專利名稱：生產c4植物幼苗的方法
背景技術：
1.發明領域本發明涉及C4植物，特別是甘蔗幼苗的光合自養栽培的生產方法(光合自養微量繁殖)。
2.相關技術的說明甘蔗是一種主要為了生產糖而在世界范圍內栽培的植物，在世界上甘蔗的種植面積達到了2千萬英畝，并且從經濟和工業角度來看，是非常重要的(FAO生產年鑒51155，1997)。
營養繁殖甘蔗一直是傳統的常用方法。就是說，繁殖是通過以下方法進行的通過從莖插條或栽植體上獲得多個芽，作為長度大約20-30厘米的繁殖體，將其切成單個的芽，并且由長大的芽再次獲得莖插條。最終，將所述莖插條移植到大田中，以便生產甘蔗。因此，為了繁殖和種植，特別當甘蔗的新品種被投放市場時，每年都需要大量的莖插條。不過，這種生產方法需要很長時間。僅僅是馴化時間就需要大約2個月。因此，事實是，所述方法不能被認為是完美的生產方法，并且一直都需要更有效的、更經濟的繁殖和生產系統。
另一方面，通過植物組織培養進行的微量繁殖被認為是另一種有用的營養繁殖方法。該方法能夠生產大量無病毒或無病原體的，并且在遺傳上優良的均勻移植體。因此，如果該技術應用在甘蔗生產上，可以預料會導致糖產量的顯著提高。不過，該方法在傳統上具有某些問題，因為該方法是在將糖作為碳源添加到培養基中的條件下實施的，使得它依然不能在甘蔗上被商業化應用，所述條件被稱為“光合混合營養培養條件”或“異養培養條件”。所述問題包括(1)幼苗生產緩慢，(2)芽和根發育不良，(3)由于生物學污染而導致幼苗損失，(4)在馴化期間存活百分比較低等(Desjardings等，微量繁殖系統的碳同化的體外調控和操作中的碳養分植物組織培養的自動化和環境控制，Kluwer學術出版社，441-465頁，1995)。
最近的研究發現，來自C3植物的、有葉綠素的外殖體，可以在無糖的培養基上生長，即它是光合自養的。還證實了，上述問題中的很多都可以通過控制有利于促進光合作用的外部環境的方法加以解決，并且，所述外殖體在無糖培養基上的生長，比在含有糖的培養基上的生長更好(Kozai，在光合自養條件下的微量繁殖微量繁殖技術和應用，Kluwer學術出版社，447-469頁，1991)。本文所說的“控制體外環境”表示將培養環境中的二氧化碳濃度和/或光照強度，提高到高于在傳統光合混合營養培養中所使用條件的水平。另外，還證實了，由于光合自養微量繁殖同樣是很多C3植物提高長根百分比和生產生理學和形態學上優質幼苗的有效方法，該方法提供了一種降低幼苗生產成本的技術，即使將環境控制的復雜性考慮在內也是如此(Aitken-Christie等，植物組織培養的自動化，一般介紹和綜述植物組織培養的自動化和環境控制，Kluwer學術出版社，1-18頁，1995)。
不過，由以上例子所代表的研究一直都是用C3植物進行的，沒有對C4植物作過介紹。已知諸如甘蔗和玉米的C4植物具有不同于C3植物的光合途徑(C4光合途徑)。已知C4植物的二氧化碳補償點(＜10微摩爾/摩爾)低于C3植物的二氧化碳補償點，并且二氧化碳飽和點(＜1000微摩爾/摩爾)低于C3植物的飽和點(Salisbury和Ross，植物生理學，Wadswaoth出版公司，257-260頁，1998)。另外還知道C4植物的光補償點(PPF(光合作用有效的光子通量)＞20微摩爾/平方米/秒)高于C3植物的光補償點，并且光飽和點(PPF＞1000微摩爾/平方米/秒)高于C3植物的光飽和點(Hesketh，對不同植物的光合作用反應的限制，作物科學，3493頁，1963)，因此認為對C3植物的光合自養培養(光合自養微量繁殖)的作用和影響，可能與對C4植物的光合自養培養(光合自養微量繁殖)的作用和影響不同。不過，上述研究都沒有澄清C4植物的光合自養微量繁殖。
在1991年，Walker等研究了栽培C4植物之一的甘蔗的合適的繁殖條件，但是未能發現光合自養微量繁殖的優點，并且，所得出的結論是，使用糖并且沒有二氧化碳增強和通風的光合混合營養微量繁殖是最佳的(Walker等，甘蔗微量繁殖的最佳環境，Trans.of the ASAE，34(6)2609-2614頁，1991)。
另外，Tay等也報導了二氧化碳濃度對甘蔗栽培的影響(Tray等，在體外細胞中改變二氧化碳和光照水平對耳草屬植物和甘蔗芽培養物生長的影響，Dev.Biol.Plant，36118-124頁，2000)。不過，研究是用糖進行的，并且他們得出的結論是，甘蔗生長的差異是由于二氧化碳濃度的差別很小，因為考慮到了這樣的事實，即C4植物中的C4途徑對外部二氧化碳環境敏感性較低。這清楚地表明，他們根本就不了解光合自養微量繁殖。
另一方面，在2000年，Erturk和Walker發現甘蔗可以在180微摩爾/平方米/秒的光照強度和2200微摩爾/摩爾的二氧化碳濃度的條件下，以光合自養方式生長(Erturk和Walker，在微量繁殖中，光照、二氧化碳和激素含量對甘蔗芽向光合自養方向轉化的影響，Trans.of the ASAE，43(1)147-151頁，2000)。他們所提供的結果僅僅證實了光合自養微量繁殖的可能性，而且，根據生長結果并不能說有關技術已經發展到可以實際應用的水平。截止到他們的報導發表時，仍然有許多問題需要解決，例如(1)植物生長調節劑(植物激素)是一個無法消除的、導致額外步驟和成本的因素，并且會導致植物的變異，(2)沒有考慮過栽培環境中的通風條件，(3)使用類似于在傳統方法中所使用的膠凝劑作為植物的支撐材料，會導致所獲得的根系的形狀類似水下根系，并且，這些根系在移植到土壤中之后不能正常起作用，如此等等。
發明概述本發明就是在上述情況下完成的，并且本發明的一個目的是提供一種C4植物，特別是甘蔗幼苗的光合自養微量繁殖的生產方法，其中，通過將C4植物的組織轉移到多孔的/纖維狀不含糖和植物生長調節劑的培養基而進行栽培的，并且，該方法在成本、栽培時間等方面都有所改善。
本發明人為了解決上述問題而進行了深入研究，結果發現將C4植物的組織移植到既不含糖又不含植物生長調節劑，而是含有多孔支撐材料的培養基中，并且在補充二氧化碳的條件下，在光輻射條件下栽培，可以極好地促進C4植物，特別是甘蔗小植株的長根和生長。另外，本發明人還發現，通過將光輻射條件設定為高的PPF水平，將二氧化碳濃度保持在高濃度上，以及控制上述栽培中的通風條件，可以促進所述幼苗的生長。
就是說，本發明提供了以下內容
(1)一種生產C4植物幼苗的方法，包括將所述C4植物的組織移植到不含糖，但含有多孔支撐材料的培養基中，和在光照條件下，在補充二氧化碳的條件下培養所述組織，以便形成所述植物的幼苗。
(2)如(1)項的方法，其中，所述C4植物的組織是在二氧化碳能夠擴散到容器外面的培養容器中培養的。
(3)如(2)項的方法，其中，所述培養容器可以向外界通風，并且，其中，控制所述培養容器內部的二氧化碳濃度，使得所述培養容器外面的二氧化碳濃度保持在高于培養容器內部的水平上。
(4)如(3)項的方法，其中，所述C4植物的組織是在通風條件下培養的，通風是以2-20/小時的多種空氣交換速度進行的。
(5)如(3)項的方法，其中，所述C4植物的組織是在所述培養容器周圍的二氧化碳濃度為1000-2000微摩爾/摩爾的濃度下培養的。
(6)如(3)項的方法，其中，所述C4植物的組織是在所述培養容器內部二氧化碳濃度為400-2000微摩爾/摩爾的濃度下培養的。
(7)如(5)項的方法，其中，所述C4植物的組織是在所述培養容器內部二氧化碳濃度為400-2000微摩爾/摩爾的濃度下培養的。
(8)如(2)項的方法，其中，所述培養容器裝配了用于進氣和排氣的裝置，以便向該容器內供應二氧化碳。
(9)如(8)項的方法，其中，所述C4植物的組織是在通過所述進氣和排氣裝置通風的條件下培養的，以2-20小時的多種空氣交換速度吸入和排出空氣。
(10)如(8)項的方法，其中，所述C4植物的組織是在所述培養容器周圍的二氧化碳濃度為1000-2000微摩爾/摩爾的濃度下培養的。
(11)如(8)項的方法，其中，所述C4植物的組織是在所述培養容器內部二氧化碳濃度為400-2000微摩爾/摩爾的濃度下培養的。
(12)如(10)項的方法，其中，所述C4植物的組織是在所述培養容器內部二氧化碳濃度為400-2000微摩爾/摩爾的濃度下培養的。
(13)如(1)項的方法，其中，所述C4植物的組織是在光照條件下，在光合作用光子通量100-500微摩爾/平方米/秒的條件下培養的。
(14)如(1)項的方法，其中，所述多孔的支撐材料是選自下列一組的至少一種材料蛭石、珍珠巖、纖維素纖維、纖維素衍生的纖維、聚酯纖維、陶瓷纖維、褐塊石棉及其混合物。
(15)如(14)項的方法，其中，所述多孔支撐材料包括纖維素纖維和蛭石的混合物。
(16)如(1)項的方法，其中，所述培養基包括不含植物生長調節劑的培養液。
(17)如(1)項的方法，其中，所述C4植物是甘蔗。


圖1a是光合自養生長的甘蔗幼苗在第10天的照片；圖1b是光合自養生長的甘蔗幼苗在第18天的照片；圖2表示隨著時間推移，在培養容器和培養室中二氧化碳濃度變化的曲線圖；和圖3是表示每一個實驗小組中甘蔗幼苗的凈光合速度隨時間推移變化的曲線圖。
優選實施方案詳述下面將對本發明作詳細說明。
本發明的C4植物幼苗的生產方法，是一種通過光合自養微量繁殖方法生產C4植物的方法，其中，將所述C4植物的組織移植到一種不含糖的培養基中，并在該培養基中栽培，其特征在于所述C4植物的栽培是將一種多孔的支撐材料用作上述培養基，在光照和補充二氧化碳的條件下進行的。
在這里，本發明可以采用的植物沒有具體限制，只要它們是C4植物就行，并且包括，例如，屬于以下科的植物禾本科、莎草科、藜科、大戟科、菊科和莧科，特別是甘蔗和玉米。具體地講，對于甘蔗來說，可以優選使用本發明的生產方法。一般，甘蔗是給能積累蔗糖的甘蔗屬植物起的屬名。
作為用于栽培的植物材料組織(外殖體)，可以是莖插條和幼苗等。它們通常具有一個或幾個葉片。
在本發明的栽培方法中，推薦將光照的PPF(光合作用光子通量)值設定為高的水平。具體的值在100-500微摩爾/平方米/秒的范圍內，優選200-500微摩爾/平方米/秒，更優選200-450微摩爾/平方米/秒。
一般，作為照射用的燈光，可以使用，例如，由白色熒光燈發出的燈光。
另外，在本發明的栽培方法中，在所述栽培期間控制二氧化碳濃度，以便幼苗的栽培可以在高二氧化碳濃度氣氛中進行。
用于在幼苗周圍形成具有高二氧化碳濃度氛圍的措施特別包括以下方式。
一種方式是使用能夠向外界排氣的培養容器，并且在該培養容器中栽培所述C4植物，同時，將所述培養容器周圍的二氧化碳濃度保持在高的濃度水平上。通過提高所述培養容器周圍的二氧化碳濃度，所述培養容器內的二氧化碳濃度也可以提高。例如，當將所述培養容器放入培養室，并且在該培養室中進行栽培時，將該培養室中二氧化碳的濃度設定為1000-2000微摩爾/摩爾是有利的，優選1000-1800微摩爾/摩爾，更優選1000-1700微摩爾/摩爾。
在這種情況下，所述能夠向外界排氣的培養容器特別包括這樣一種培養容器在它的蓋子和/或壁的一部分上設有氣體可滲透的薄膜。例如，作為所述氣體可滲透的薄膜，使用Milli-Seal(Millipore公司)是合適的。
另一種模式是使用一種培養容器，其中，所述C4植物是通過有效提供用于吸入和排出空氣的裝置，如可以強制實施空氣吸入和排出的空氣泵而進行栽培的，并且向該培養容器中提供具有高二氧化碳濃度的空氣，例如，通過使用Heo，J.和Kozai，T.所披露的方法(1999，用于增強甘薯幼苗的光合作用、生長和發育的強制通風微量繁殖系統，生物學的環境控制，37(1)83-92)，可以將具有高的二氧化碳濃度的空氣大量送入所述培養容器，以便增強該培養容器的通風。
所述培養容器每小時的空氣交換次數優選通過Kozai，T.所披露的方法測定(1986，對植物組織培養容器中環境的基礎研究(2)，塞子和容器對通過塞子密封的容器內部和外部之間氣體交換速度的影響，J.Agr.Met.42，以下又稱之為Kozai等，1986)。在該方法中，空氣交換的次數可以是2-20/小時，優選3-20/小時。
優選對空氣交換次數加以控制，以便在栽培開始階段的數日內保持在上述范圍內的較小的值，然后逐漸提高到較大的值。
建議在進行所述栽培時將所述培養容器中二氧化碳的濃度值設定在400-2000微摩爾/平方米/秒的范圍內，優選400-1800微摩爾/平方米/秒，更優選500-1600微摩爾/平方米/秒。
由于所述培養容器中二氧化碳濃度還要受到該培養容器中幼苗的光合速度的影響，還建議根據需要可以改變上述培養容器周圍的二氧化碳濃度以及空氣交換的次數，以便能夠在栽培期間將培養容器內的二氧化碳濃度保持在一個優選范圍內。
下面將介紹用于本發明中的培養基。
在本發明中，使用不含糖(無糖)的培養基。所述培養基沒有特別限制，只要它不會損害本發明的效果就行。例如，所述培養基包括用2倍強度磷酸二氫鉀、硫酸鎂和EDTA二鈉改進過的MS培養基。
另外，沒有必要向用于本發明的培養基中添加諸如植物生長素和細胞分裂素的植物生長調節劑。
另外，在本發明中，要使用一種多孔的支撐材料。所述多孔的支撐材料沒有特別限制，只要它不損害本發明的效果就行。建議用以下材料生產所述多孔支撐材料，例如，蛭石、珍珠巖、纖維素纖維、纖維素衍生的纖維、聚酯纖維、陶瓷纖維、褐塊石棉及其混合物。特別優選的是使用蛭石和纖維素纖維的混合物(例如，由Nisshinbo工業公司生產的Florialite)。
至于其他栽培條件，溫度優選為25-30℃，而培養容器中的濕度為60-100％。優選對濕度加以控制，以便在栽培的開始階段將濕度設定在高的水平上，然后逐漸降低。
所述栽培容器優選至少是部分透光，以便幼苗能夠進行光合作用。例如，可以使用具有透明蓋子的培養容器。
在本發明中，在幼苗栽培期間，建議栽培是在傳統的12-16小時/天的光照期和12-8小時/天的黑暗期的光照條件下進行的。
所獲得的幼苗通常是在外部環境中馴化之后再移植到大田中的。還可以通過采用本發明的生產方法將通過所述體外栽培所獲得的C4植物的幼苗移植到大田中，取消了在體外環境下馴化的過程。
通過本發明可以獲得以下效果。
就是說，由于通過使用多孔的支撐材料在受控制的環境下通過光合自養栽培生長的C4植物，能夠以很高的效率在短時間內生產出健康的幼苗，預計不僅可以簡化馴化階段，而且預計能夠取消所述馴化過程，并將所述幼苗直接移植到大田中。
另外，在將幼苗轉移到馴化處理環境或直接移植到大田中時，連同所述支撐材料一起移植幼苗可以減少洗滌根系的操作，并避免損傷根系，這樣就有可能獲得高的幼苗存活百分比和生長速度。
如上文所述，本發明的C4植物幼苗的光合自養微量繁殖的生產方法，可以提供這樣一種C4植物幼苗的生產方法，其中，諸如成本和栽培時間的實踐特征得到了改善。
下面將通過舉例的方式對本發明作更詳細的說明。不過，本發明不應當被視為局限于這些實施例。
(1)材料和方法將光合混合營養生長的甘蔗(編碼Roc22)幼苗的單一的芽用作外殖體，其中，每個外殖體的平均葉面積、鮮重和干重分別為210平方毫米、153毫克和13毫克。
將所述單一的芽移植到Magenta型培養容器中(體積370毫升，高9.7厘米；由日本的Verde有限公司生產)，每個容器裝有兩個外殖體和60毫升用2倍強度磷酸二氫鉀、硫酸鎂和EDTA二鈉改良過的MS培養基。
在高壓滅菌之前，將所述培養基的pH調整到5.8。在整個培養期間，將培養室中的空氣溫度和相對濕度分別保持在27-28℃和70-75％。光照條件為16小時/天，由白色熒光燈提供光照。
上述實驗有7個處理。在下面披露的表1中提供了處理代碼以及對各種處理的說明。對于光合自養微量繁殖處理來說，將因素實驗設計成具有兩種水平的PPF(光合光子通量)和三種水平的N(培養容器的空氣交換次數)，并且每個處理有10個重復。將以上結果與對照處理(用含有糖的瓊脂糖培養基，在低的PPF和低的N條件下進行常規的光合混合營養栽培)的結果加以比較。進行方差分析(ANOVA，通過兩種水平的PPF和三種水平的N的組合進行了六種類型的分析)和Duncan’s多范圍測試。
表1

在表1中，與符號“*”一起使用的第一個(左側)字母L和H分別表示低的和高的PPF。而第二個(右側)字母L、M和H分別表示培養容器空氣交換的低、中等的和高的次數。在除了對照處理以外的所有處理中，培養基中都不含糖。
(1-1)光合自養栽培(光合自養微量繁殖)在光合自養栽培條件下，在下文所述的Florialite上體外栽培上述甘蔗外殖體。在第0-3天、4-10天和11-18天，在LL、LM和LH中的PPFs分別為100、200和300微摩爾/平方米/秒，在HL、HM和HH中的PPFs分別為200、300和400微摩爾/平方米/秒。
在光合自養栽培條件下，不僅不向所述培養基中添加糖，而且還從改進的MS培養基中排除了萘乙酸(以下又稱之為NAA)——一種植物生長調節劑(生長激素)，維生素和其他有機物質。在光合自養栽培中，用Florialite(由蛭石和纖維素纖維混合物制成的具有高的孔隙度的支撐材料；Nisshinbo工業公司)作支撐材料。用一臺二氧化碳控制儀將培養室中的空氣二氧化碳濃度保持在1500微摩爾/摩爾。將透氣性薄膜(直徑10毫米，膜的孔徑0.5微米)連接在相應容器的蓋子和壁的孔上，以便增強自然通風。
在表1中所提供的培養容器每小時的空氣交換次數是按照Kozai等(1986)所披露的方法測定的。在LM、LH、HM和HH處理中，隨著時間推移通過增加透氣性薄膜的數量提高N值。
在第3、10和17天，用氣相層析儀(GC-12A，Shimadzu有限公司，日本京都)測定培養容器內部和外部的二氧化碳濃度。
按照Fjiwara等所建立的方法(Fjiwara，K.，Watanabe，I.，1987，測定裝有組織培養幼苗的密封容器中的二氧化碳氣體濃度，并估算幼苗凈光合速度，J.Agr.Meteorol.4321-30)，用以下公式計算凈光合速度。
Pn＝KNV(C外部-C內部/)E其中，K是將二氧化碳從體積轉換成摩爾數的換算系數(0.0405摩爾/升，28℃)；N是培養容器每小時的空氣交換次數(/小時)；V是培養容器的空氣部分的體積(0.37升)；C外部和C內部是在光照期間，在穩態條件下，培養容器內部和外部的二氧化碳濃度(微摩爾/摩爾)；E是每個容器的幼苗數量。
在光合自養栽培條件下的處理中，在第0、10和18天測定每個幼苗的鮮重和干重、葉面積和展開(不折疊)葉片的數量。在第18天，某些幼苗在光合自養栽培條件下，在培養容器中明顯變大，并且大多數葉片的上半部分接觸到栽培容器蓋子的內表面。這樣，在第18天不得不終止該實驗。
(1-2)對照處理另一方面，在常規光合混合營養栽培條件下的處理中，添加蔗糖(30克/升)作為碳能源，并且添加萘乙酸(NAA)——一種植物生長調節劑(植物激素)(0.5毫克/升)，以便促進幼苗長根。用瓊脂(6.5克/升)作為根系的支撐材料。
將對照處理的培養室中的二氧化碳濃度調整到與大氣中的常見二氧化碳濃度相同(大約400微摩爾/摩爾)。在所述對照處理中，在整個實驗期間將PPF設定為60微摩爾/平方米/秒。在光合自養栽培條件下的處理的實驗時間是18天，與此不同的是，對照處理的實驗時間是30天。
在所述對照處理中，分別在第0、10、18和30天測定每個幼苗的鮮重和干重、葉面積和展開的(非折疊的)葉片的數量。
(2)結果(2-1)幼苗的生長第18天的生長和發育結果歸納在表2和圖1中。
表2

在表2中，為了進行比較還歸納了對照處理(傳統的光合混合營養栽培)的生長結果(處理代碼參見表1)。
在表2中，每一個幼苗的芽的數量表示繁殖比例(可用于下一階段的繁殖的外殖體的數量)。另外，在表2中，Z表示同一欄的平均值后的相同字母，通過LSD(最小顯著差異)測試p＜0.05的無顯著差別。Y表示對6個處理進行的方差分析，這些處理是由培養容器的兩種水平PPF和三種水平的空氣交換次數組成的。X表示NS，*和**分別代表不顯著、在5％的可能性水平上(p＝0.05)顯著和在1％的可能性水平上(p＝0.01)不顯著。A表示培養容器的空氣交換次數。
圖1A和1B是表示第10天(圖1A)和18天(圖1B)光合自養生長的甘蔗幼苗受培養容器的PPF和空氣交換次數影響的照片。為了進行比較，還示出了對照處理中光合混合營養生長的幼苗(處理代碼參見表1)。
在所有實驗組的HH處理中，甘蔗生長(葉面積、根和芽的鮮重，以及根和芽的干重)是最高的。每個幼苗的葉面積、芽和根的鮮重以及芽和根的干重，分別比對照處理中的相應的值高5.2、4.6、32、6.9和30倍。(下面在適當的時候會省略術語“處理”)。
在HM、LH和LM中的生長明顯比在對照中的生長快(表2，圖1)。
在LL、HL和對照之間的增長沒有明顯差別。
培養容器的空氣交換次數N，對甘蔗的所有生長參數(葉面積、根和芽的鮮重，以及根和芽的干重)都有正面影響。PPF對葉面積、芽的鮮重和干重有正面影響。
N和PPF對生長的正面影響在第10天就已經出現了(參見表3)。在所有處理中，在HH中的生長最快。
表3

表3表示在光合自養培養條件下，受培養室的PPF和空氣交換次數影響的甘蔗幼苗在第10天的生長情況。表3還示出了對照處理(常規的光合混合營養培養)的生長結果，以便比較(有關處理代碼參見表1)。
在表3中X表示NS和**代表在1％可能性的水平上(P＝0.01)“不顯著”和“顯著”。其他符號的含義與表2中相同。
在HH處理中每個甘蔗幼苗的葉面積、鮮重和干重分別比對照處理的高4.0、4.3和6.7倍。在HM、LH和LM中的生長明顯快于在對照中的生長(表3)。LL、HL和對照之間的生長沒有顯著差別。在LL、HL中，在第3天就已經可以看到芽和根的生長和發育。
在HH中的根的鮮重和干重分別比在對照中的高32和30倍，所述對照是在添加了0.5毫克/升萘乙酸(NAA)——一種植物生長調節劑(植物激素)的培養基中培養的(參見表2)。在HH中，在沒有NAA的條件下，長根的加強可能是由于適當選擇了光合自養栽培的條件，并且由于支撐材料(即Florialite)具有較高的空氣孔隙度。具有高的空氣孔隙度的支撐材料提供給芽底部周圍的溶解氧氣的濃度，一般高于諸如瓊脂的膠凝支撐材料所提供的溶解氧氣的濃度。
如上文所述，在體外馴化期間，活躍的根系生長是甘蔗幼苗存活所必需的。
在所述實驗中，在HH、HM和LH中幼苗的生長出人預料的快，并且，在第10天的之后，很少有幼苗的葉片頂端沒有達到容器蓋子內表面的。
另一方面，在對照、HL和LL中幼苗的生長是緩慢的。
在第30天，每個幼苗的葉面積、芽和根的鮮重、芽和根的干重以及芽的數量分別為423±83平方毫米、439±75毫克、36±5毫克、3.6±0.5毫克。
(2-2)栽培容器中的二氧化碳濃度圖2是分別表示栽培室和培養容器中二氧化碳濃度隨時間而變化的曲線圖。該曲線是用在光照期中測定的值作的圖。在光合自養培養的遮光期間，培養容器中二氧化碳濃度至少為1500微摩爾/摩爾。
另一方面，在第3天，在光合自養培養的光照期培養容器中二氧化碳的濃度低于培養室中的濃度(1500微摩爾/摩爾)。這表明從培養一開始外殖體的凈光合速度是正的。
在HM和HH中，在光照期間，培養容器中二氧化碳的濃度隨著時間推移而降低，并且在第17天達到大約150微摩爾/摩爾。在LM中，第17天的二氧化碳濃度為530微摩爾/摩爾，這一濃度值比培養室中的濃度低大約1000微摩爾/摩爾。
在光合自養培養條件下，LL和HL中的某些幼苗逐漸變黃，并在第3-7天失去活力。在第12天，LL和HL中80-90％的幼苗死去，并且在第14和15天出現新芽。這可能是因為在光照期間由于培養容器空氣交換次數較少所導致的培養容器中二氧化碳濃度較低的結果，使得幼苗出現了負的凈光合速度，并且，因此限制了幼苗在體外的生長。另一方面，在HH、HM、LH和LM處理中，空氣交換的次數高于LL和HL中的空氣交換次數，并且，葉片顏色保持綠色和有活力。
在LL和HL中，在光照期間二氧化碳的濃度隨著培養時間的推移沒有顯著降低。
在第3、10和17天，對照的二氧化碳濃度分別為大約7000、7300和8100微摩爾/摩爾，與之對應的是，在培養室中二氧化碳的濃度為390-440微摩爾/摩爾，這表明在整個培養期間外殖體/幼苗具有負的凈光合速度。
(2-3)凈光合速度在HH、HM、LH和LM中，凈光合速度隨著培養時間的推移而提高。在HH中的凈光合速度最高，在第3、10和17天每個幼苗的凈光合速度分別是3.5、16和95微摩爾/小時，隨后是HM、LH和LM(圖3)。
在整個實驗中，在LL和HL中的凈光合速度是略微正的，但不會隨著時間推移而提高。
空氣交換次數N的增加，能顯著提高幼苗的凈光合速度。N的增加是由于在培養室中幼苗周圍空氣運動或空氣流速度的提高，以及促進了存在于幼苗周圍的二氧化碳的擴散，由此導致了體外植株光合作周的增強。另外，N的增加明顯降低了在光照期間培養容器中的相對濕度，并因此顯著提高了幼苗的蒸騰速度。
對照的凈光合速度是負的并且最低，在第3、10和17天每個幼苗的凈光合速度分別為-8.8、-9.2和-10.4微摩爾/小時。對照的負的凈光合速度，可能是因為在培養容器中的培養基中存在糖、PPF較低、以及在整個培養期間空氣交換次數較少(在光照期間，培養容器中的二氧化碳濃度較低)。
在光合自養條件下，在培養期間提高HH、HM和LH中PPF和N(空氣交換次數)，并保持培養容器中二氧化碳的濃度高于大氣中的二氧化碳濃度，可能對促進光合作用和生長非常有效。
(2-4)每個幼苗的芽和展開葉片的數量。
在第18天，LM、LH、HM和HH中的可以用作外殖體進行進一步的體外擴增，以及用于進行體外移植的芽的數量明顯高于在HL、LL和對照中的數量(表2)。因此，可以認為LM、LH、HM和HH的繁殖比例高于在HL、LL和對照中的繁殖比例，從而能夠有效生產幼苗。
另外，在第18天，HH中每個幼苗的未折疊的葉片的數量明顯高于在其他處理中的數量，并且在對照、LL和HL中最低(表2)。體外幼苗的凈光合速度，以及剛剛移植到體外的外殖體的凈光合速度會隨著未折疊葉片數量的增加而提高，或者更具體地講，會隨著所述芽(或外殖體)所具有的葉面積的增加而增加。因此，可以認為在HH處理組中的外殖體，每一個幼苗的葉面積大于其他處理組中的每一個幼苗的葉面積這一事實，是光合自養生產的非常有利的條件。
HM和HH中比較高的繁殖比例和比較大的葉面積可能是由于通過外殖體的高的凈光合速度以及使用多孔的支撐材料而增強并促進了根組織和芽的發育和生長。根組織的較快的生長改善了對水分和養分的吸收，使得幼苗較少枯萎，并且芽能更好地生長。
(2-5)繁殖周期如圖1所示，在第18天，HH處理組中的幼苗由于過度生長并且太大，以至不能用于繁殖或體外馴化。另一方面，HH中第10天的幼苗大于對照中第18天的幼苗，并且其大小適合繁殖并且用于體外馴化。
在HH中，在第10天每個幼苗的未折疊葉片的數量為8.3，這一數量比對照在第18天上的數量高大約2倍。
因此，可以認為HH的最佳繁殖期只需要大約10天，這一時間僅為傳統組織培養的30天時間的三分之一。換句話說，與對照的繁殖速度相比，HH中的繁殖速度可以顯著提高。
從上述實驗結果可以看出，根據本發明，在體外培養的甘蔗幼苗表現出了較高的光合自養生長能力。在光合自養微量繁殖中，高的PPF(100-500微摩爾/平方米/秒)，高的二氧化碳濃度以及高的培養容器的空氣交換次數(2-20/小時)，能明顯加強甘蔗幼苗的生長。
與多孔支撐材料的組合使用還能增強甘蔗芽和根組織的生長。另外，在培養基中沒有必要添加任何植物生長調節劑(植物激素)。
從成本和培養時間角度來看，在上述綜合培養條件下，通過光合自養培養進行C4植物的微量繁殖，是一種比傳統微量繁殖方法更實用和更優良的方法，因為有關條件之間是相互影響的。在采用高的PPF和高的培養容器空氣交換次數的光合自養系統中，甘蔗幼苗的體外培養時間，比傳統微量繁殖系統縮短了大約70％(從30天縮短到10天)。因此可以預料生產成本能顯著降低。這樣就可以提高在大規模商業化生產時的效益。
權利要求
1.一種生產C4植物幼苗的方法，包括將所述C4植物的組織移植到不含糖，但含有多孔支撐材料的培養基中，和在光照條件下，在補充二氧化碳的條件下培養所述組織，以便形成所述植物的幼苗。
2.如權利要求1的方法，其中，所述C4植物的組織是在二氧化碳能夠擴散到容器外面的培養容器中培養的。
3.如權利要求2的方法，其中，所述培養容器可以向外界通風，并且，其中，控制所述培養容器內部的二氧化碳濃度，使得所述培養容器外面的二氧化碳濃度保持在高于培養容器內部的水平上。
4.如權利要求3的方法，其中，所述C4植物的組織是在通風條件下培養的，通風是以2-20/小時的多種空氣交換速度進行的。
5.如權利要求3的方法，其中，所述C4植物的組織是在所述培養容器周圍的二氧化碳濃度為1000-2000微摩爾/摩爾的濃度下培養的。
6.如權利要求3的方法，其中，所述C4植物的組織是在所述培養容器內部二氧化碳濃度為400-2000微摩爾/摩爾的濃度下培養的。
7.如權利要求5的方法，其中，所述C4植物的組織是在所述培養容器內部二氧化碳濃度為400-2000微摩爾/摩爾的濃度下培養的。
8.如權利要求2的方法，其中，所述培養容器裝配了用于進氣和排氣的裝置，以便向該容器內供應二氧化碳。
9.如權利要求8的方法，其中，所述C4植物的組織是在通過所述進氣和排氣裝置通風的條件下培養的，以2-20小時的多種空氣交換速度吸入和排出空氣。
10.如權利要求8的方法，其中，所述C4植物的組織是在所述培養容器周圍的二氧化碳濃度為1000-2000微摩爾/摩爾的濃度下培養的。
11.如權利要求8的方法，其中，所述C4植物的組織是在所述培養容器內部二氧化碳濃度為400-2000微摩爾/摩爾的濃度下培養的。
12.如權利要求10的方法，其中，所述C4植物的組織是在所述培養容器內部二氧化碳濃度為400-2000微摩爾/摩爾的濃度下培養的。
13.如權利要求1的方法，其中，所述C4植物的組織是在光照條件下，在光合作用光子通量100-500微摩爾/平方米/秒的條件下培養的。
14.如權利要求1的方法，其中，所述多孔的支撐材料是選自下列一組的至少一種材料蛭石、珍珠巖、纖維素纖維、纖維素衍生的纖維、聚酯纖維、陶瓷纖維、褐塊石棉及其混合物。
15.如權利要求14的方法，其中，所述多孔支撐材料包括纖維素纖維和蛭石的混合物。
16.如權利要求1的方法，其中，所述培養基包括不含植物生長調節劑的培養液。
17.如權利要求1的方法，其中，所述C4植物是甘蔗。
全文摘要
一種生產C4植物幼苗的方法，包括將所述C4植物的組織移植到一種不含糖，但是含有多孔支撐材料的培養基中，并在光照和補充二氧化碳的條件下培養所述組織，以便形成該植物的幼苗。該方法具有諸如改善了的成本和栽培期的實用特征。
文檔編號A01G1/00GK1408212SQ02144100
公開日2003年4月9日 申請日期2002年9月27日 優先權日2001年9月27日
發明者古在豐樹, 肖玉藍, 長谷川修, 大野洋次郎 申請人:日清紡績株式會社