專利名稱：一種控制水稻谷粒粒寬和粒重的主效基因gs5的克隆與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程技術領域。具體涉及到一個位于水稻第五染色體短臂上 控制谷粒粒寬和粒重的主效QTL (GS5)的基因克隆與應用。
背景技術：
水稻谷粒大小是一個重大的農藝性狀(1)谷粒大小由粒長、粒寬、粒厚三個子性 狀控制，是千粒重的主要決定因素，而粒重又是水稻產量的三個主要構成因子之一。因此， 谷粒大小是一個重要的產量性狀；(2)粒重和粒長、粒寬、粒厚等性狀呈極顯著正相關(邢 永忠等，2001，植物學報43:840-845)，所以谷粒大小還是一個重要的稻米外觀品質性狀。 稻谷品質越來越被世人所關注，人們對稻米米質的要求不僅是口味的舒適，還要求外型的 美觀，因此稻米外觀品質的好壞直接關系稻米商品性的好壞，而在我國國家優質稻谷標準 中還對稻米粒長與粒寬的比值作了具體規定，認為優質的秈稻品種的稻米長寬比不能低于 2.8。(3)谷粒大小在作物的進化研究中具有重要的意義。一般認為野生種具有小而圓的谷 粒粒形以適應自然選擇，經過人類長期的馴化和選擇，現有栽培種的谷粒粒形明顯變大。因 此，闡明谷粒大小的遺傳基礎和分子機理有利于同時改良水稻的產量和品質，還可為禾本 科的進化研究提供線索。谷粒大小的遺傳基礎比較復雜，是典型的數量性狀。利用分子標記技術可以對 控制數量性狀的QTL(Quantitative Trait Loci)進行定位和分解，將復雜的數量性狀分 解為簡單的孟德爾因子來進行研究。利用這種方法，近年來已經發現了許多控制谷粒大小 的QTLs。其中位于水稻第五染色體短臂上控制谷粒粒寬和粒重的主效QTL，(該QTL在本 發明中被命名為GS5)在許多研究中都能檢測到(林鴻宣等，1995，中國農業科學28 :1_7 ； Wan 等，2005，Theor. Appl. Genet. 110 1334-1346)。本實驗室利用珍汕 97/ 明恢 63 衍生的 F2_3和重組自交系群體也多次檢測到GS5區域存在一個主效QTL同時控制著谷粒粒寬和粒 重，并且可以揭示粒寬總變異的30%以上以及粒重總變異的10%以上(Yu等，1997，Proc. Natl. Acad. Sci. USA94 :9226_9231 ；Li 等，2000，Theor. Appl. Genet. 101 :248_254 ；Tan 等， 2000, Theor. Appl. Genet. 101 823-829 ；Xing 等，2001, Acta. Bot. Sin. 43 721-726 ；Xing 等，2002，Theor. Appl. Genet. 105 :248_257 ；Hua 等，2002，Genetics 162 :1885_1895)。這 些結果表明GS5基因可以在不同的遺傳背景以及不同環境下都能穩定表達，因此GS5對于 水稻產量和品種性狀的改良具有巨大的應用潛力和前景，對GS5基因進行克隆可以為水稻 的產量和品質育種提供新的重要的基因資源。在遺傳上，QTL與控制質量性狀的基因一樣會通過遺傳重組進行分離，差異只是 遺傳效應的大小方面，因此QTL同樣可以進行精細定位。但在初級群體中QTL與其它許多 非QTL位點一起同時發生分離，這些非QTL位點和環境因素一樣都會對QTL的表型性狀產 生極大的干擾作用。因此，在利用初級群體進行QTL定位時，QTL的置信區間通常在IOcM 以上(Darvasi 等，1992，Theor. Appl. Genet. 85 :353_359)，很難確定檢測到的一個主效QTL 到底是一個還是多個微效 QTL(Yano and Sasaki, 1997, Plant MolecularBiology 35 145-153)。因此有必要在初級定位的基礎上，對QTL進行高分辨率的精細定位(< IcM)。通 常，用于QTL精細定位的最好辦法就是構建含有目標QTL的染色體片段替代系(Chromosome segmentsubstitution line, CSSL)或近等基因系(Nearly isogenic line, NIL)等次級 定位群體(Secondary population)，使群體中只有單個的QTL位點發生分離，極大限度地 減少了個體間由于遺傳背景和環境不同造成的對目標性狀產生的干擾，使該位點表現為簡 單的孟德爾因子遺傳，從遺傳和統計上為QTL的精細定位創造便利條件。這種方法已經在 許多QTL的精細定位和基因克隆研究中發揮了重要的作用(Yano等，2000，PlantCell, 12 2473-2484 ;Frary等，2000，Science 289:85-88)。這些方法為采用圖位克隆的策略分離、 克隆GS5的基因提供了依據。本發明利用圖位克隆的方法分離克隆一個控制水稻谷粒粒寬和粒重的主效基因 GS5，為水稻的產量和品質育種提供新的基因資源，也為作物的進化研究提供線索。

發明內容
本發明的目的是從水稻中分離克隆一個同時控制谷粒粒寬和粒重的主效基因的 完整編碼區段DNA片段，利用這個基因改良水稻產量和品質的能力。申請人將克隆的這個 基因命名為GS5。本發明涉及分離和應用一個水稻粒形和千粒重的基因GS5，其中，所述片 段如序列表SEQ ID N0:1-6所示，或者基本上相當于SEQ ID NO 1_6所示的高度同源DNA 序列。具體地，本發明分離克隆的基因或等位基因以及調控上述基因或等位基因的啟動 子的核苷酸序列的信息如下所示一種控制水稻谷粒粒寬和粒重性狀的主效基因GS5，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1 所示。上述主效基因GS5的編碼序列如序列表SEQ ID NO 1中第2001-3449位對應的核 苷酸所示。與此同時，申請人得到一種控制水稻谷粒粒寬和粒重性狀的主效基因GS5的等位 基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:3所示。上述等位基因的編碼序列如序列表SEQ ID NO :3中第2004-3446位對應的核苷酸 所示。其中調控主效基因GS5的啟動子，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1中 1-1834位對應的核苷酸所示。其中調控主效基因GS5的等位基因的啟動子，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 3中1-1837位對應的核苷酸所示。本發明從珍汕97B和H94組合衍生的雙單倍體群體里選擇含有GS5基因且55% 遺傳背景與珍汕97B —致的材料，與珍汕97B回交三代，自交，構建GS5的近等基因系(圖 2)。利用近等基因系群體分析，發現該基因對粒寬和粒重都有很大的效應(表1)，后代測驗 表明，該基因呈現孟德爾基因分離比(圖3)。利用GS5近等基因系的遺傳大群體和圖位克 隆的方法，將GS5精細定位到8. Okb的染色體區段內(圖4)，然后結合該區段內的一個全長 cDNA的序列信息，對GS5的基因結構和編碼的蛋白質產物進行預測和分析，發現該基因包
4含10個外顯子，共編碼481個氨基酸，通過生物信息學技術預測該蛋白質具有PF00450保 守結構域。Real-Time PCR表達分析發現，該基因全生育期在各個組織表達，并且在穎殼胚 乳中寬粒品種(珍汕97B)比小粒(H94)的表達量高(圖5)。預測表達量起重要作用，于是 利用RT-PCR獲得H94的cDNA陽性克隆，亞克隆后，進行轉基因超表達驗證，將該基因轉入 水稻寬粒品種中花11中，轉基因TO代陽性超表達單株均表現出更寬的粒形(圖7)，并且 其Tl代共分離檢測發現，粒寬和表達量正相關(表2)。此外，利用水稻兩個大粒品種(珍 汕97和特青)和兩個小粒品種(H94和明恢63)進行比較測序，發現在3. 9kb的啟動子和 cDNA范圍內大小粒品種間存在22個共同的SNP和InDel差異，其中18個突變位于啟動子 區，4個突變位于編碼區的第1、第2和第9個外顯子，導致了 5個氨基酸替換(圖8)。由于 超表達窄粒的等位基因可以使寬粒變得更寬，所以編碼區的5個氨基酸替換不是等位基因 變異的原因，進而說明了啟動子區的變異是導致表達量變化的原因，進而導致粒寬變異，同 時說明GS5是一個正調控種子大小和粒重的基因。本發明的優點在于(1)本發明首次在水稻中克隆了一個對粒寬和粒重具有很大正調控效應的基因， 為水稻等禾谷類作物的高產優質育種提供了新的基因資源，也為其它作物中克隆相關基因 提供了技術借鑒；(2)本發明中克隆的基因也可以為水稻等禾谷類作物以及油菜等雙子葉作物的分 子進化研究提供證據。


序列表SEQ ID NO 1顯示的是本發明分離克隆的來源珍汕97B的GS5等位基因的 DNA序列(其中包含其啟動子序列、5，UTR、不包含內含子的⑶S、3，UTR)。序列表SEQ ID NO :2顯示的是本發明分離克隆的來源珍汕97B的GS5蛋白的氨基酸序列。序列表SEQ ID NO 3顯示的是本發明分離克隆的來源H94的GS5等位基因的DNA序列(其中包含其啟動 子序列、5，UTR、不包含內含子的CDS、3，UTR)。序列表SEQID NO :4顯示的是本發明分離克 隆的來源H94的GS5蛋白的氨基酸序列。圖1.是本發明的技術流程圖。圖2.是本發明的近等基因系構建流程圖。回交時，以珍汕97作為母本。圖3. BC3F2隨機群體中谷粒粒寬的頻率分布。圖中黃色、灰色和白色棒分別表示 GS5位點珍汕97基因型，雜合基因型和H94基因型，GS5的三種基因型是通過分子標記檢測 得到的。圖4.是本發明的近等基因系的粒型表現以及GS5基因的圖位克隆。標記間的數 字代表各標記與GS5位點間發生的重組次數。圖5.GS5基因在水稻全生育期不同組織中表達水平示意圖。使用材料是 NIL(ZS97)和NIL(H94)GS5基因純合材料。圖6.是本發明的轉基因所用的功能性載體圖PCAMBIA1301骨架。圖7.是本發明的轉基因單株的粒型和粒重的表現和表型統計分析。A圖左為中花 11陰性單株粒型，右為陽性單株粒型；B圖為陰性與陽性轉基因單株的粒寬統計結果；C和 D圖為陰性與陽性轉基因單株的粒寬和千粒重統計結果。
圖8.本發明克隆的GS5基因的結構示意圖和其自然變異分析。黑色的方框代表 外顯子，細線代表內含子，“ATG”和“TGA”分別是翻譯起始密碼和終止密碼，ATG前的粗線 代表2000bp的啟動子，大小粒型形品種間的22個SNP和InDel變異位于GS5基因的啟動 子和編碼區(SNP替換均用相應的堿基代表，InDel缺失均用相應的圓點代表)，編碼區有5 個氨基酸變異，內含子有4個SNP變異。
具體實施例方式根據圖1的技術路線，從水稻品種珍汕97B(江西省農業科學院顏龍安院士選育和 惠贈)和H94(上海市農業生物基因中心的羅利軍研究員惠贈)組合衍生的雙單倍體群體 里選擇含有GS5基因且55 %遺傳背景與珍汕97B —致的家系(DH27)，與珍汕97B雜交，珍汕 97B為輪回親本，連續回交3代，自交，構建了水稻GS5基因的近等基因系BC3F1。利用一個含 有288個BC3F2單株的隨機群體對GS5進行了定位和遺傳效應分析；利用目標區間公共SSR 標記對來自于9639個單株的大遺傳群體篩選重組單株，最終將GS5定位到C62和C63區間， 兩者物理距離為8. Okb (圖4)；然后結合該區段內的一個全長cDNA的序列信息，對GS5的基 因結構和編碼的蛋白質產物進行預測和分析，發現該基因包含10個外顯子，共編碼481個 氨基酸，通過生物信息學技術預測該蛋白質具有PF00450保守結構域。Real-Time PCR表達 分析發現，該基因全生育期在各個組織表達，并且在穎殼胚乳中寬粒品種(珍汕97B)比小 粒(H94)的表達量高。預測表達量起重要作用，于是利用RT-PCR獲得H94的cDNA陽性克 隆，亞克隆后，進行轉基因超表達驗證，將該基因轉入水稻寬粒品種中花11中，轉基因Ttl代 陽性超表達單株均表現出寬的粒形(圖7)，并且其T1代共分離檢測發現，粒寬和表達量正 相關。此外，利用水稻兩個大粒品種(珍汕97B和特青)和兩個小粒品種(H94和明恢63) 進行比較測序，發現在3. 9kb的啟動子和cDNA范圍內大小粒品種間存在22個共同的SNP 和InDel差異，其中18個突變位于啟動子區，4個突變位于編碼區的第1、第2和第9個外 顯子，導致了 5個氨基酸替換(圖8)。由于超表達窄粒的等位基因可以使寬粒變得更寬，所 以編碼區的5個氨基酸替換不是等位基因變異的原因，進而說明了啟動子區的變異是導致 表達量變化的原因，進而導致粒寬變異。以下實施例進一步定義本發明，并描述了分離克隆GS5基因，遺傳轉化，比較測序 驗證GS5等位基因之間序列差異的方法和該基因時空表達譜。根據以下的描述和這些實施 例，本領域技術人員可以確定本發明的基本特征，并且在不偏離本發明本質和范圍的情況 下，可以對本發明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。實施例1 構建GS5近等基因系1回交與選擇如附圖2所示，從寬粒水稻品種珍汕97B和窄粒品種H94組合衍生的雙單倍體群 體里選擇含有GS5基因且55%遺傳背景與珍汕97B —致的家系，與珍汕97B雜交，珍汕97B 為輪回親本，連續回交3代，在BC1F1以及BC2F1代對GS5只進行正向選擇，即選擇目標區段 為珍汕97B/H94雜合基因型的單株用于下一輪的回交。目標區段參照前人的QTL定位結 果確定在兩個 SSR(Simple Sequence Repeat)標記 RM593 和 RM574(參見(http //www, gramene. org/)所界定的區間內。存BC3F1代，除進行正向洗擇外，還對目標區段以外的遺 傳背景進行掃描，從中選擇遺傳背景與珍汕97B最為相近的單株的后代(BC3F2，NIL (H94)用于后續的實驗。該近等基因系材料NIL (H94)于2010年5月27日送交湖北省武漢市武漢 大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，其保藏編號為CCTCC P201007。2微衛星標記基因型鑒定方法(SSR技術)PCR標準程序參見參見J.薩姆布魯克等，2002,分子克隆實驗指南，第三版，金冬 雁等(譯)，科學出版社介紹的方法。PCR 采用 20 μ 1 的反應體系，包含20-50ng DNA 模板，IOmM Tris-HCl, 50mM KCl, 0. 1% Triton X-100,1. 8mM MgCl2,0. ImM dNTP，0.2ym 引物(如上所述的 RM593 和 RM574 的引物，參見 http ://www. gramene. org/)禾口 IU Taq DNA polymerase。PCR 擴增的條件為 94°C預變性 4min ;94°C lmin，55°C lmin，72°C lmin，34 個循環；72°C延伸 IOmin0 PCR 產物 在6%的聚丙烯酰胺膠上分離后進行銀染(Bassam等，1991，Anal. Biochem. 196 80-83)。實施例2 :GS5的精細定位和圖位克隆1粒寬的表型測量谷粒自然干燥后置于室溫下至少放置3個月以上以保證谷粒的干燥和各株系間 含水量的相對一致。從每單株中隨機選取飽滿谷粒10粒，按照同一個方向肩并肩，不重疊、 不留隙的方式，緊靠擺成一行，用游標卡尺讀出寬度，求其平均值即為谷粒寬度。谷粒千粒 重根據隨機挑選的200粒飽滿谷粒的重量來估算。從BC3F1單株衍生的BC3F2群體中隨機挑選了 288單株構成一個隨機群體。考察珍 汕97B、H94以及隨機群體中每個單株的谷粒寬度等性狀，并用兩端分子標記RM593和RM574 確定各株基因型，結果發現該性狀在兩親本間都具有顯著差異。在隨機群體中，谷粒寬度表 現為半不連續分布(圖3)。以3. 14mm的谷粒寬度為分界線，可分為兩類，即大粒和小粒類 型(表1和圖3)，且對粒重和單株產量均有顯著影響。本發明中將寬而重的谷粒稱之為大 粒，另外一種短而輕的谷粒類型稱之為小粒。卡方測驗表明三種類型符合單個孟德爾因子 的1 2 1分離比窄粒寬粒=222 66，X2 = 0. 51 < X2qq5i1),表明在此BC3F2群體中， 粒大小是由一個主效基因控制的，并且小粒等位基因對大粒等位基因表現為半顯性作用。表1近等基因系中GS5的對產量性狀的影響分析 2分子標記的開發本發明中所用到的SSR標記信息全部來自于Gramene網站數據庫(//www. gramene. org/).此外，還根據網上公布的粳稻品種Nipponbare的基因組序列(// rgp. dna. affrc. ro. jp)以及秈稻品種 93-11 的基因組序列(http //rise, genomics, org. cn/)設計和鑒定多態性標記，設計原則是在兩者間有2-6bp缺失的、PCR片段大約 有100-200bp長度、目標片段上平均分布了，用設計的引物擴增珍汕97B和H94模板DNA， 4% PAGE膠電泳檢測，最終設計了 13對在珍汕97B和H94間具有多態性的Indel (Insert/Deletion)標記，用于GS5的精細定位分析。這些標記的序列信息見表4。3重組單株的后代測驗分析和GS5的精細定位及候選基因確定為進一步縮小GS5的定位區間，從9639株由BC3F1單株衍生的BC3F2大群體中挑選 出重組單株。首先用SSR標記RM593和RM574標記進行篩選，從4374個單株中共找到94個重 組單株，這些單株經過后代測驗確認其上一代的表型每個重組單株種植24株后代作為一 個家系，性狀分離的家系說明上一代表型是雜合的，后代性狀不分離且是高值性狀的說明 上一代表型是來至珍汕97B純合的，低值說明上一代表型是來至H94純合的。然后，利用發 展的13個InDel標記分析這94個重組單株，結果發現在RM574和GS5間存在4個重組單 株，在RM593和GS5存在90個重組單株，特別是在C53和GS5間只發生1次重組，在C62和 GS5間只存在2次重組，而且在C53和C62之間還存在ClO和C23兩個標記與GS5共分離 (圖4)。因此，GS5最終被定位于C53和C62間，該區間對應于Nipponbare和93-11的基因 組序列上的約8. Okb的物理范圍(圖4)。在C53和C62間(由申請人自己設計，參見表4) 所界定的8. Ο-kb范圍內找到一條全長cDNA，編號為AK106800，來自于日本晴的小花組織， 本發明克隆的GS5基因的cDNA序列全長1449bp，與8. Ο-kb范圍內的0. 3kb至6. 9kb區段 完全匹配，因此該cDNA是GS5的唯一可靠候選基因。實施例3 :GS5的轉基因互補試驗1 GS5轉基因技術路線Real-Time PCR表達譜分析發現，該基因全生育期在各個組織表達，并且在穎殼胚 乳中寬粒品種(珍汕97B)比小粒(H94)的表達量高(圖5)，預測表達量起重要作用，于是 根據預測的候選基因全長cDNA序列，設計一對帶有限制性核酸內切酶BamHI和PstI接頭 的RT-PCR特異引物(表4)擴增H94的cDNA片段，連接到TA克隆Promega T載體上，挑選 出含有候選基因的無突變的正確克隆，利用限制性核酸內切酶BamHI and PstI酶切陽性 克隆，進行亞克隆，再連接到雙元超表達載體PCAMBIA1301S) (pCAMBIA1301多克隆位點旁 加一 35S強啟動子)上；另外，用同樣的方法將珍汕97B啟動子融合H94編碼區的轉基因 (ZpHc)連接到雙元超表達載體pCAMBIA1301(圖6)上。采用轉基因的方法，將得到的正確 克隆的質粒通過農桿菌介導的水稻遺傳轉化體系導入到水稻品種中花11中，經過誘導、繼 代、侵染、共培養、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、練苗移栽，得到轉基因的水稻小 植株。農桿菌介導的水稻(粳稻亞種)遺傳轉化體系主要應用Hiei等人報道的方法(參見 Efficient transformation of rice, Oryza sativaL，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA,1994, PlantJournal 6 271-282) 基礎上進行優化。本發明的遺傳轉化的主要步驟、培養基及其配制的方法如下所述(1)試劑和溶液縮寫本發明中培養基所用到的植物激素的縮寫表示如下 6-BA(6-BenzyIaminoPurine,6-芐基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧節青霉素)； KT (Kinetin,激動素) ；NAA (Napthalene acetic acid, ΜΖλΜ) ； IAA(Indole-3-acetic acid,吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4- 二氯苯氧乙酸)； AS(Acetosringone, ZilitT#Sll ) ；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate,水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO (Dimethyl Sulfoxide，二甲基亞砜)；N6max (N6 大量元素 成分溶液)；N6mix (N6微量元素成分溶液)；MSmax (MS大量元素成分溶液)；MSmix (MS微量 元素成分溶液)鉬酸鈉(Na2Mo04· 2H20)硫酸銅(CuSO4· 5H20)氯化鈷(CoCl2· 6H20)
0. 025 克 0. 0025 克 0. 0025 克將上述試劑在室溫下溶解，并用蒸餾水定容至1000毫升，室溫儲存。7)2，4_D貯存液(1毫克/毫升)的配制秤取2，4_D 100毫克，用1毫升IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶 解完全后定容至100毫升，于室溫下保存。8) 6-BA貯存液(1毫克/毫升)的配制秤取6-BA 100毫克，用1毫升IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶 解完全后定容至100毫升，室溫保存。9)萘乙酸(NAA)貯存液(1毫克/毫升)的配制秤取NAA 100毫克，用1毫升IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解 完全后定容至100毫升，4°c避光保存。10)吲哚乙酸(IAA)貯存液(1毫克/毫升)的配制秤取IAA 100毫克，用1毫升IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解 完全后定容至100毫升，4°c避光保存。11)葡萄糖貯存液(0. 5克/毫升)的配制秤取葡萄糖125克，然后用蒸餾水溶解定容至250毫升，滅菌后4°C保存備用。12) AS貯存液的配制秤取AS 0. 392克，加入DMSO 10毫升溶解，分裝至1. 5毫升離心管內，_20°C保存13) IN氫氧化鉀貯存液配制秤取氫氧化鉀5. 6克，用蒸餾水溶解定容至100毫升，室溫保存備用。(3)用于水稻遺傳轉化的培養基配方1)誘導培養基N6max母液(取已經制備好的IOX濃縮液，下同)100毫升N6mix母液(取已經制備好的100X濃縮液，下同)10毫升Fe2+EDTA貯存液(取已經制備好的100X濃縮液，下同)10毫升維生素貯存液(取已經制備好的100X濃縮液，下同)10毫升2，4_D貯存液(取上述制備好的)2. 5毫升脯氨酸(Proline)0. 3 克CH0.6 克蔗糖(Sucrose)30 克Phytagel(分開加，需加熱溶解，下同)3克加蒸餾水至900毫升，IN氫氧化鉀調節pH值到5. 9，煮沸并定容至1000毫升，分 裝到50毫升三角瓶(30毫升/瓶)，封口后按常規方法滅菌(例如121°C下滅菌15分鐘， 下述的培養基滅菌方法與本培養基的滅菌方法相同)。2)繼代培養基N6max 母液(IOX)100 毫升
N6mix 母液(100X)10毫升
Fe2+EDTA 貯存液(100X)10 1■升
維生素貯存液(100X)10 _升
2，4-D貯存液2. 0 _升
脯氨酸0· 5克
CH0.6克
蔗糖30克
Phytagel3克0128] 加蒸餾水至900毫升，IN氫氧化鉀調節pH值到5. 9，煮沸并定容至1000毫升，分 裝到50毫升三角瓶(30毫升/瓶)，封口，按上述方法滅菌。
0129]
0130]
0131]
0132]
0133]
0134]
0135]
0136]
0137]
0138]
0139]
3)預培養基(粳稻可以不做這-
涉) 12. 5毫升 1. 25毫升 2. 5毫升 2. 5毫升 0. 75毫升
CH0. 15 克
蔗糖5克
瓊脂粉(Agar)1. 75克
加蒸餾水至250毫升，IN氫氧化鉀調節pH值到5. 6，封口，按上述方法滅菌。 使用前加熱溶解培養基并加入5毫升葡萄糖貯存液和250微升AS貯存液，分裝倒
N6fflax 母液(IOX) N6mix 母液(100X) Fe2+EDTA 貯存液(100X) 維生素貯存液(100X) 2，4-D貯存液
入培養皿中(25毫升/皿)。
0140]
0141]
0142]
0143]
0144]
4)懸浮培養基 N6fflax 母液(IOX) N6mix 母液(100X)
5毫升 0.5毫升 0.5毫升 1毫升 0. 2毫升 0. 08 克 2克
0148] 加蒸餾水至100毫升，調節pH值到5. 4，分裝到兩個100毫升的三角瓶中，封口，按 上述方法滅菌。
Fe2+EDTA 貯存液(100X) 維生素貯存液(100X)
0145]2，4_D 貯存液
0146]CH
0147]蔗糖
0149]
0150]
0151]
0152]
0153]
0154]
0155]
使用前加入1毫升無菌葡萄糖貯存液和100微升AS貯存液。 5)共培養基
N6fflax 母液(IOX) N6mix 母液(100X) Fe2+EDTA 貯存液(100X) 維生素貯存液(100X) 2，4-D貯存液
12. 5毫升 1. 25毫升 2. 5毫升 2. 5毫升 0. 75毫升
110156]CH0.2 克
0157]蔗糖5克
0158]瓊脂粉1.75克
0159]加蒸餾水至250毫升，IN氫氧化鉀調節pH值到5. 6，封口，按上述方法滅菌。
0160]使用前加熱溶解培養基并加入5毫升葡萄糖貯存液和250微升AS貯存液，分裝倒
入培養皿中(25毫升/每皿)。
6)篩選培養基
N6fflax 母液(IOX)25毫升
N6mix 母液(100X)2. 5毫升
Fe2+EDTA 貯存液(100X)2. 5毫升
維生素貯存液(100X)2. 5毫升
2，4-D貯存液0. 625毫升
CH0. 15 克
蔗糖7. 5克
瓊脂粉1. 75 克
加蒸餾水至250毫升，調節pH值到6. 0，封口，按上述方法滅菌。
使用前溶解培養基，加入250微升HN (50毫克/毫升)和400微升CN (10克CN/36毫升水)分裝倒入培養皿中(25毫升,/皿)。(注第一次選擇培養基羧芐青霉素濃度為400毫克/升，第二次及以后選擇培養基羧芐青霉素濃度為250毫克/升)。
7)預分化培養基(粳稻可以不做這一步)
N6fflax 母液(IOX)25毫升
N6mix 母液(100X)2. 5毫升
Fe2+EDTA 貯存液(100X)2. 5毫升
維生素貯存液(100X)2. 5毫升
6-BA貯存液0.5毫升
KT貯存液0.5毫升
NAA貯存液50微升
IAA貯存液50微升
CH0. 15 克
蔗糖7. 5克
瓊脂粉1. 75 克
加蒸餾水至250毫升，IN氫氧化鉀調節pH值到5. 9，封口，按上述方法滅菌。
使用前溶解培養基，250微升HN (50毫克/毫升)250微升CN (250毫克/毫升)，分裝倒入培養皿中(25毫升/皿)。
8)分化培養基
N6fflax 母液(IOX)100毫升
N6mix 母液(100X)10毫升
Fe2+EDTA 貯存液(100X)10毫升
維生素貯存液(100X)10毫升
6-BA 貯存液KT貯存液NAA貯存液IAA貯存液CH
1克 30克 3克
0.2毫升 0.2毫升
2毫升 2毫升蔗糖Phytagel加蒸餾水至900毫升，IN氫氧化鉀調節pH值到6. 0。煮沸并用蒸餾水定容至1000毫升，分裝到100毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口， 按上述方法滅菌。9)生根培養基加蒸餾水至900毫升，用IN氫氧化鉀調節pH值到5. 8。煮沸并用蒸餾水定容至1000毫升，分裝到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述 方法滅菌。(4)農桿菌介導的遺傳轉化步驟3. 1愈傷誘導1)將成熟的中花11水稻種子去殼，然后依次用70%的乙醇處理1分鐘，0. 15%氯 化汞(HgCl2)種子表面消毒15分鐘；2)用滅菌水洗種子4-5次；3)將8-10粒種子放在誘導培養基上；4)將接種后的培養基置于黑暗處培養4-5周，溫度26士 1°C。3. 2愈傷繼代挑選亮黃色、緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于繼代培養基上黑暗下培養2周，溫 度 25 士 1°C。3. 3 預培養挑選緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于預培養基上黑暗下培養2周，溫度 26 士 1°C。3. 4農桿菌培養1)在帶有對應抗性選擇的LA培養基(LA培養基的配制參照J.薩姆布魯克等，分 子克隆實驗指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學出版社，2002，北京)上劃線預培養農桿菌 EHA105(該菌株來自CAMBIA公司公開使用的農桿菌菌株)兩大，溫度28°C ；2)將農桿菌轉移至懸浮培養基里，28°C搖床上培養2-3小時。3. 5農桿菌侵染1)將預培養的愈傷轉移至滅好菌的瓶子內；MSmax 母液(IOX)MSmix 母液(100X)Fe2+EDTA 貯存液(100X)維生素貯存液(100X)蔗糖Phytagel
50毫升 5毫升 5毫升 5毫升 20克 3克
2)調節農桿菌的懸浮液至0D6000. 8-1. 0 ；3)將愈傷在農桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；4)轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養基上培養3天，溫度 19-20 "C。3. 6愈傷洗滌和選擇培養1)滅菌水洗滌愈傷至看不見農桿菌；2)浸泡在含400毫克/L羧芐青霉素(CN)的滅菌水中搖30分鐘；3)轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；4)轉移愈傷至選擇培養基上選擇培養2-3次，每次2周至長出好的抗性愈傷。3. 7 分化1)將抗性愈傷轉移至預分化培養基上于黑暗處培養5-7天；2)轉移預分化培養的愈傷至分化培養基上，每瓶平均分布三個獨立的愈傷，光照 下培養5周-6周至長出大的苗子，溫度26°C。3. 8生根與煉苗1)剪掉分化時產生的老根；然后將其轉移至生根培養基中光照下培養2-3周至長出大的苗子后去掉封口膜 加部分自來水煉苗一周再移栽，溫度26°C。3. 9 移栽洗掉根上的殘留培養基，將具有良好根系的幼苗轉入溫室，同時在最初的幾天保 持水分濕潤，等長勢很壯再移栽至大田。本發明共獲得獨立轉基因Over-expression T0代水稻植株37株，包括18株陽性 單株和19株陰性單株。所獲得的T1代水稻植株以Z3-22家系為例；珍汕97啟動子融合 H94編碼區(ZpHc)獨立轉基因Ttl代水稻植株28株，包括18株陽性單株和10株陰性單株。 兩種轉基因水稻陽性和陰性植株的粒寬和粒重(圖7)有差異顯著(P < 0. 001)。根據轉 基因Ttl代陽性超表達單株均表現出更寬的粒形(圖6)，并且其T1代共分離檢測發現，粒寬 和表達量正相關(表2)，證明了該唯一的候選基因就是GS5 QTL.另外，珍汕97B啟動子融 合H94編碼區的轉基因和上述結果一致，均能增加粒寬和粒重這一表型(圖7)，互補成功， 該QTL基因被成功克隆，并且說明啟動子區是GS5遺傳變異的原因。由于該基因超標達使 得種子變大，說明GS5是一個粒形和粒重的正調控因子，這和其控制粒形的基因(GS3，GW2， qSW5)不同，它們多是負調控種子大小(Fan 等，2006，Theor. Appl. Genet. 112 :1164_1171 ； Takano-Kai ^,2009, Genetics 182 1323-34 ；Song φ,2007, Nature Genetics 39 623-630 ；Shomura 等，2008，Nature Genetics 40 1023-1028 ；Weng 等，2008，CellRes. 18 1199-209)。同時也證明了這個基因可以通過遺傳轉化來改良水稻品種。2 GS5功能預測根據 InterProScan(http//www. ebi. ac. uk/InterProScan/)對蛋白質結構進行 預測，GS5基因(H94)編碼的蛋白質由480個氨基酸組成，包含一個大的保守的PF00450 結構域。利用BLASTp對GS5基因編碼的由480個氨基酸組成的蛋白質結構進行搜索，發 現該基因編碼一絲氨酸羧肽酶，屬于SlO蛋白家族，，以前的研究表明該酶家族參與種子的 萌發和發育、植株的生長與發育、植株次級代謝以及植物的生物和非生物脅迫反應(Degan等，1994，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :8209_8213 ；Washio 等，1994，Plant Physiol. 105 1275-1280 ；Li 等，2001，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98,5916-5921 ；Shirley 等，2003， J. Biol. Chem. 278 19870-19877 ；Mehta 等，1996，Plant Physiol. 110 ；883-892)。實施例5 比較測序確定GS5等位基因間的自然變異1序列測定兩個大粒品種(珍汕97B和特青)和兩個小粒品種(明恢63和H94)進行目標 區段的測序。利用10對PCR產物相互部分重疊的引物(表3)，采用高保真度的LA-Taq和 rTag (購自日本TakaRa公司)從這些品種的基因組中進行PCR擴增，然后按照美國Perkin Elmer公司的測序試劑盒(Big Dye Kit)進行PCR測序。使用Sequencher 4. 5軟件(美 國Gene Codes Corporation)拼接序列。該兩個等位基因的DNA序列如SEQ ID N0:1(珍 汕 97B)和 SEQ ID NO :3(H94)所示。表2GS5轉基因T1代共分離檢測分析 2發生自然變異的序列比較目標區段間的序列比較分析在兩個大粒品種(珍汕97B和特青)和兩個小粒品種 (明恢63和H94)間進行(圖8)，發現在3. 9kb的啟動子和cDNA范圍內大小粒品種間存在 20個共同的SNP和InDel差異，其中18個突變位于啟動子區，4個突變位于編碼區的第1、 第2和第9個外顯子，導致了 5個氨基酸變異(圖8)，還有4個突變位于內含子區。由于超 表達窄粒的等位基因可以使寬粒變得更寬，所以編碼區的5個氨基酸替換不是等位基因變 異的原因，ZcHp轉化片段進而說明了啟動子區的變異是導致表達量變化的原因，進而導致 粒寬和千粒重的變異。表3用于本發明比較測序的引物 表4用于本發明圖位克隆和基因功能分析的引物
權利要求
一種控制水稻谷粒粒寬和粒重性狀的主效基因GS5，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。
2.如權利要求1所述的基因GS5，它的編碼序列如序列表SEQID NO 1中第2001-3449 位對應的核苷酸所示。
3.如權利要求1所述的基因GS5的等位基因，它的核苷酸序列如序列表SEQID NO 3 所示。
4.如權利要求3所述的等位基因，它的編碼序列如序列表SEQID NO :3中第2004-3446 位對應的核苷酸所示。
5.適用于權利要求1所述基因的啟動子，它的核苷酸序列如序列表SEQID N0:1中 1-1834位對應的核苷酸所示。
6.適用于權利要求3所述基因的啟動子，它的核苷酸序列如序列表SEQID N0:3中 1-1837位對應的核苷酸所示。
7.權利要求1或2所述的基因在作物遺傳改良中的應用。
8.權利要求3或4所述的基因在作物遺傳改良中的應用。
9.權利要求5所述的啟動子在作物遺傳改良中的應用。
10.權利要求6所述的啟動子在作物遺傳改良中的應用。
全文摘要
本發明屬于植物基因工程技術領域。公開了分離克隆的控制水稻谷粒粒寬和粒重性狀的主效基因GS5，以及它的等位基因的DNA序列，所述序列如SEQ ID NO1(珍汕97B)和SEQ ID NO3(H94)所示，包含10個外顯子。它們的氨基酸序列如SEQ ID NO2和SEQ IDNO4所示。利用水稻兩個大粒品種和兩個小粒品種比較測序，發現在約6.1kb范圍內大、小粒品種間存在22個共同的堿基差異，其中18個突變位于啟動子區，4個突變位于編碼區，導致5個氨基酸變化。利用轉基因技術獲得了轉GS5基因的水稻植株，轉基因植株都表現出比對照粒寬和粒重顯著提高。這些性狀變化與珍汕97的GS5近等基因系兩基因型的表現非常吻合。本發明還公開了近等基因系選育、基因克隆和轉基因的方法即應用。
文檔編號A01H5/00GK101880671SQ201010188458
公開日2010年11月10日 申請日期2010年5月27日 優先權日2010年5月27日
發明者何予卿, 張啟發, 李一博, 范楚川, 邢永忠 申請人:華中農業大學