專利名稱：植物種子轉化技術的制作方法
技術領域：
本發明專利屬于生物技術領域。

背景技術：
外源DNA進入植物基因組，目前主要有愈傷組織的農桿菌介導和基因槍法等技術。但是，受再生體系難、遺傳背景差異導致轉化率低下等因素，它們仍然處在不斷的完善之中。物理手段的使用(如超聲波、負壓法、脈沖電泳、重離子輻照和γ射線輻照等)也同樣存在使用材料有限、轉化率低等主要問題。其中與本發明相近的γ射線輻照，因為輻照材料為愈傷組織，要考慮到再生體系、輻照時期和污染等問題，實際操作受到了很大限制。因此面對許多類型植物的轉化技術，還需要進一步的不斷改進。


發明內容
本發明專利的主要內容與技術特征是將在γ射線輻照后的植物種子(劑量為0.01-10Gy，劑量率為0.1-2Gy/h)，轉入攜帶目的基因質粒的農桿菌或外源DNA(表達質粒)中浸泡5-300min，然后，在選擇性基質中萌發；鑒定、篩選GUS基因瞬間表達的幼苗；利用陽性幼苗可以用作兩種后續的處理一是作為外植體，在選擇培養基上進行組織培養獲得轉基因再生植株；二是將陽性幼苗直接移栽盆內或田間，但其后，要每各3-5天，在各株的所有莖尖處點滴50-200μl的相關抗生素(濃度為50-250mg/l)，直至花芽的形成；收獲種子進行外源基因鑒定，陽性材料進入下一代種植。
主要用途 本發明在多種植物，特別是在再生體系較難(如單子葉植物)、愈傷組織-農桿菌介導效果差(如十字花科的部分物種等)和轉化效率低下等物種的轉化上將發揮重要的作用，大大提高轉化效率。本項發明在農業生物技術及其應用基礎、植物基因組研究等方面有較大的應用價值。

具體實施例方式 實例1 輻照種子的農桿菌介導gus基因的瞬間表達 1.1材料和方法 1.1.1材料 物種取飽滿、完好的白菜、小麥、南瓜、芹菜、香菜、玉米、粳稻、秈稻、黑麥、菠菜、莧菜和豇豆等種子；每種取500粒左右供實驗使用。
農桿菌及質粒為LBA4404；攜帶的質粒為pKUC(浙江大學舒慶堯教授實驗室)；含抗生素選擇基因為卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因；報告基因為GUS基因(含內含子序列)；它們的啟動子均為CaMV 35S啟動子。
1.1.2方法 種子輻照用0.01-10Gy劑量(劑量率為0.1-2Gy/h)的γ射線輻照植物種子。
搖菌農桿菌在LB液體培養基(其中含50mg/l卡那霉素)25℃條件下，120rpm搖床培養。指數增長的中后期，菌液OD550值為0.20-0.85時用做以下實驗。
浸泡在農桿菌懸浮液中分別加入輻照處理和未處理的種子，在15-35℃條件下，浸泡5-300min。
萌發浸泡種子分別點播在含沙土或珍珠巖的盆內；期間，噴灑適量的無菌水(含50mg/L卡那霉素)以保濕潤。
gus瞬間表達鑒定種子萌發，幼苗長到3cm高以上時(7-25天內)，剪下植株的少許葉片或根，切成0.5×0.5cm2大小或0.5cm長的小塊轉入GUS染色液中；在遮光條件下染色6-24小時，設置已知未轉化材料為陰性對照和轉化材料為陽性對照；染色后，用95％乙醇去葉綠素等物質，直至透明；出現蘭色為陽性，否則為陰性，由于GUS基因含插內含子，因此可以排除由農桿菌自身造成的假陽性。染色液成分含0.1M K/NaPO4緩沖液，pH7.0；10mM EDTA-Na2；5mM K3[Fe(CN)6]；5mM K4[Fe(CN)6]·3H2O；0.1％(v/v)Triton X-100；1ml/mg X-Gluc；抽濾滅菌，-20℃保存。
gus基因表達率的計算。陽性表達率(％)＝GUS藍色反應株數/浸泡后萌發的總株數。
1.2結果與分析 由表1可知，各個物種的未輻照或未經農桿菌介導的植株幼苗均沒有檢測出GUS反應陽性，表明實驗材料存在的內源gus基因及其表達被排除。而經過輻照處理的種子，均表現了高低不等的陽性表達率，有的高達80％以上，這在發明者所能查閱的文獻中，還沒有過報道。
表1 輻照種子農桿菌介導后幼苗的gus基因瞬間表達率(％) 1.3結論 來源不同、遺傳背景各異的植物種子，通過適宜的γ射線處理，在農桿菌懸浮液中，可以獲得很高的外源DNA瞬間表達(如GUS陽性)的轉化體。
實例2 輻照種子的外源質粒(gus基因)轉化表現 2.1材料和方法 2.1.1材料 物種取飽滿、完好的小麥、番茄、白菜和香椿等種子；每種取500粒左右供實驗使用。
農桿菌及質粒為LBA4404；攜帶的質粒為pKUC(來自浙江大學舒慶堯教授實驗室)；含抗生素選擇基因為卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因；報告基因為GUS基因(含內含子序列)；它們的啟動子均為CaMV 35S啟動子。
2.1.2方法 種子輻照用0.01-10Gy劑量(劑量率為0.1-2Gy/h)的γ射線輻照植物種子。
搖菌農桿菌在LB液體培養基(其中含50mg/l卡那霉素)25℃條件下，120rpm搖床培養。指數增長的中后期，菌液OD550值為0.20-0.85時用于質粒的提取。
質粒的提取堿裂解法裂解農桿菌；異丙醇-乙醇粗提質粒；PEG沉淀法純化質粒；溶于TE緩沖液(pH8.0)，-20℃保存。
浸泡用TE緩沖液將質粒稀釋到20-350ng/ml濃度，然后分別加入輻照處理和未處理的種子，在15-35℃條件下，浸泡5-300min。
萌發浸泡種子分別點播在含珍珠巖的盆內；期間，噴灑適量的無菌水(含50mg/l卡那霉素)以保濕潤。
gus瞬間表達鑒定種子萌發，幼苗長到3cm高以上時(7-25天內)，剪下植株的少許葉片或根，切成0.5×0.5cm2大小或0.5cm長的小塊轉入GUS染色液中；在遮光條件下染色6-24小時，設置已知未轉化材料為陰性對照和轉化材料為陽性對照；染色后，用95％乙醇去葉綠素等物質，直至透明；出現蘭色為陽性，否則為陰性，由于GUS基因含內含子，農桿菌造成的假陽性可以排除。染色液成分含0.1M K/NaPO4緩沖液，pH7.0；10mM EDTA-Na2；5mM K3[Fe(CN)6]；5mM K4[Fe(CN)6]·3H3O；0.1％(v/v)TritonX-100；1ml/mg X-Gluc；抽濾滅菌，-20℃保存。
gus基因表達率的計算。表達率(％)＝GUS藍色反應株數/浸泡后萌發的總株數。
2.2結果與分析 由表2可知，小麥、番茄、白菜和香椿的種子在未輻照或未經質粒轉化的植株幼苗均沒有檢測出GUS反應陽性。而經過輻照處理的種子，在質粒轉化下也表現了高低不等的陽性表達率，最低香椿也高達30％多。
表2 輻照種子質粒介導后幼苗的gus基因瞬間表達率(％) 2.3結論 同實例1輻照種子經過農桿菌介導的結果一樣，輻照的種子在質粒直接轉化下，也可以獲得外源基因(如gus基因)瞬間表達率較高的轉化體。
實例3 瞬間表達的幼苗盆栽-卡那霉素選擇獲得T0和T1代植株的表現 3.1材料和方法 3.1.1材料 材料來源取實例2的小麥、番茄、白菜和香椿等幼苗，經過GUS染色，選取蘭色陽性植株用于移栽。
3.1.2方法 盆內移栽陽性植株移栽在含有肥沃沙土的盆內。每間隔3-5天，在所有莖尖上滴50-200μl的卡那霉素(濃度為50-250mg/L)，直至花芽的形成。
植株GUS染色的鑒定苗期GUS陽性植株在花期剪取頂部幼莖，一部分用于GUS染色，另一部分用于DNA提取，進行PCR鑒定；其株收獲的種子進行無菌水發芽(T1代)，隨機取一株根尖進行GUS染色，統計陽性表達率(＝再次GUS染色陽性株數/開始陽性反應取樣株數)，染色方法見實例1；陽性材料進入下一輪種植。
植株gus基因PCR的鑒定T0代的幼莖部分(見GUS染色)；T1代的材料為測定T1代GUS反應的同一植株的幼葉；CTAB法提取植物全基因組DNA；按文獻設計gus基因引物；含gus基因的質粒為陽性對照，未轉化植株為陰性對照進行PCR擴增；瓊脂糖凝膠電泳鑒定，有特異帶為陽性植株。
3.2結果與分析 由表3可知，從質粒介導而來的GUS染色陽性幼苗，移栽到盆內，一部分不做任何處理，花期檢測GUS染色反應和PCR鑒定，兩者陽性率急劇下降，其中香椿為0；另外一部分，為卡那霉素處理，所有實驗材料仍然維持較高的陽性率，表明保持選擇壓力是必要的。對花期GUS陽性的植株(不論是否經過卡那霉素處理)，收獲種子，經萌發，測定幼苗GUS反應和進行PCR鑒定，兩者陽性率普遍增高。
表3 GUs陽性幼苗盆栽后T0和T1代GUS染色陽性表達率(％)和PCR陽性率(％) 3.3結論 輻照種子經農桿菌介導或質粒直接轉化，瞬間表達陽性的植株只有在適當的選擇壓力下，其后期和后代可以獲得陽性率較高的轉化體。
實例4 gus基因瞬間表達的番茄和白菜幼苗經過組織培養獲得再生植株 4.1材料和方法 4.1.1材料 材料來源取實例2的番茄、白菜和香椿等幼苗，經過幼(子)葉局部和莖尖下段GUS染色測定，選取陽性反應的幼葉和莖尖余下部分為外質體用于組織培養。
4.1.2方法 番茄的組織培養以陽性反應的番茄幼葉余下部分為外質體(12天內)，用70％的乙醇洗45s，無菌水清洗3次；再用3％次氯酸鈉浸泡15min，無菌水清洗3-5次；最后用滅菌濾紙吸干其浮水后轉入MS+1.0mg/lNAA+0.1mg/l 6-BA+50mg/l卡那霉素培養基誘導形成愈傷組織；兩周一次繼代培養2-3次，愈傷組織轉入MS+0.2mg/l IAA+2.0mg/l 6-BA培養基誘導幼苗分化；分化幼苗轉入MS+1.0mg/l 6-BA+1.0mg/l IAA培養基誘導生根；3-5天練苗后，移栽盆內。
白菜的組織培養以陽性反應的白菜子葉余下部分為外質體(7天內)，用70％的乙醇洗30s，無菌水清洗3次；再用3％次氯酸鈉浸泡10min，無菌水清洗3-5次；最后用滅菌濾紙吸干其浮水后轉入MS+0.8mg/lNAA+0.2mg/l 6-BA+50mg/l卡那霉素培養基誘導形成愈傷組織；兩周一次繼代培養1次，愈傷組織轉入MS+0.2mg/l IAA+1.2mg/l 6-BA培養基誘導幼苗分化；分化幼苗轉入MS+0.5mg/l IAA培養基誘導生根；3-5天練苗后；移栽盆內。
香椿的組織培養以陽性反應的香椿莖尖余下部分為外質體(20天內)，用70％的乙醇洗30s，無菌水清洗3次；再用3％次氯酸鈉浸泡15min，無菌水清洗3-5次；最后用滅菌濾紙吸干其浮水后轉入MS+0.6mg/l2，4-D+100mg/l卡那霉素培養基誘導形成愈傷組織；兩周一次繼代培養3-4次后，愈傷組織轉入MS+0.4mg/lIAA+2.0mg/l KT培養基誘導幼苗分化；分化幼苗轉入

IAA培養基誘導生根；3-5天練苗后，移栽盆內。
GUS染色鑒定取再生植株的葉片(每個來源的再生植株只隨機選取一株測定)；陽性再生植株(T1)收獲的種子進行無菌水發芽，取其根尖(隨機選取100株)進行GUS染色；統計陽性表達率，染色方法見實例1。
gus基因PCR的鑒定取植株的幼葉，CTAB法提取植物全基因組DNA；按文獻設計gus基因引物；以含gus基因的質粒為陽性對照(質粒來源于實例1)，未轉化植株為陰性對照進行PCR擴增；瓊脂糖凝膠電泳鑒定，有特異帶為陽性植株；PCR陽性率(％)＝陽性株數/測定總株數。每個來源的再生植株只隨機選取一株測定(同GUS染色測定的材料相對應)；T1代鑒定材料為GUS染色測定的隨機選取的100株苗。
4.2結果與分析 實例3表明瞬間表達陽性的植株，在無選擇壓力下，隨著它的生長發育，它很快就會失去外源DNA片段。因此，開展了實例4的研究。由表4可知，經過輻照處理的種子，在質粒轉化下幼苗期表現陽性的植株，取其葉或莖尖為外植體，經過組織培養獲得再生植株，其GUS陽性表達率和PCR陽性率均超過60％；而隨機抽取的再生植株后代幼苗，GUS陽性表達率和PCR陽性率均超過80％。
表4 再生植株和T1代幼苗的GUS染色陽性表達率(％)與PCR陽性率(％) 4.3結論 對輻照種子通過農桿菌介導或質粒直接轉化獲得的瞬間表達陽性的植株，可以通過組織培養的手段獲得更高而穩定的轉化體。
權利要求
植物種子轉化技術
本發明專利的主要技術特征是將在γ射線輻照后的植物種子(劑量為0.01-10Gy，劑量率為0.1-2Gy/h)，轉入攜帶目的基因質粒的農桿菌或外源DNA(表達質粒)中浸泡5-300min，然后，在選擇性基質中萌發；鑒定、篩選GUS基因瞬間表達的幼苗；利用陽性幼苗可以用作兩種后續的處理一是作為外植體，在選擇培養基上進行組織培養獲得轉基因再生植株；二是將陽性幼苗直接移栽盆內或田間，但其后，要每各3-5天，在各株的所有莖尖處點滴50-200μl的相關抗生素(濃度為50-250mg/l)，直至花芽的形成；收獲種子進行外源基因鑒定，陽性材料進入下一代種植。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域。外源DNA進入植物基因組，目前主要有愈傷組織的農桿菌介導和基因槍法等技術。但是，受再生體系難、遺傳背景差異導致轉化率低下等因素，它們仍然處在不斷的完善之中。物理手段的使用(如超聲波、負壓法、脈沖電泳、重離子輻照和γ射線輻照等)也同樣存在使用材料有限、轉化率低等主要問題。其中與本發明相近的γ射線輻照，因為輻照材料為愈傷組織，要考慮到再生體系、輻照時期和污染等問題，實際操作受到了很大限制。因此面對許多類型植物的轉化技術，還需要進一步的不斷改進。本發明的主要內容與技術特征是將在γ射線輻照后的植物種子(劑量為0.01－10Gy，劑量率為0.1－2Gy/h)，轉入攜帶目的基因質粒的農桿菌或外源DNA(表達質粒)中懸浮液浸泡5－300min，然后，在選擇性的基質中萌發；鑒定、篩選GUS基因瞬間表達的幼苗利用陽性幼苗可以用作兩種后續的處理一是作為外植體，在選擇培養基上進行組織培養獲得轉基因再生植株；二是將陽性幼苗直接移栽盆內或田間，但其后，要每各3－5天，在各株的所有莖尖處，點滴50－200μl的相關抗生素(濃度為50－250mg/l)，直至花芽的形成；收獲種子進行外源基因鑒定，陽性材料進入下一代種植。
文檔編號A01H4/00GK1995358SQ20061012949
公開日2007年7月11日 申請日期2006年11月22日 優先權日2006年11月22日
發明者李興林, 舒慶堯, 路福平, 夏英武, 吳殿星, 高年發, 張健, 崔海瑞, 傅俊杰 申請人:天津科技大學