專利名稱：桂竹香外源基因轉移到桑樹體內的制備方法
技術領域：
本發明涉及基因工程桑樹植株外源基因的轉移領域，更具體涉及一種桂竹香外源基因轉移到桑樹體內的制備方法。
桑葉是繭絲綢的物質基礎。不斷提高桑葉產量和質量，才能生產出優質的蠶繭、生絲和絲織產品，在競爭激烈的國際市場中立于不敗之地。桑葉的蛋白含量是決定繭絲綢產品的質量的關鍵因素，普通桑樹品種的蛋白含量還不能完全滿足生產優質繭絲綢的需要，普通桑樹抗蟲性較差，桑葉產量較低，產量品質不高，飼養成績不佳，經濟效益低下。品種選育一直是提高桑葉產量、改良桑葉品質、帶動生產進步的重要措施，但傳統育種方法所需時間較長，過程繁瑣，需耗費大量的人力和物力，而且通過雜交等方法獲得的優良品種多容易受到親本材料的限制。經檢索未發現一種桂竹香外源基因轉移到桑樹體內的技術被公開。
本發明的目的是提供了一種桂竹香外源基因轉移到桑樹體內的制備方法，方法易行，操作簡便。成功地解決了桑樹工程植株將比常規品種在光合作用強度、桑葉蛋白質含量、營養物質的利用、轉化和運輸能力方面都大幅度提高的問題.并可增強桑樹的抗蟲性(但對家蠶無害)和抗逆性。
本發明是通過以下技術來實現的采用的桂竹香(Cheiranthus cheiri L.)是十字花科植物，其植株生長者大田中不易受蚜蟲、鞘翅目昆蟲為害，生長旺盛、光合作用極強。經研究發現，所克隆的細胞外膜蛋白基因(OEM1基因)在植物抗蟲性、細胞物質運輸、信號識別、傳遞、細胞代謝等方面起重要作用。植物的外膜蛋白，特別是葉綠體外膜蛋白是離子的傳送器，傳送Na+、k+這種傳送器的基因在人、鼠、醇母中已得到，基因序列長約2.4kb，編碼547個氨基酸，它與得到的OEM1基因有一定的同源性，因此OEM1基因與Na+、K+的傳送有關。桂竹香外膜蛋白基因轉移到桑樹體內的步驟是1)構建雙元載體系統采用雙元載體系統，通過反式激活T-DNA轉移。雙元載體系統主要包括兩個Ti質粒，即mini-Ti和Helper Ti(Helper Ti質粒主要作用是提供vir基因功能，激活處于反式位置上的T-DNA轉移)，其中mini-Ti質粒含有來自pTiT37的T-DND左右邊界序列，在兩個邊界序列之間的T-DNA區含有植物選擇標記和啟動子的Nos-Npt-II，以及來自噬菌體M13mp19的多種酶連接接頭的Lacz基因。在Lacz基因內部含有多克隆位點。外源基因(OEM1基因)可以便利地插入其間使其本身失活，并且可在含X-gal和IPTG的平板上直接篩選，操作極為方便。將OEM1基因用適當的限制性內切酶消化后與mini-Ti質粒相連，并在X-gal和IPTG的平板上篩選白色菌落，經提取質粒，酶切檢查后，確定OEM1基因已插入了mini-Ti質粒的多克隆位點區，將mini-Ti質粒純化后轉化含有Helper Ti質粒的根癌農桿菌感受細胞，這時含有mini-Ti質粒和Helper Ti質粒的根癌農桿菌可直接用于植物細胞的轉化。
2)構建受體系統，選用桑樹幼年期葉片作為受體，并在轉化操作前，對幼葉進行抗生素敏感性測定，并根據野生型農桿菌在外植體組織中形成腫瘤的誘導率，發生時間及生長狀態確定受體植物的敏感程度，從而選擇浸染敏感的農桿菌種類。
3)目的基因(OEM1基因)的轉化首先采用光密度測定法來確定農桿菌濃度，為了保證菌種(普通)的純化，采用多個單菌落分別培養成幾個菌群進行保留或應用。挑取單菌落接種在液體培養基內進行液體振蕩培養12-24小時，離心(4000r/min)，倒掉上清液，加入植物外植體誘導愈傷組織的液體培養基，使其OD600值達到0.5。外植體在轉化前預培養時間為2天。
預培養后的外植體切割成小塊浸泡在菌液中，浸泡時間在5-8分鐘內，用無激素植物培養基或無菌水漂洗，再用無菌吸水紙吸干，將其培養在誘導愈傷組織的固體培養基上，與農桿菌共培養，農桿菌轉化時，并不“侵入”到植物細胞中，而是把T-DNA轉移到植物細胞，在創傷部位生存16小時后菌株才誘發腫瘤，因此共培養時間長于10小時。但共培養時間太長，由于農桿菌的過度生長，植物細胞因受到毒害而死亡，因而采用GUS基因瞬時表達法測定共培養的最佳的時間，并根據獲得的轉化愈傷組織頻率為最終依據，確定外植體共培養時間需4-6天。
4)外植體脫菌與農桿菌共培養的外植體表面及淺層組織中共生有大量農桿菌，必須把共培養后的外植體轉移到含有抗生素的培養基上進行脫菌培養，脫菌培養時間需5-6次繼代培養，但為了殺死殘留在維管束和細胞間隙中的農桿菌，一直使用抗生素直到試管苗形成。
5)選擇培養在選擇培養基中加入km抑制非轉化細胞的生長，km濃度范圍50-100mg/L。一般情況下試管苗對km選擇壓力不如愈傷組織那樣敏感，因此非轉化的試管苗也可能在選擇培養基上生長，但根對抗生素的敏感性很強，因此在含高濃度的km選擇壓力的選擇培養基上非轉化苗是難生根的，只有轉化苗才可能生根，所以苗的生根能力是實現轉化的一個有力佐證。
轉化苗的保持與繁殖直接關系到生產實踐的應用，目前采用兩條途徑實現轉化苗的保持與繁殖，一條是營養繁殖途徑，它包括試管苗的無性快速繁殖及嫁接，扦插等田間的營養繁殖方式，從而保證充足的轉化再生植株，第二條途徑是種子繁殖，這對于轉基因植株的正常表達、遺傳特性及向生產應用過渡有重要作用。
6)外源基因(OEM1基因)整合的鑒定在完成基因轉化后，外源基因是否進入植物細胞，進入植物細胞的外源基因是否整合到植物染色體上，整合的方式如何，整合到染色體上的外源基因是否表達，需進一步加以證實。第一步工作就是篩選轉化細胞；第二步就是對轉化植株進行分子生物學鑒定。①通過Southern雜交證明外源基因在植物染色體的整合，通過原位雜交可確定外源基因在染色體上整合的位點，Southern雜交是用標記的外源基因(OEM1基因)作探針，與植物細胞染色體DNA進行雜交，具體的檢測方法有Southern斑點雜交及Southern印跡雜交兩種，斑點雜交可以較快地大略檢測一下植物基因組是否含有外源基因，利用Southern印跡不僅可以分析出外源基因是否整合到植物的染色體上，而且還可以對外源基因的整合情況進行分析，如整合的外源基因是單拷貝還是多拷貝，多拷貝的插入方式如何，是串聯插入還是分散插入，串聯的方式是同向還是反向等，由于使用農桿菌介導的轉化體，其分析的基本方法是用重疊探針雜交，并以轉化的外源基因不同拷貝數為對照。②通過Northern雜交可證明外源基因在植物細胞內是否正常轉錄，生成特異的mRNA。③通過Western雜交可證明外源基因在植物細胞內轉錄及翻譯成功，生成特異蛋白質。第三步則是進行性狀鑒定及外源基因表達調控，由于轉OEM1基因是為了獲得抗蟲性和提高桑葉產量，因而可以根據對照，選擇符合由OEM1基因編碼的特異蛋白質影響代謝而產生的具有抗蟲和高產等經濟性狀的桑樹植株，從而達到OEM1基因轉化的目的，最后是進行遺傳學分析，并獲得轉基因植物品種，應用于生產。
本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果采用的雙載體農桿菌轉化的外源基因整合位點較穩定，常在T-DNA 25bp處與植物細胞整合，大多數是單位點整合，整合的外源DNA基本保持其結構的完整性，結構的變化很少，整合外源基因的拷貝數常以單或低拷貝T-DNA為主，也有少量多拷貝T-DNA以首尾串聯形式在單位點整合，整合的外源基因在轉基因植株的顯性表達率較高，即多數外源基因能有效表達，共抑制現象相對較少，外源基因在轉基因植株中的分離符合孟德爾遺傳規律，大多數的F1轉基因植株以3∶1分離。并且獲得的桑樹工程植株將比常規品種在光合作用強度、桑葉蛋白質含量、營養物質的利用、轉化和運輸能力方面都有大幅度的提高，并可增強桑樹的抗蟲性(但對家蠶無害)和抗逆性，降低了化學農藥的使用量。
實施例將OEM1基因用適當的限制酶消化后與mini-Ti質粒相連，并在x-gal和IPTG的平板上篩選白色菌落，經提取質粒酶切后電泳檢查，確定OEM基因已插入mini-Ti質粒的多克隆位點區。然后將mini-Ti質粒純化后轉化含有HelperTi質粒的根癌農桿菌感受細胞，將根密農桿菌在平板上培養、保存。
從田間或溫室栽培的植株上獲得桑樹葉片，用蒸餾水沖洗數遍后，70％乙酶洗45秒，0.1％升汞消毒6-8分鐘，無菌水沖洗5遍，無菌濾液吸干水分將無菌葉片剪成0.5×0.5cm的小塊，接種在愈傷組織誘導或分化培養基上進行預培養，預培養4-6天，材料切口處剛剛開始膨大時即可進行侵染。從平板上挑取單菌落，接種到20mi附加km抗生素的細菌培養液體培養莖中，可以27℃，180r/min培養至OD600為0.6-0.8，再取上述菌液按1％--2％的比例，轉入無抗生素的細菌培養液體培養基中，可以27℃，180r/min條件培養6小時，OD600為0.2-0.5即可用于轉化于超凈工作臺上，將菌液倒入無菌小培養皿中，從培養瓶中取出預培養過的外植體，放入菌液中，浸泡1-5分鐘，取出外植體置于無菌濾紙上吸去附著的菌液。
將侵染過的外植體接種在愈傷組織誘導或分化培養基上，在28℃暗培養條件下共培養2-4天。
將經過共培養的外植體轉移到加有選擇壓即100g/2的KM的脫菌愈傷組織誘導培養基上，在光照1000-2000Lx，25℃條件下進行選擇培養。
選擇培養2-3周后，外植體的轉化細胞將化化出抗性愈傷組織，將這些抗性材料轉入附加選擇壓的生長或分化培養基中令其生長或誘導分化。
待不定芽長到1cm以上時，切下并插入含有選擇壓的生根培養基上進行生根培養，兩周左右長出不定根。
按常規方法提取轉基因桑樹幼葉DNA(含量為0.5-1mg/ml)和非轉化植物幼葉總DNA(含量為0.5-1mg/ml)(陰性對照)。取新的0.5ml離心管，高壓滅菌，按序列加入下列試劑dH2O 7ml，10x buffer2ml，樣品DNA 10ml，限制酶1ml，混勻，4000r/min離心3-5秒，37℃保溫過夜。
配制0.8％的瓊脂糖凝膠，將上述的溶液中加入5ml溴酚藍，混勻，將全部樣品分別點于兩個點樣孔中。并取中間載體質粒DNA溶液作陽性對照，點于第三個樣品孔中。25V電泳16小時。紫外光下檢測植物DNA樣品酶解效果。將凝膠放入搪瓷方盤中切去一角(作樣品序列標記)，加入變性液沒過凝膠，在脫色搖床上變性1小時。用蒸餾水漂洗一次，換中和液中和1小時，其間更換一次中和液。將尼龍膜與凝膠印跡，于254nm紫外光下照射4分鐘。并將膜于2xscc溶液中漂洗，晾干。
將尼龍膜在預雜交液中42℃預雜交2小時。將預雜交液倒去，加入加有地高辛標記探針的雜交液，42℃，100r/min雜交過夜。
洗膜二次，顯色，可檢測OEM1基因是否整合到桑樹的基因組中。
為檢測OEM1是否在桑樹中表達，進行Norther雜交取轉基因植物的總RNA和非轉基因植物的總RNA(陰性對照)作甲醛變性電泳。將尼龍膜與凝膠印跡，并在254nm紫外光下照射4分鐘。同實施例2中所述一樣預雜交，雜交，洗膜，顯色。根據雜交的結果可判斷所轉化的OEM1基因是否在桑樹中表達。
權利要求
1.一種桂竹香外膜蛋白基因轉移到桑樹體內的制備方法，包括下列步驟A.構建雙元載體系統；B.構建受體系統；C.目的基因的轉化；D.外植體脫菌；E.選擇培養；F.外源基因整合。
2.根據權利要求1所述的一種桂竹香外膜蛋白基因轉移到桑樹體內的制備方法，其特征在于構建雙元載體系統，通過反式激活T-DNA轉移，雙元載體系統包括兩個Ti質粒即mini-Ti和Helper-Ti。
3.根據權利要求2所述的一種桂竹香外膜蛋白基因轉移到桑樹體內的制備方法，其特征是mini-Ti質粒來自pTiT37的T_DNA邊界序列，在兩個邊界序列之間的T_DNA區含有植物選擇標記和啟動子的Nos-Npt-II，以及來自噬菌體M13mp19的多種酶連接接頭的Lacz基因。
4.根據權利要求1所述的一種桂竹香外膜蛋白基因轉移到桑樹體內的制備方法，其特征在于構建受體系統選用桑樹幼期葉片，轉化前，對幼葉進行測定，選擇浸染的農桿菌。
5.根據權利要求1所述的一種桂竹香外膜蛋白基因轉移到桑樹體內的制備方法，其特征在于目的基因的轉化采用光密度測定法來確定農桿菌濃度，挑取單菌落接種在液體培養基內進行液體振蕩培養12-24小時，離心4000r/min后加入植物外植體誘導愈傷組織的液體培養基，外植體在轉化前培養時間為2天；切割成小塊浸泡在菌液中浸泡5-8分鐘，再將其培養在誘導愈傷組織的固體培養基上，與農桿菌共培養4-6天；然后繼代脫菌培養5-6次。
6.根據權利要求1所述的一種桂竹香外膜蛋白基因轉移到桑樹體內的制備方法，其特征在于外源基因整合的步驟是A.篩選轉化細胞；B.轉化植株；C.進行性狀鑒定及外源基因表達調控；D.進行遺傳學分析，并獲得轉基因植物品種；
7.根據權利要求6所述的一種桂竹香外膜蛋白基因轉移到桑樹體內的制備方法，其特征在于外源基因表達A.Southern雜交，Southern雜交是用標記的外源基因作探針，與植物細胞DNA進行雜交；B.通過Northern雜交證明外源基因在植物細胞內正常轉錄，生成mRNA；C.通過Western雜交證明外源基因在植物細胞內轉錄及翻譯成功，生成蛋白質。
全文摘要
本發明公開了一種桂竹香細胞外膜蛋白外源基因(0EM1)轉移到桑樹體內的制備方法,包括下列步驟:首先是構建雙元載體系統;其次是構建受體系統;再次是目的基因(0EM1基因)的轉化;第四是外植體脫菌;第五是選擇培養;第六是外源基因(0EM1基因)整合。本發明方法易行,操作簡便。桑樹工程植株將比常規品種在光合作用強度、桑葉蛋白質含量、營養物質的利用、轉化和運輸能力方面都大幅度提高。并可增強桑樹的抗蟲性(但對家蠶無害)和抗逆性。
文檔編號A01H1/06GK1362519SQ0110640
公開日2002年8月7日 申請日期2001年1月2日 優先權日2001年1月2日
發明者李旭鋒, 劉天艷, 王勁, 袁旭 申請人:成都天友發展有限公司