成密切相關的下游基因，以及與其相互作用的其他轉錄因子基因，從而探究茄子花青素合成路徑調控機制。利用本發明可獲得高花青素含量及抗性品質優良的茄子品種。


圖1為本發明SmMYB基因組織表達分析圖。圖2為遮光處理后果皮花青素含量變化圖。圖3為遮光處理后果皮中SmMYB基因表達分析圖。
具體實施例方式下面結合具體的實施例和附圖對本發明作進一步說明，這些實施例僅用于說明本發明而不能限制本發明要求保護的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等(1989)編著的分子克隆實驗手冊(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實驗所用的PrimeScript 1stStrand cDNA Synthesis Kit、高保真的Taq酶、pMD19 — T載體是大連TaKaRa公司的產品。實施例1，茄子花青素合成相關轉錄因子SmMYB基因的克隆及組織表達特性分析。步驟一，茄子花青素合成相關轉錄因子SmMYB基因的克隆。1、實驗材料取材——以本申請人保存的優良茄子種質資源YZ14與YZ3為實驗材料。YZ14表型為無刺、紫莖、紫花、紫果，以下均稱為紫茄；YZ3表型為有刺、綠莖、白花、白果，具有較明顯的野生茄性狀，以下均稱為白茄。實驗材料均種植于上海市閔行區浦江鎮航天育種基地的人工塑料大棚中，自然條件下育苗、生長并結實。取紫茄的根、紫色莖、紫色葉片、紫色花瓣、紫色果實，白茄的根、綠色莖、綠色葉片、白色花瓣、白色果實。2、提取紫茄紫色花瓣RNA——a)稱取0.5g左右紫色花瓣，加入液氮充后分碾磨成粉狀物，液氮揮發之前，將樣品轉移到一個RNase-free 1.5ml離心管中，劇烈震蕩混勻，12000rpm離心5min,吸取上清到一個新RNase-free 1.5ml離心管中；b)向裂解樣品中加入1/2體積無水乙醇充分混勻將吸附柱放入收集管中，用移液器將溶液全部加至吸附柱中，靜置2min，8000rpm離心lmin，倒掉收集管中廢液；c)將吸附柱放回收集管中，加入500 μ I Rff Soultion,靜置lmin, IOOOOrpm離心lmin，倒掉收集管中廢液；d)將吸附柱放回收集管中，加入500 μ I RPE Soultion,靜置2min, IOOOOrpm離心lmin，倒掉收集管中廢液；e)重復步驟d) —次；
f)將吸附柱放回收集管中，IOOOOrpm離心2min ；g)將吸附柱放入RNase-free的1.5ml離心管中，在吸附膜中央加入30-50 μ IDEPOtreatedddH2O,靜置 5min, 12000rpm 離心 2min,將所得到的 RNA 溶液于-70°C保存；h)用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質量，然后在分光光度計上測定RNA含量。3、SmDFR基因cDNA全長克隆-根據植物中MYB基因DNA結合域保守區設計一對簡并引物(見下列表2)，以紫長茄的花作為材料提取總RNA進行RT-PCR及PCR，反轉錄參照生工AMV反轉錄酶說明書進行，PCR 反應條件為:94°C 4min ；94°C 30s, 55°C 45s, 72°C lmin，30 個循環；72°C 8min。將回收的PCR產物連接至pMD19_T載體上，轉化大腸桿菌DH-5 α，利用α互補及菌落PCR篩選陽性克隆，送至上海華大基因進行測序。根據已經獲得的MYB基因中間片段核苷酸序列設計3’ RACE擴增特異引物及巢式檢驗弓I物(見下列表I )，分別與3’通用引物UPM和NUP進行3’ cDNA末端擴增。設計5’RACE擴增特異弓I物及巢式檢驗弓I物(見下列表I)，分別與SMARTer5 ’ Primer和SMARTer5 ’ NestedPrimer 進行 5’cDNA 末端擴增。操作步驟參照 SMARTer RACE cDNAAmplif ication Kit 試劑盒(Takara)說明書完成。克隆方法同上。根據RACE拼接序列設計基因全長擴增特異引物(見下列表1)，以反轉錄獲得的cDNA作為PCR模板，擴增茄子SmMYB基因cDNA全長序列，反轉錄參照生工AMV反轉錄酶說明書進行，PCR 反應條件為 98°C 3min ；98°C 10s，55。。15s，72。。lmin，30 個循環；72°C 8min。克隆方法同上。表I本發明所用引物

引物名稱_引物序列(5’ 一3’)_
SmMYB-FGAAGT(A/G/T)AG(A/G)AAAGG(A/G/T)CC(A/C)TGGAC
SmMYB-RGACCAGA(A/G/T)(A/G)TC(C/T)TCCAT(A/G)CTCCA
SmMYB-5’ race-RTGACCATGATTACGCCAAGCTTGCA
SmMYB-5’ race-Nested-RCCAGCAATAAGTGACCATCTGTTG
SmMYB-3’ race—FGCATGGACTGMGAAGAAGATTTAC
SmMYB-3' race-Nested^FAGGCAAGTGGCATCTTGTTCCCA
UPMCTAATACGACTCACTATAGGGC
MJPAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT
SmMYB-FL-FGTGGAAAAGAGCAAAAAGC
SniMYB-FL-RGAATGTATCCCTAATCCCTAG
SmMYBl-RT-FCCACCTCGGACCTTCTCA
SnAIYBl-RT-RTGGCGTTCGTTATCTTTATCTA
SmAc t.1n-FTTCCTTGTATGCTAGTGGTCGTACAA
SmAct in-R CTCAGCACCAATGGTAATAACTTGTCC 表2本發明遮光處理實驗設計
權利要求
1.一種茄子花青素合成相關轉錄因子SmMYB的基因序列，其特征在于，該基因序列具有SEQ ID N0.1中從核苷酸第1-1035位所示的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的茄子花青素合成相關轉錄因子SmMYB的基因序列，其特征在于，所述的基因序列編碼的多肽具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。
3.根據權利要求2所述的茄子花青素合成相關轉錄因子SmMYB基因在獲得高花青素含量及抗性品質優良的茄子品 種中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種茄子花青素合成相關轉錄因子SmMYB的基因序列，其具有SEQ ID NO.1中從核苷酸第1-1035位所示的核苷酸序列，該基因序列編碼的多肽具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本發明為茄子花青素合成的關鍵調控基因，利用所述的茄子花青素合成相關轉錄因子SmMYB基因，可篩選出受其調控的與花青素合成密切相關的下游基因，以及與其相互作用的其他轉錄因子基因，本發明應用于獲得高花青素含量及抗性品質優良的茄子品種。
文檔編號A01H5/00GK103215275SQ20121043655
公開日2013年7月24日 申請日期2013年5月20日 優先權日2013年5月20日
發明者陳火英, 邵文婷, 韓洪強, 葛海燕 申請人:上海交通大學