專利名稱：通過干燥處理制備于環境溫度貯存的含有需穩定化的敏感性生物制品的保存用混合物的制作方法
發明的背景相關領域的描述敏感性的生物分子、病毒、細菌、載體、真核細胞和小型多細胞標本具有廣泛的用途，例如，包括人用和獸用藥劑、免疫處理和疫苗、分子生物學、基因治療以及食物工業等方面。一般而言，這些生物活性材料、病毒和細胞在含水環境中是活躍的；因而，這些樣品的常規制劑都是水溶液形式。但是，許多生物活性材料(尤其是病毒和細胞)對降解敏感，尤其是在環境溫度或更高的溫度下在水溶液中可喪失活性和/或生存能力。因此，這種樣品常常需要冷藏，否則在環境條件下保存期短。
本領域中已知的大量化學作用原理可破壞各種生物活性材料、病毒和細胞。在幾乎所有的這些破壞性途徑中，水是一種反應劑。此外，水還可起到增塑劑的作用，使蛋白質伸展和凝聚。由于水在幾乎所有的降解途徑中是參與者，所以，減少生物活性材料、病毒和細胞中的水溶液或懸浮液水分、使其成為干燥粉末，就可成為提高這些樣品的穩定性的一種可選擇的制備方法。可使用各種技術使病毒和細胞干燥，這些技術包括凍干、發泡干燥(foam-drying)、噴霧干燥和晾曬干燥。對生物分子、病毒和細胞的水溶液進行干燥處理，并以干燥粉末的形式貯存備用。
除了脫水處理外，玻璃化處理是另一種保存(穩定化)敏感性生物分子、病含毒和細胞的有效方法。在環境溫度中的干燥狀態下、以及在低溫條件下(冷凍)在含水環境中都可實現玻璃化過程。有于許多理由表明，包括保存方便和節約、運輸、發運方法選擇的靈活性、緊急條件下的可應用性和第三世界國家的可接受性等方面，在干燥狀態中的環境溫度下的穩定性是極為理想的。因此，生物分子、病毒和細胞在干燥狀態下進行玻璃處理是特別有用的。但是，未受保護的生物分子、病毒和細胞的干燥處理也象對這些樣品進行冷凍處理一樣，很容易對它們造成損傷。因此，需要發展一種保存用混合物，在該混合物中，生物分子、病毒和細胞可被脫水，并以最小的活性或生存能力的喪失而進入玻璃化狀態。
例如在WO 99 27071 A、DE 17 92 196 A、WO 91 18091、GB 799 644和美國專利號5,290,765中公開了在干燥狀態下保存敏感性生物制品的相關背景技術。
發明概要本發明涉及一種保存用混合物，它含有對干燥和在環境溫度或更高溫度下貯存期間的活性或生存能力喪失敏感的生物制品、單糖的非還原性衍生物和選自非還原性二糖、非還原性寡糖、二糖的非還原性衍生物、寡糖的非還原性衍生物、蛋白質、高分子保護劑和谷氨酸鈉(MSG)中的至少一種保護劑。
在一個最佳的方面，該保存用混合物中的生物制品可選自敏感性生物分子、病毒、細菌、其它的原核細胞、真核細胞。
該保存用混合物具有總的溶質質量。在一個模式中，單糖的經修飾的非還原性衍生物約占總溶質質量的5-80wt％。更佳的是，該單糖的經修飾的非還原性衍生物約占總溶質質量的20-60wt％。
本發明一個最佳模式的保存用混合物是甲基化單糖。具體而言，該甲基化單糖是甲基α-吡喃葡糖苷或甲基β-吡喃葡糖苷。
保存用混合物中所含有的非還原性二糖可能是蔗糖或海藻糖。保存用混合物中所含有的蛋白質可以選自明膠、白蛋白、乳清白蛋白或球蛋白和應激蛋白。在一種模式中，該蛋白質可以是在約50℃以上的溫度、在pH約為9以上或小于約5的水性介質中具有穩定性的任何蛋白質。較佳的是，該蛋白質的濃度約大于3wt％，更佳的是約大于10wt％。用在本發明的一個模式中的高分子保護劑可以選自HES、PVP、環糊精和PEG。
在保存用混合物含有MSG、非還原性二糖和/或非還原性寡糖的情況中，這些補充保護劑可約占總溶質質量的5-80wt％，更佳約占總溶質質量的20-60wt％。對于保存用混合物中使用寡糖的情況，根據本發明的一個實施例，這些寡糖最佳不是棉子糖。
較佳將該保存用混合物制成在干燥處理和隨后至少2周的保存中不結晶的制劑。最佳的配制包括蔗糖∶甲基(α或β)葡萄糖約4∶1到1∶2；蔗糖∶MSG的約10∶1到1∶4。
本發明還涉及一種保存對干燥處理和在環境溫度或更高溫度下貯存期間喪失活性或生存能力敏感的生物制品的方法。該方法包括將該生物制品與保護劑混合，形成保存用混合物(如上述)，然后干燥該保存用混合物，所述保護劑含有單糖的經修飾的非還原性衍生物和選自非還原性二糖、非還原性寡糖、二糖的非還原性衍生物、寡糖的非還原性衍生物、蛋白質、高分子保護劑和谷氨酸鈉(MSG)中的至少一種額外的化合物；其中，干燥處理和隨后的在環境溫度或較高保存溫度下貯存期間，該生物制品的活性或生存能力至少有一部分被保留。這種方法很適合于病毒、細菌、其它原核細胞、和真核細胞的保存。
所公開的該方法可應用于多種干燥處理方法，包括凍干、晾干、噴霧干燥、流化床干燥、真空干燥、在干燥氣體中干燥和發泡干燥。
在所公開的該方法的一個變化中，混合過程還至少包括兩步向病毒或細胞中加載單糖的非還原性衍生物，然后加入補充化合物中的至少一種，以形成保存用混合物。待生物制品在含有單糖的非還原性衍生物的溶液中平衡就可完成加料操作。
附圖的簡短說明


圖1A顯示在室溫下貯存期間還原性和非還原性糖對ICDH活性的影響。
圖1B顯示在37℃下貯存期間還原性和非還原性糖對ICDH活性的影響。
圖2顯示在50℃下貯存期間還原性和非還原性糖對ICDH活性的影響。
圖3顯示在50℃下貯存期間非還原性糖和麥芽糖精(maltrin)對ICDH活性的影響。
圖4顯示甲基化葡萄糖的玻璃化轉變溫度。
圖5顯示甲基α-d-吡喃葡糖苷對馬鏈球菌(streptococcus equi)的保存過程的影響。圖6顯示在于37℃貯存期間在全氟萘烷中脫水的熒光素酶穩定性的延長。
最佳實施例的詳細描述A.定義本文中使用的術語“化學穩定性”和/或“保存”指經由化學途徑如氧化、水解或酶作用引起的生物材料的降解不超出可接受的水平。換言之，該材料至少保留了一定水平的可滿足所需的商業用途的生物活性或生存能力。在本發明的模式中，制劑在37℃貯存1周后再水化還原，如果它仍保留至少20％的生物活性或生存能力，那么就可以認為該制劑得到了保存。
術語“敏感性生物制品”包括肽、多肽、蛋白質、酶和輔酶、血清、維生素、抗體和抗體片段。這些術語中包括天然的或純化的和重組產生的部分。此術語還包括脂蛋白和翻譯后經修飾的形式，如糖基化蛋白質。任何這些物質的類似物、衍生物、激動劑、拮抗劑和藥用鹽都可包括在這些術語中。該術語還包括具有D-或L-構型的氨基酸的經修飾的、衍生的或非天然的肽。
在本發明的優選模式中，生物制品包括任何能夠誘導免疫應答的抗原性物質。具體而言，抗原可以是在腫瘤的細胞外區域表達的蛋白質或其片段(如對癌癥治療時)、變應原、或者傳染性因子的部分(如病毒或細菌)。術語“疫苗”指具體類型的免疫處理。其中，生物活性材料是一種傳染性因子(或其任何部分)，給予哺乳動物這種疫苗時，可使該動物對由這類因子引起的傳染性疾病產生抵抗力。疫苗可包括病毒、細菌和寄生物、病毒粒子和/或病毒或傳染性疾病因子或病原體的任何部分，也包括可能是免疫原性的、因此可用在疫苗制劑中的蛋白質和/或核酸。
另一方面，本發明還包括在細胞轉化過程中有用的得自病毒、細菌和酵母的載體。這些載體可以用于基因治療以及分子生物學和遺傳工程。在最佳方面，術語“敏感性生物制品”還包括任何病毒、原核和真核細胞以及某些小型多細胞標本。
“泡沫形成保存法”指使生物制品在環境溫度和更高的溫度下可延長保持活性或生存能力的時間的條件下，通過真空沸騰處理使敏感性生物制品干燥的一種可量度方法。“泡沫形成保法”所包括的具體的方法學上的局限性詳述如下，包括兩部分，(1)初級泡沫干燥處理和(2)穩定性干燥/玻璃化處理，這些公開在Bronshtein的美國專利號5,766,520中。
本發明中使用的術語“修飾的非還原性單糖”指糖的一般等級。修飾可以是任何已知的化學修飾，優選的是甲基化、乙基化和氯化的衍生物。甲基化衍生物包括α和β形式的單糖類。因而使用術語“甲基(α或β)葡萄糖”。在幾個實施例中，使用了一種特定的修飾的非還原性單糖甲基α-d-吡喃葡糖苷，此化合物的縮寫形式為MAG。B.生物材料的保存以提高溫度的方法對生物標本的脫水可能是非常有破壞性的，尤其是例如當干燥處理溫度高于適宜的蛋白質變性溫度時。為了保護樣品不受到與提高溫度有關的破壞作用，可逐步進行脫水過程，或者同時增加脫水的溫度和程度。初步脫水應在足夠低的溫度下進行，以不喪失生物制品的活性。本發明使用的保存方法是Bronshtein在美國專利號5,766,520中和未授權的美國專利申請第08/979,458、09/306,137、09/589,381、09/194,499和09/254,563號以及未授權的美國臨時申請的60/149,795、60/166,928和60/161,204號中所公開的方法，本文將這些文獻的公開內容整體納入作為參考。
在本發明的優選模式中，根據以下標準選擇干燥處理參數，可以使病毒或細胞在脫水期間最大程度地保留其生物活性或生存能力(1)將保護性化學品加載到病毒或細胞中，使脫水的內部和外部分子、外殼、包膜、和其它生物結構的保護達到最優化；(2)使病毒或細胞在含有滲透性保護劑的加載溶液中保持平衡狀態而實現加載要求；(3)最佳使加載了保護劑的病毒或細胞的玻璃化轉變溫度提高到理想的環境保存溫度和/或輸送溫度之上；和(4)病毒或細胞與保護劑的混合制劑在干燥處理和隨后的保存期間較佳至少有一部分維持在非晶化狀態。
保護性制劑在本領域已知有各種多元醇和聚合物都可以用作保護劑，只要它們可提高生物活性材料耐受干燥和貯存的能力并且不干擾其特定的生物活性。實際上，除了可使生物材料在脫水過程中保持穩定外，保護劑分子還可在保存期間提供其它優點(參見下文，即有助于產生力學上穩定的泡沫)。具體而言，本發明的保護劑可包括但不限于簡單的糖類(如蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、木酮糖、核糖、甘露糖、果糖、棉子糖和海藻糖)、單糖的各種非還原性衍生物和其它碳水化合物的衍生物、糖醇如山梨糖醇、合成的聚合物(如聚乙二醇、羥乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺和聚乙烯胺)、糖的共聚物〔如FICOLL和葡聚糖(Dextran)〕和它們的混合物。低分子量、高度可溶的蛋白質也可用作保護劑。
在本發明的一個最佳變動中，當受保護的材料是細胞、病毒、病毒粒子和/或病毒性和非病毒性載體時，該保護性組合物還可含有低分子量糖、二糖、寡糖和包括生物聚合物在內的聚合物的混合物。在脫水過程中，低分子量糖可滲透到細胞內，并保護胞內的結構。低分子量的可滲透性糖可從大量的在中性或更高pH下是非還原性的酮糖或者甲基化或乙基化的單糖中選擇。非還原性酮糖包括六碳糖果糖、山梨糖和阿洛酮糖；五碳糖核酮糖和木酮糖；四碳糖赤蘚酮糖；和三碳糖1，3-二羥基二甲(基)酮。甲基化單糖是α和β形式的吡喃葡糖苷、吡喃甘露糖苷和吡喃半乳糖苷。二糖如蔗糖已知是晾曬干燥過程中的有效保護劑，因為它可取代生物膜和大分子表面上的水合作用的水。此外，在真空中干燥處理時，也可有效地將蔗糖和/或其它填充物轉化成由濃縮糖的薄層非晶形膜組成的穩定性泡沫。
將單糖與二糖和寡糖混合可有效地防止在脫水過程中寡糖形成結晶。此外，可使用聚合物來增加脫水的混合物的玻璃化轉變溫度(Tg)，這種溫度可能會因為低分子量單糖的加入而下降。可使用任何可溶解在濃的糖溶液中的生物聚合物。例如，多糖〔如FICOLL和葡聚糖(Dextran)〕、合成的聚合物(如羥乙基淀粉、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺)，以及高度可溶的天然的和合成的生物聚合物(如蛋白質)將有助于穩定生物膜并增加Tg。
已知一些糖、糖醇和氨基酸如谷氨酸鈉(MSG)都具有在干燥處理和隨后的保存過程中保護生物制品不受破壞的能力。有幾篇出版物可證明二糖如蔗糖或海藻糖對生物大分子和膜細胞具有強大的保護作用。一些研究者在凍干過程中使用含有單糖(如葡萄糖、果糖等)或低分子量糖醇(甘露糖醇、山梨糖醇等)的較為復雜的混合物來保護細胞。與二糖不同，低分子量糖和它們的衍生物能更好地滲入細胞內部以形成細胞內的保護作用。因此，單糖和低分子量糖醇已被廣泛應用于保護劑配方中以保護細胞和病毒不受脫水作用的破壞。
含有還原性單糖的保存用溶液在干燥處理后的保存期間可破壞敏感的酶，并且破壞的速率隨著保存溫度的增加而快速增加(見下文實施例1)。因此，目前假定還原性單糖僅可用在于4℃以下保存的凍干標本的例子中。或者，當生物樣品在室溫或更高的溫度下貯存時，可選擇使用其中的保護劑的還原力最小的保護性制劑。在本發明的最佳模式中，糖類的還原性基團都已被甲基化，以增強其保護作用。根據本發明，也可使單糖的還原性基團乙基化等。
低分子量碳水化合物類添加劑可使保護性制劑中的細胞或病毒懸浮液的玻璃化轉變溫度(Tg)下降。例如，無水果糖的Tg接近7℃；1∶1的果糖∶蔗糖混合物在無水狀態下時的Tg稍微低于40℃。葡萄糖的Tg要高得多。因此，使用葡萄糖衍生物可能更有效。例如，甲基化葡萄糖的Tg是29℃(圖4)。
保存用溶液中的低分子量添加劑的增塑效果可能會由于使用在無水狀態下可增加Tg的可溶性較高分子量添加劑而被部分抵消。根據本發明的一個優選的實施例，保護性制劑含有MSG、非還原性寡糖和可溶的蛋白質。在本專利申請的范圍內，我們將-20℃到+50℃的溫度定義為環境溫度，以廣泛地涵蓋最大范圍的實際用途。但是，較佳的是，本申請中公開的方法和制劑是針對在室溫(20-25℃)或以上的溫度下貯存和/或運送的生物分子、病毒和細胞的保存。
出乎意料的是，含有甲基化單糖的保護性制劑在保護病毒和細胞方面特別有效。例如，α-甲基葡萄糖(甲基α-d-吡喃葡糖苷)在保存經干燥處理的敏感性生物制品方面已被證明具有獨特的保護特征。這可能是由于甲基比該分子中的其余部分更具有疏水性的緣故。因此，甲基化糖具有一些兩性分子的行為，可優先被吸附到蛋白質、病毒包膜和其它細胞膜結構的疏水性區域。這種行為可部分解釋甲基化葡萄糖的保護作用。此外，很可能能夠加載葡萄糖的細胞，也有可能加載α-甲基葡萄糖，以便形成在胞內的保護作用。實際上，已廣泛使用α-甲基葡萄糖來研究葡萄糖的跨膜轉運。現有技術還未使用過甲基化單糖來保存干燥狀態的生物樣品。
可惜的是，α-甲基葡萄糖的水溶液在干燥處理過程會形成結晶。因此，α-甲基葡萄糖應與其它填充物〔即蔗糖、海藻糖、麥芽糖精、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蛋白質等〕一起使用，以盡量減少α-甲基葡萄糖形成結晶，并在干燥處理和隨后的貯存期間提高非結晶狀態的穩定性。例如，如實施例3所討論和顯示，蔗糖/α-甲基葡萄糖溶液在干燥處理期間形成結晶的可能性依賴于蔗糖/α-甲基葡萄糖的質量比。此外，在含有α-甲基葡萄糖的保護性制劑中加入分子量較高的添加劑，將會提高Tg在干燥狀態下可達到的值。
初級發泡干燥處理為了易于進行大規模的加工操作，泡沫形成保存法涉及通過真空沸騰處理形成力學上穩定的多孔結構。在-15℃到70℃溫度范圍進行干燥處理步驟。在一個優選的實施例中，初級干燥處理步驟中的樣品溫度小于或等于約5℃。泡沫形成保存法在玻璃化處理之前特別適用于大樣品量的有效干燥處理，并且可作為制備適合商業用途的易于磨碎的干燥產品的一種輔助手段。發泡干燥處理的一個優點是該方法可進行規模化加工。例如，該方法可應用于幾毫升(分析和最優化操作)到幾百升(工業規模生產)含有敏感性生物活性材料的任何體積的溶液或懸浮液的保存。在Bronshtein的美國專利第5,766,520和6,306,345號中對于泡沫形成保存法有更詳細的描述。
在本發明中所作的變動是，在真空中進行發泡干燥處理之前，可以先部分除去水分，使稀的生物樣品濃縮。這一初級濃縮步驟可在將樣品注入處理室之前或之后進行，取決于所選擇的濃縮方法。在需要增加生物活性材料的濃度的情況中，預期可用在初級濃縮處理的方法包括凍干、從液態或部分凍干狀態中蒸發、反向滲透、其它膜技術或本領域中已知的任何其它各種濃縮方法。
將樣品放在真空中，使它們在大大低于100℃的溫度下沸騰進行干燥處理。當對含有生物活性材料的溶液或懸浮液使用減壓時，該溶液或懸浮液就會發生沸騰而產生泡沫，在形成泡沫的過程中，溶劑會被進一步排除，最終形成力學上穩定的開放孔或封閉孔的多孔狀泡沫。該力學上穩定的多孔狀結構或泡沫是由濃縮的填充物組成的薄的無晶形薄膜的形成。
進行沸騰步驟中的真空較佳是0-10Torr，最佳小于約4Torr。本文中沸騰處理指含有水蒸氣而不是空氣或其它氣體的成核作用和氣泡生長。實際上，在某些溶液中，通過在室溫下使用低真空(約0.1-0.9大氣壓)驅除溶解的氣體可能是有利的。這種“脫氣處理”可能有助于防止溶液噴出干燥處理容器。
穩定性干燥/玻璃化處理使初級干燥處理形成的力學上穩定的泡沫在提高溫度的條件下進行次級干燥處理或稱“穩定性”干燥處理。由于玻璃化轉變溫度(Tg)取決于樣品中的水含量，并且Tg隨著脫水程度的增加而增加，所以可根據所需的貯存溫度采用不同的穩定性干燥處理方案，以產生與玻璃化(即形成固態無晶形玻璃)一致的Tg。但是，因為材料一旦進入玻璃狀態，在事實上就不可能進行脫水處理，所以在可能是理想的環境貯存溫度時，本發明玻璃化處理的關鍵，是在明顯高于環境溫度的溫度下進行穩定性干燥處理。
最終的貯存溫度較佳為0-70℃。更佳的是，通常的貯存溫度選擇是大于或等于0、4、20、40和50℃。在有些情況下，可能優選冷卻貯存時，可在室溫中進行穩定性干燥處理，隨后冷卻至貯存溫度或以下。但是，在其它的例子中，當需要在室溫中保持穩定時，就應使用高于室溫的溫度進行脫水處理，接著冷卻至室溫。
對于任何要保存的具體標本，該標本的性質和穩定性特性將決定它在初級干燥處理步驟中所能承受的最大溫度。據酶保存的例子顯示，在室溫下進行初級干燥處理后，其穩定性干燥處理的溫度可提高到50℃而酶的活性不會喪失。然后，可在更高的溫度中繼續進行的穩定性干燥過程中進行脫水處理。從而，通過連續的或逐步的增加脫水處理的溫度，就可將不穩定的蛋白質保存在大大高于它們的變性溫度的溫度中而保持熱穩定狀態。
除了在高于所選擇的貯存溫度的溫度下進行穩定性干燥處理外，關鍵的問題是這種干燥處理要進行足夠長的時間，以確實將Tg提高到貯存溫度之上。從10μl 15％蔗糖+15％棉子糖溶液液滴進行干燥處理獲得的經驗結果可以證明，為了將Tg提高至25℃以上，就要在70℃以上進行穩定性干燥處理12小時以上。在這些實驗中的初級干燥處理是在室溫下(20℃)進行12小時。結果表明，為了有效將Tg提高至室溫以上，可能需要延長穩定性干燥處理的時間(在70℃要超過12小時，在50℃要超過60小時)。對于一些不是熱不穩定性的生物材料，在較高溫度下進行的初級干燥處理將使為增加Tg至所選擇的貯存溫度之上而需要的在更高的溫度下進行的穩定性干燥處理的時間減少。
在本發明的一個實施例中，使從穩定性干燥處理所獲得的泡沫冷卻至研磨溫度，經研磨后，將所獲得的粉末在真空中或在大氣壓下進行次級干燥處理。隨后的干燥處理溫度范圍為0-100℃。這種干燥處理可繼續進行，直到玻璃化轉變溫度提高到約0-70℃范圍中所選擇的貯存溫度之上。
為了確保Tg事實上大于貯存溫度，已知至少有兩種方法可進行熱量分析以評估Tg。示差掃描量熱法(DSC)是最常用的技術。但是，本發明者已發現，用DSC測量含有聚合物的樣品中的Tg方面可能并不可靠。另一種方法是熱刺激偏振法(TSP)，特別適用于對聚合物的分析。TSP法是優選的，因為它對所有的樣品都是可靠的，不過它需要的樣品量較大。
下面的一些實施例闡明了本發明的各種特殊方面，涉及含有病毒或細胞與保護劑的保存用混合物，其中，這類混合物適用于使這些樣品在脫水處理和隨后的在環境溫度或更高的溫度下的貯存過程中保持穩定化。
實施例1——研究在室溫和37℃貯存期間還原性和非還原性糖和PVP對異檸檬酸脫氫酶(ICDH)的影響。此實驗的設計是為了測試添加劑如糖的還原能力。這種還原作用是以產生美拉德反應或酶褐變反應的能力來鑒定。對于單糖或簡單的糖，C鍵上的糖羥基或OH易于與含有NH或NH2的氨基酸殘基如賴氨酸、天冬酰胺發生化學反應。
ICDH酶由供應廠商配制成50％的甘油制劑。使用下述保存用溶液(1)30％蔗糖+10％PVP溶液；(2)20％葡萄糖+20％PVP溶液；(3)20％果糖+20％PVP溶液；和(4)20％甲基α-d-吡喃葡糖苷+10％PVP溶液。
在15-17℃使ICDH(200μl)在冷的0.1M Tris HCl中透析5小時。緩緩攪拌該緩沖液，使小分子均勻地分散在溶液中。透析后，將ICDH(總體積為180μl)轉移到1.7ml微離心管中，在該管中加入250μl、0.1M的Tris HCl緩沖液(pH7.8)。將該管放在冰上。
分別將上述4種不同的保存用溶液之一加到ICDH中后，將所得的ICDH溶液(100μl等分試樣)保存在1.7ml微離心管中。這些保存用混合物經攪勻，將其等分至40個試管中，每管10μl。在零時間點檢測四種不同的保存用混合物中每一種的一份樣品。剩余的樣品以室溫在真空中干燥處理過夜。經干燥處理后，檢測各保存用混合物的另一份樣品。將余下的樣品分成兩組，一組在室溫下貯存，另一組在37℃貯存。每隔兩周檢測在各貯存溫度下的每種保存用混合物的一份樣品的活性。
用0.1M、pH7.8的Tris HCl稀釋所有要檢測的樣品至10倍，通過攪勻使它們混合。將各稀釋樣品(10μl)與3ml 0.1M、pH7.8的Tris HCl、10μl 10mM的MnSO4、10μl 50mM異檸檬酸鹽和10μl、10mM NADP+溶液混合一起培養。在340nm波長測量隨著時間變化的吸光度。以4厘米/分鐘的記錄紙速測定在20mV的吸光度變化評估其相對活性。結果顯示在
圖1A和1B中。
實施例2——研究在50℃貯存過程中還原過程和非還原性糖以及PVP對異檸檬酸脫氫酶(ICDH)的影響。設計此實驗是測試添加劑如糖的還原能力。這種還原過程的特性以產生美拉德反應或酶褐變反應的能力來鑒定。對于一些單糖或簡單的糖，C鍵上的糖羥基或OH易于與含有NH或NH2的氨基酸殘基如賴氨酸、天冬酰胺發生化學反應。
ICDH酶由供應廠商配制成50％的甘油制劑。使用下述保存用溶液(1)30％蔗糖+10％PVP的溶液；(2)20％葡萄糖+20％PVP的溶液；(3)20％果糖+20％PVP的溶液；和(4)20％甲基α-d-吡喃葡糖苷+10％PVP的溶液。
在15-17℃將ICDH(200μl)在冷的0.1M Tris HCl中透析5小時。輕微攪拌該緩沖液，使小分子均勻地分散在整個溶液中。透析后，將ICDH(總體積為180μl)轉移到1.7ml微離心管中，在該管中加入250μl、0.1M的Tris HCl緩沖液(pH7.8)。將該管放在冰上。
分別將上述4種不同的保存用溶液之一加到ICDH中后，將所得的ICDH溶液(100μl等分試樣)分別保存在各1.7ml微離心管中。這些保存用混合物經攪勻旋渦處理后，將其等分至40個試管中，每管10μl。在零時間點檢測四種不同的保存用混合物中每一種的一份樣品。剩余的樣品在室溫下真空中干燥處理過夜。干燥處理后，檢測各保存用混合物的另一樣品。在50℃保存余下的樣品。每隔兩周檢測每種保存用混合物的一份樣品的活性。
用0.1M、pH7.8的Tris HCl稀釋所有要檢測的樣品至10倍，通過旋渦處理使它們混合。將各份稀釋樣品(10μl)與3ml 0.1M、pH7.8的Tris HCl、10μl 10mM的MnSO4、10μl 50mM異檸檬酸鹽和10μl、10mM NADP+溶液混合一起培養。在340nm波長測量隨著時間變化的吸光度。以4厘米/分鐘的記錄紙速測定在20mV的吸光度的變化以評估其相對活性。結果顯示在圖2中。
實施例3——研究在50℃貯存過程中還原作用和非還原性糖以及麥芽糖精對異檸檬酸脫氫酶(ICDH)的影響。設計此實驗是測試添加劑如糖的還原能力。這種還原特性是以產生美拉德反應或酶褐變反應的能力來鑒定。對于一些單糖或簡單的糖，C鍵上的糖羥基或OH易于與含有NH或NH2的氨基酸殘基如賴氨酸、天冬酰胺發生化學反應。
ICDH酶由供應廠商配制成50％的甘油制劑。使用下述保存用溶液(1)30％蔗糖+10％麥芽糖精的溶液；(2)20％葡萄糖+20％麥芽糖精的溶液；(3)20％果糖+20％麥芽糖精的溶液；和(4)20％甲基α-d-吡喃葡糖苷+10％麥芽糖精的溶液。
在15-17℃使ICDH(200μl)在冷的0.1M Tris HCl中透析5小時。輕微攪拌該緩沖液，使小分子均勻地分散在整個溶液中。透析后，將ICDH(總體積為180μl)轉移到1.7ml微離心管中，在該管中加入250μl、0.1M的Tris HCl緩沖液(pH7.8)。將該管放在冰上。
在分別將上述4種不同的保存用溶液之一加到ICDH中后，將所得的ICDH溶液(100μl等分試樣)分別保存在各1.7ml微離心管中。這些保存用混合物經旋渦處理，然后將其等分至40個試管中，為每份10μl。在零時間點檢測四種不同的保存用混合物中每一種的一份樣品。使剩余的樣品在室溫下的真空中干燥處理過夜。干燥后，檢測各保存用混合物的另一份樣品。在50℃保存余下的樣品。每隔兩周檢測每種保存用混合物的一份樣品的活性。
用0.1M、pH7.8的Tris HCl稀釋所有要檢測的樣品至10倍，通過旋渦處理使它們混合。將各份稀釋樣品(10μl)與3ml 0.1M、pH7.8的Tris HCl、10μl 10mM的MnSO4、10μl 50mM異檸檬酸鹽和10μl、10mM NADP+溶液混合一起培養。在340nm波長測量隨著時間變化的吸光度。以4厘米/分鐘的記錄紙速測定在20mV的吸光度的變化以評估其相對活性。結果顯示在圖3中。
實施例4——為了測量甲基α-d-吡喃葡糖苷的玻璃化轉變溫度，將各種晶體密封在鋁皿中，用于DSC研究。樣品首先加熱熔化，然后使其迅速冷卻到-100℃。樣品在冷卻過程中形成玻璃化。在溫熱期間(10℃/分鐘)要測量玻璃化轉變溫度。如圖4中所示為從玻璃態到液態轉變相關的比熱變化Tg＝29℃。
實施例5——為了能夠評估各制劑在脫水處理和隨后的貯存過程中保持非晶形(玻璃)狀態的穩定性的能力，進行下述各項實驗。產品在結晶過程中可能發生損傷或者在玻璃態基質內裂解。結晶作用是在過飽和或過冷的溶液中發生的兩個步驟的過程。第一步是形成擬結晶相的穩定核的晶核化過程。晶核的形成在實驗上依賴于材料中的雜質。這些晶核的穩定化依賴于各種溶質或互溶質的溫度和濃度。第二步是通過晶體生長過程在晶核上形成結晶增長。這一步也依賴于各種材料中不同成分的溫度和濃度。當樣品被干燥到接近完全脫水狀態時(如果溶質晶體過程是純凈的)晶核形成最佳，如果粘度由于生長的固有動力學而降低時，則將會有利于晶體生長。
如下表中所示，在各成分間的質量比不同的各種化合物的溶解度范圍內，以總溶質占30-50％w/w的比例制備各種溶液。使用0.02μm Acrodisc過濾裝置過濾所有各份溶液。
如下述，將溶液滴在顯微鏡平板上，然后分別對其進行快速完全的干燥處理或緩慢而未完成的脫水過程。使用20μl移液管分別將10滴(每滴10μl)液滴加到經酒精清潔的各顯微鏡玻片上，每份樣品40滴。準備一組鋪有DRIERITE(干燥劑)層的盒子。將樣品玻片放到DRIERITE盒中，然后使用石蠟膜密封。測量晶體隨著時間形成的數量并做記錄。2周后，將樣品轉移到52％相對濕度(RH)環境〔經Mg(NO3)2飽和處理〕中。再次隨著時間測量晶體數量，并做記錄。結果列在表1-6中(下文)。
表150％蔗糖∶MSG液滴結晶過程
*DRIERITE**Mg(NO3)2
表250％蔗糖∶MSG液滴結晶過程(僅用Drierite)
表350％蔗糖∶肌醇液滴結晶過程
*DRIERITE**Mg(NO3)2表450％蔗糖∶甲基α-d-吡喃葡糖苷(MAG)液滴結晶過程
*DRIERITE**Mg(NO3)2
表550％MSG∶甲基α-d-吡喃葡糖苷(MAG)液滴結晶過程
*DRIERITE**Mg(NO3)2當使用50％MSG和甲基α-d-吡喃葡糖苷時，應注意的是，分別為40∶1和30∶1比率的溶液在室溫下貯存過夜后形成結晶(表5)。
根據表6(下文)所示的結果可以看出，50％的1∶10、1∶20、1∶30和1∶40的MSG∶海藻糖溶液在室溫下過夜而形成結晶。因而，這些制劑沒有用于液滴分析。
表650％MSG∶海藻糖也結晶(僅用Drierite)
實施例6——分別培育并收集牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)、年傳染性鼻氣管炎(IBR)病毒、牛病毒性腹瀉病毒(BVD)和副流感病毒3(PI3)。收集后，用穩定劑混合所得病毒，然后將其分散成大約40ml的等分試樣，在-80℃冰庫中冷凍直至使用。
在0.01M磷酸鹽緩沖液中配制下述70％w/w的各種保存用溶液，并用Corning0.22μm PES(聚醚砜)過濾系統進行無菌過濾(1)2∶1的蔗糖∶甲基α-d-吡喃葡糖苷；(2)6∶1蔗糖∶肌醇；(3)2∶1蔗糖∶異麥芽糖(isomalt)；(4)5∶2的蔗糖∶山梨糖醇；(5)海藻糖；(6)5∶2的蔗糖∶MSG。
所有各產品的制備都在18℃的房間中進行。從-80℃的冰庫中取出病毒，將其放到冷的自來水中解凍(大約1小時)。使用無菌技術，在無菌的50ml聚丙烯錐管中按確定的比例制備四種病毒的混合物。將2份無菌保存用溶液加到1份病毒混合物中。經旋渦處理獲得均質混合物。將2.4g病毒/保存用溶液混合物加載到無菌的30ml硼硅酸鹽玻璃血清瓶(Wheaton型)中。然后將無菌的13mm長的終止凍干塞子分別放到各瓶口的第一級上，使塞子上的槽口開放，以便在保存期間由泡沫形成而使水分蒸發。然后將瓶子放到金屬的干燥處理盤中。將這些盤子裝載到經過修改的預冷的(5℃)冷凍干燥器中，以進行泡沫形成保存法。將熱電偶放到在其中一個瓶子中，以監測干燥處理期間樣品的溫度。然后進行干燥處理。結束泡沫形成保存法后，在真空下塞好瓶子，然后從干燥器中取出。用鋁鋸片卷邊密封瓶子，在4℃保存。采用下述各種方法測試保存的樣品以及冷凍的對照樣品。
將Madin-Darby牛腎(MDBK)細胞維持在含有5％供體馬血清(JRH Biologicals)的Dulbecco改進的Eagle培養基(DMEM)中。該血清是抗體，并且不含有BVD、IBR、PI3和BRSV。從NVSL獲得下述病毒中和的血清，并將其應用于每一份疫苗的病毒滴定BVDV抗血清NVSL批號4X；PI3抗血清NVSL批號86.2；IBRV抗血清NVSL批號10X；和BRSV抗血清NVSL批號88.5X。
通過使用經病毒特異性抗血清中和其它三部分的4-聯疫苗對BRSV、IBR、BVD和PI3各樣品每一份進行病毒滴定。用胰蛋白酶-EDTA(批號#7B2028，JRHBioscience)取出培育在490cm2搖瓶中的MDBK細胞的培養物，以1.5×105細胞/毫升的密度將其懸浮在DMEM+5％馬血清中。在96孔平板中每孔接種200μl的細胞懸浮液。該微滴定板培育過夜，一般在第二天當細胞匯后成單層約鋪滿80％時進行病毒滴定。
每瓶保存的病毒(4-聯疫苗)用15.5ml DMEM再水合還原成溶液。將此溶液作為10-0稀釋液。將4瓶分別再水合的疫苗混合，用于病毒滴定。對照病毒是冷凍的病毒。取得0.1ml的再水合疫苗樣品，將其加到無菌的含有其它三種病毒各自的抗血清的1ml小瓶中，每種抗血清有0.3ml。例如，如果滴定BVD，則將0.1ml的疫苗加到含有0.3ml抗IBR血清、0.3ml抗BRSV血清和0.3ml抗PI3血清的小瓶中。此階段的總體積是1.0ml，病毒稀釋度為10-1。室溫下培育該混合物40分鐘。
將22μl中和的(10-1)樣品加到96孔平板第一排的孔(200μl)中，制備稀釋成10倍的病毒液。混合各孔的溶液(這是10-2稀釋度)，然后取22μl轉移到第二排，依次類推，直至最后一排。在第1到第10列進行病毒滴定。第11和12列留作未感染的細胞對照組。在37℃、在5％的CO2境中培育該平板4天。據致細胞致病作用(CPE)變化讀數測定病毒的感染情況。最后，使用Reed-Muench法計算病毒效價。記錄從各對照病毒和保存的各種疫苗獲得的4種病毒的效價，比較保存期間病毒的損失情況。結果列在表7中，兩份數據表示重復實驗的結果。
表7甲基α-d-吡喃葡糖苷和糖醇對保存BRSV、IBR、BVD和PI3病毒的保護效果
實施例7——分別培育并收集新城疫病毒和支氣管炎病毒。收集后，用穩定劑混合所得病毒，然后將其分配成大約200ml的等分試樣，然后在-80℃冷庫中冷凍直至使用。
在0.01M磷酸鹽緩沖液中配制下述70％w/w的各種保存用溶液，并用Corning0.22μm PES(聚醚砜)濾器系統無菌過濾(1)2∶1的蔗糖甲基α-d-吡喃葡糖苷；(2)4∶1蔗糖∶MSG；(3)4∶1蔗糖∶麥芽糖醇；(4)13∶1的蔗糖∶甘露糖醇。
所有的產品制備工作都在18℃的房間中進行。從-80℃的冷庫中取出病毒，將其放到冷的自來水中解凍(大約2小時)。使用無菌技術，在無菌的50ml聚丙烯錐形管中制備1∶1的兩種病毒的混合物。將2份無菌保存用溶液加到1份病毒混合物中。經旋渦處理獲得均質的混合物。每份病毒/保存用溶液混合物取3.0g加載到無菌的30ml硼硅酸鹽玻璃血清瓶(Wheaton型)中。然后將無菌的13mm長的終止凍干塞子的第一級塞入到各瓶子口中，使瓶塞上的槽口開放，以使保存期間泡沫形成時的水分蒸發。然后將瓶子放到金屬干燥處理盤中。將這些盤子疊放到經修改成可執行本發明的泡沫形成保存法的預冷的(5℃)冷凍干燥器中。將熱電偶放到其中的一個瓶子中，以監測干燥處理期間樣品的溫度。保存結束后，在真空下塞好瓶子，然后從干燥器中取出。用鋁片卷邊封蓋密封瓶子，在室溫或4℃下保存根據進行干燥處理的Td值而定(即如果Td＝30℃，樣品在室溫下保存；如果Td＝20℃，則冷藏保存樣品)。
如上述實施例6所述檢測病毒效價。單項實驗的結果列在表8中。
表8甲基α-d-吡喃葡糖苷和糖醇對保存新城疫病毒和支氣管炎病毒的保護效果
實施例8——對于馬鏈球菌的保存，要用0.01M磷酸鹽緩沖液配制下述70％w/w的各種保存用溶液，并用Corning 0.22μm PES(聚醚砜)過濾器無菌過濾(1)4∶1的蔗糖∶甲基α-d-吡喃葡糖苷；(2)1∶1蔗糖∶甲基α-d-吡喃葡糖苷；(3)5∶2蔗糖∶谷氨酸鹽。
從-80℃冷庫中取出一瓶冷的種子原液(批號WS012696)，然后在冷水中解凍。將全部內容物(1.0ml)轉移到150ml“馬鏈球菌生長培養基”(批號0757)中。根據制劑的重量，在每升該培養基中加入20g 50％的右旋糖。將瓶塞松開，放在37℃下的100rpm的搖床上培育大約20-24小時。使該培養物生長至其600nm波長的光密度(OD)達到0.8-1.5(～12小時)。用接種環挑一環培養物接種到TSA II+5％血瓊脂(批號K1RUWW)上作純菌劃線培養。在37℃培育24-48小時后，檢測平板，沒有檢測到污染情況。
培育大約23.5小時后，將10ml預培養物轉移到含有250ml生長培養基的500ml燒瓶中。在先前所述的條件下培育該預培養物約4小時。再作純菌劃線接種到TSAII+5％血瓊脂上。在37℃培育24-48小時后，檢測該平板，并未發現有污染情況。在600nm波長測量該預培養物的吸光度是1.888。
大約5小時后，將第二份預培養物50ml接種到含有100ml馬鏈球菌的肉湯+右旋糖的發酵罐中。發酵的條件是以為1升/分鐘的條件通入加壓氧氣、攪拌速率為100rpm，在37℃溫度下用2.5N HCl和2.5N NaOH調節pH值。
一旦培養物達到穩定狀態，即以1∶1的重量比例混合該細胞培養物和保存用溶液。經旋渦處理得到均質的混合物。每份病毒/保存用溶液混合物取1.0g，將其加載到無菌的10ml硼硅酸鹽玻璃血清瓶(Wheaton型)中。然后用無菌的13mm長的終止凍干塞子分別將其第一級塞入各瓶子口中，使瓶塞上槽口開放，以使保存期間的水分蒸發。然后將瓶子放到金屬干燥處理盤中。將這些盤子放到經修改以執行泡沫干燥方法的預冷的(5℃)冷凍干燥器中。將熱電偶放入其中的一個瓶子中，以監測干燥處理期間樣品的溫度。保存結束后，在真空下塞好瓶子，然后從干燥器中取出。用鋁質卷邊封蓋密封瓶子，在室溫保存。
用PBS將各對照樣品的等分試樣(1g)(細胞培養物+保存用溶液)稀釋10倍。用10ml PBS再水合用血瓊脂分別制備3個10-5-10-6的涂布平板。各份保存的細胞的樣品瓶。進一步將各份對照的和保存的樣品稀釋到10-4和10-5。用分別制備3個涂布10-5和10-6用血瓊脂分別制備3個10-5-10-6的涂布平板上。在37℃培育這些平板48小時。分別計算各平板上形成的菌落數。使用產生30-300個菌落的平板計算每毫升中菌落形的單位(CFU/ml)。然后將保存樣品的CFU/ml除以對照樣品(細胞培養物)的CFU/ml，以計算保存后的存活％。結果列在圖5中。
實施例9——分別培育并收集牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)、牛傳染性鼻氣管炎(IBR)病毒、牛病毒性腹瀉病毒(BVD)和副流感病毒3(PI3)。收集后，用穩定劑混合所得病毒，然后將其分配成若干大約40ml的等分試樣，然后在-80℃冷庫中冷凍直至使用。
用0.01M磷酸鹽緩沖液配制下述70％w/w的各種保存用溶液，并用Corning(康寧)0.22μm PES(聚醚砜)過濾器系列(Filter Systems)無菌過濾(1)2∶1的蔗糖∶甲基α-d-吡喃葡糖苷；(2)4∶1蔗糖∶甲基α-d-吡喃葡糖苷；(6)5∶2的蔗糖∶棉子糖。
所有的產品制備工作都在18℃的房間中進行。從-80℃的冷庫中取出病毒，將其放到冷的自來水中解凍(大約1小時)。使用無菌技術，在無菌的一組50ml聚丙烯錐形管中，按預定比例制備四種病毒的混合物。將2份無菌保存用溶液加到1份病毒混合物中。經旋渦處理獲得均質的混合物。將各份病毒/保存用溶液混合物分別取2.4g加載到一組無菌的30ml硼硅酸鹽玻璃血清瓶(Wheaton型)中。然后將無菌的13mm長的終止凍干塞子的第一級放入各瓶子口中，使瓶塞上的槽口開放，以使保存期間泡沫形成時的水分能夠蒸發。然后將瓶子放到金屬干燥處理盤中。將這些盤子放到經修改可進行泡沫形成保存法的預冷的(5℃)冷凍干燥器中。將熱電偶放入一個瓶子其中的中，以監測干燥處理期間樣品的溫度。然后進行干燥處理。泡沫形成保存法結束后，在真空下塞好瓶子，然后從干燥器中取出。用鋁質卷邊封蓋密封瓶子，然后在4℃保存。采用下述條件方法評估各份保存的樣品以及冷凍的對照樣品。
將Madin-Darby牛腎(MDBK)細胞維持在含有5％供體馬血清(JRH Biologicals)的Dulbecco改進的Eagle培養基中。該血清是抗體，并且不含有BVD、IBR、PI3和BRSV。從NVSL獲得下述條件病毒中和的血清，并將其應用于每人疫苗的病毒滴定中BVDV抗血清NVSL批號4X；PI3抗血清NVSL批號86.2；IBRV抗血清NVSL批號10X；和BRSV抗血清NVSL批號88.5X。
通過使用經病毒特異性抗血清中和其它三部分的4-聯疫苗來對BRSV、IBR、BVD和PI3的各部分樣品進行病毒滴定。用胰蛋白酶-EDTA(批號#7B2028，JRHBioscience)取出培育在490cm2搖瓶中的MDBK細胞的培養物，以1.5×105細胞/毫升的密度將其懸浮在DMEM+5％馬血清中。在一組96孔平板中每孔接種200μl的細胞懸浮液。過夜培育各該微滴定板，第二天當細胞匯合成單層約鋪滿80％時進行病毒滴定。
使用15.5ml DMEM再水合每瓶保存的病毒(4-聯疫苗)。將此溶液作為10-0稀釋液。將4瓶分別再水合的疫苗混合，用于病毒滴定。對照病毒是各份冷凍的病毒。取得0.1ml的再水合的疫苗樣品，將其加到無菌的含有其它三種病毒各自的抗血清的1ml小瓶中，每種抗血清有0.3ml。例如，如果滴定BVD，則將0.1ml的疫苗加到含有0.3ml抗IBR血清、0.3ml抗BRSV血清和0.3ml抗PI3血清的小瓶中。此階段的總體積是1.0ml，病毒稀釋度為10-1。室溫下培育該混合物40分鐘。
分別將22μl中和的(10-1)樣品加到一組96孔平板第一排的孔(200μl)中，制備稀釋了10倍的病毒液。混合各孔的溶液(這是10-2稀釋度)，然后取22μl轉移到第二排，依次類推，直至最后一排。對第1到第10列進行病毒滴定。第11和12列鹵作未感染的細胞對照組。在37℃、在5％的CO2環境中培育各份平板4天。以細胞致病作用(CPE)讀數測定病毒的感染情況。最后，使用Reed-Muench法計算病毒效價。記錄從對照病毒和保存的疫苗獲得的4種病毒的效價，比較保存期間病毒的損失情況。結果列在表9中。
表9
實施例10——制備懸浮在全氟萘烷中的熒光素酶(Sigma#L-9560)的保存用制劑并測試其穩定性。用含有1mg/ml BSA的1ml 0.1M、pH7.4的Tris緩沖液溶解凍干的熒光素酶(1mg)。在4℃，在含有1mg/ml BSA的500ml 0.1M、pH7.4的Tris緩沖液中透析所得的1mg/ml熒光素酶溶液3.5小時。將經透析的熒光素酶轉移到微離心管中，使用下述方程測算該熒光素酶的濃度熒光素酶濃度＝初始的熒光素酶(μg)/透析后的熒光素酶的最終體積(ml)將500μl、1μ/μl經透析的熒光素酶和99.5g、50％的10∶1的蔗糖∶MSG保存用溶液混合制備保存用混合物。然后將這些保存用混合物稱重分別，加到9個無菌的100ml血清瓶中，每瓶10±0.05g。將剩余的經透析的熒光素酶等分裝到20個微離心管中，每管20μg，在-80℃保存，以進一步用作標準的熒光素酶。在20℃干燥處理該保存用混合物4.5小時，然后在45℃干燥處理60小時、60℃干燥處理8小時、65℃干燥處理16.5小時。然后各份樣品瓶在真空中加上塞。將這些瓶子轉移到干燥的房間中(環境相對濕度～14％)。再將各瓶子開啟，將其中的泡沫刮到無菌的研磨瓶中，將泡沫磨碎，再將所得的粉末稱重加到無菌小瓶中，每瓶1.07-1.11g。然后在各瓶中加入2ml全氟萘烷(Aldrich#p-990-0)，并在干燥環境空氣中塞上瓶塞，然后轉移到37℃的恒溫箱中。
將熒光素酶檢測試劑和含有1mg/ml BSA的PBS放在室溫(RT)下使之平衡至少30分鐘。將9.42ml含有1mg/ml的BSA的PBS加到研磨好的樣品(1μg/ml)中，然后攪拌混和。使用此溶液1μg/ml按10倍系數制備系列稀釋液，得到最終濃度為1×10-5μg/ml。混合100μl室溫(RT)熒光素酶檢測試劑和20μl稀釋的熒光素酶，制備反應混合物。將該反應混合物放到光度計中，每10秒鐘測量所產生的光，共測1分鐘。以每秒鐘的相對光單位(RLU/s)對相對酶濃度(μg/ml)作曲線圖。
每次測量在全氟萘烷中的研磨的熒光素酶樣品的同時，要測量標準的熒光素酶樣品作為對照。首先用10ml熒光素酶檢測緩沖液溶解1瓶熒光素酶檢測物質，使其在室溫下平衡至少30分鐘，進行標準熒光素酶檢測。制備混合100μl室溫(RT)熒光素酶檢測試劑和20μl稀釋的熒光素酶，制備反應混合物。將該反應混合物放到光度計中，每10秒鐘測量所產生的光，共測1分鐘。以每秒鐘的相對光單位(RLU/s)對相對酶濃度(μg/ml)作曲線圖。然后比較過氟十氫萘中的研磨的熒光素酶與標準熒光素酶的活性。結果顯示在圖6中。
實施例11——使用對嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)特定的標準方法在兩升容量的發酵罐中培育該菌菌株。該發酵罐細胞的群落計數為8.10.73×108。離心收集細胞，得到200ml群落數為7.830.75×109的細胞富集體。將該細胞富集體稀釋在由800ml的40％蔗糖、10％甲基α-d-吡喃葡糖苷在50％緩沖液(w/w)中的溶液組成的保存用溶液中。將所得的混合物300ml注入聚乙烯Petri培養皿袋中。余下部分保存起來，另有他用。用位于由鋁架支持的4.5×19英寸圓柱形玻璃小室內的夾具夾住空的聚乙烯袋。此玻璃室用作進行泡沫形成保存法過程的大批量干燥處理用小室。借助于聚硅酮管的長度，將測試溶液充填到該聚乙烯袋中。也可沿著整個管的長度給該玻璃室外部安裝一層玻璃的水夾套。該夾套與再循環的可控溫度的水浴器相連接。該水夾套可在操作過程提供熱源。該玻璃室在流出端連接到凍干機的冷凝器上。在通過形成泡沫而實現保存的方法結束時，加入干燥氮氣解除真空狀態。取出該袋子進行檢測。可清楚看到其中已產生了干燥的、力學上穩定的易碎的泡沫。用手輕輕揉壓該材料，就可將其壓碎成具有沙子質感的碎粒。割開該袋子，將其中的內容物轉移到干凈的容器中。分3次抽取該容器中的樣品。然后將干燥氮氣吹入該容器中，將其密封。培育該樣品，并將所得的細胞群落與采用相同的方法在10ml小瓶中經泡沫干燥的1ml的干燥嗜酸乳桿菌的對照培養物進行比較。證明受測試細菌菌株的存活情況的結果列在表10中。
表10
對于本領域的熟練技術人員來說，根據本文所述的本發明的一系列技術對本發明各項實施方式按上述模式進行的修改是顯而易見的。上述各實施例并不具有約束性，而僅僅是作為本發明的范例，其范圍須由下述的權利要求予以限定。
權利要求
1.一種保存用混合物，它含有在干燥和在環境溫度或更高溫度下貯存過程中對生存能力的喪失敏感的病毒、細菌或其它細胞；非還原性的甲基化單糖；和從非還原性二糖、非還原性寡糖、二糖的非還原性衍生物、寡糖的非還原性衍生物、蛋白質、高分子保護劑和谷氨酸鈉(MSG)中選出的至少一種補充保護劑。
2.如權利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，該保存用混合物具有總的溶質質量，并且所述非還原性甲基化單糖約占該總溶質質量的5-80wt％。
3.如權利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，所述非還原性甲基化單糖約占該總溶質質量的20-60wt％。
4.如權利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，所述非還原性甲基化單糖是甲基(α或β)-d-葡萄糖。
5.如權利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，所述非還原性二糖是蔗糖或海藻糖。
6.如權利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，所述蛋白質選自明膠、白蛋白、乳清白蛋白或球蛋白和應激蛋白。
7.如權利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，所述高分子保護劑是HES、PVP、環糊精和PEG。
8.如權利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，所述蛋白質可以是在溫度約大于50℃、pH約高于9或約小于5的水性介質中穩定的任何蛋白質。
9.如權利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，所述蛋白質的濃度約大于3wt％。
10.如權利要求9所述的保存用混合物，其特征在于，所述蛋白質的濃度約大于10wt％。
11.如權利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，該混合物具有總的溶質質量，并且混合物中的MSG約占該總溶質質量的5-80wt％。
12.如權利要求11所述的保存用混合物，其特征在于，所述MSG約占該總溶質質量的20-60wt％。
13.如權利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，該混合物具有總的溶質質量，并且所述非還原性二糖約占該總溶質質量的5-80wt％。
14.如權利要求13所述的保存用混合物，其特征在于，所述非還原性二糖約占該總溶質質量的20-60wt％。
15.如權利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，該混合物具有總的溶質質量，并且所述非還原性寡糖約占該總溶質質量的5-80wt％。
16.如權利要求15所述的保存用混合物，其特征在于，所述非還原性寡糖約占該總溶質質量的20-60wt％。
17.如權利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，所述寡糖不是棉子糖。
18.如權利要求1所述的保存用混合物，其特征在于，配制的該混合物在干燥和隨后的至少兩周的貯存期間不結晶。
19.一種保存在干燥和在環境溫度或更高的溫度下貯存過程中對生存能力的喪失具有敏感性的病毒、細菌或其它細胞的方法，它包括將病毒、細菌或其它細胞與保護劑混合，形成保存用混合物，所述保護劑含有非還原性甲基化的單糖和從非還原性二糖、非還原性寡糖、二糖的非還原性衍生物、寡糖的非還原性衍生物、蛋白質、高分子保護劑和谷氨酸鈉(MSG)中選出的至少一種補充化合物；然后干燥該保存用混合物，其中，在干燥處理和隨后的在環境溫度或較高貯存溫度下保存過程中，所述病毒、細菌或其它細胞至少保留了一部分生存能力。
20.如權利要求19所述的方法，其特征在于，所述病毒、細菌或其它細胞還含有疫苗或載體。
21.如權利要求19所述的方法，其特征在于，所述甲基化單糖是甲基(α或β)-d-葡萄糖。
22.如權利要求21所述的方法，其特征在于，所述干燥方法包括凍干、晾干、噴霧干燥、流化床干燥、真空干燥、在干燥氣體中干燥和發泡干燥。
23.如權利要求19所述的方法，其特征在于，所述保存用混合物具有總的溶質質量，所述非還原性單糖約占該總溶質質量的5-80wt％。
24.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述非還原性甲基化單糖約占該總溶質質量的20-60wt％。
25.如權利要求19所述的方法，其特征在于，所述非還原性二糖是蔗糖或海藻糖。
26.如權利要求19所述的方法，其特征在于，所述蛋白質選自明膠、白蛋白、乳清白蛋白或球蛋白和應激蛋白。
27.如權利要求19所述的方法，其特征在于，所述高分子保護劑是HES、PVP、環糊精和PEG。
28.如權利要求19所述的方法，其特征在于，所述蛋白質可以是在溫度約大于50℃、pH約大于9或約小于5的水性介質中保持穩定的任何蛋白質。
29.如權利要求19所述的方法，其特征在于，所述蛋白質的濃度約大于3wt％。
30.如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述蛋白質的濃度約大于10wt％。
31.如權利要求19所述的方法，其特征在于，所述保存用混合物具有總的溶質質量，所述MSG約占該總溶質質量的5-80wt％。
32.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述MSG約占該總的溶質質量的20-60wt％。
33.如權利要求19所述的方法，其特征在于，所述保存用混合物具有總的溶質質量，所述非還原性二糖約占該總溶質質量的5-80wt％。
34.如權利要求33所述的方法，其特征在于，所述非還原性二糖約占該總的溶質質量的20-60％。
35.如權利要求19所述的方法，其特征在于，所述保存用混合物具有總的溶質質量，所述非還原性寡糖約占該總溶質質量的5-80wt％。
36.如權利要求35所述的方法，其特征在于，所述非還原性寡糖約占該總的溶質質量的20-60wt％。
37.如權利要求19所述的方法，其特征在于，所述寡糖不是棉子糖。
38.如權利要求19所述的方法，其特征在于，配制的所述保存用混合物在干燥和隨后的至少兩周的貯存期間不結晶。
39.如權利要求21所述的方法，其特征在于，所述至少一種補充化合物是蔗糖，并且蔗糖與甲基(α或β)-d-葡萄糖的比例約為4∶1到1∶2。
40.如權利要求19所述的方法，其特征在于，所述至少一種補充化合物包括蔗糖和MSG，并且蔗糖與MSG的比例約為10∶1到1∶4。
41.如權利要求19所述的方法，其特征在于，所述混合處理還包括至少兩個步驟，包括將病毒、細菌或其它細胞加載到非還原性甲基化單糖中，然后加入至少一種補充化合物，形成保存用混合物。
42.如權利要求41所述的方法，其特征在于，使病毒、細菌或其它細胞在含有非還原性甲基化單糖的溶液中保持平衡而實現所述加載操作。
43.(新)如權利要求19所述的方法，其特征在于，該方法還包括第二次干燥處理步驟。
44.(新)如權利要求43所述的方法，其特征在于，所述第二次干燥處理是在0-100℃的溫度范圍內進行。
45.(新)如權利要求44所述的方法，其特征在于，持續進行所述第二次干燥處理，直到玻璃化轉變溫度升高到所選定的0-70℃溫度范圍內的貯存溫度之上。
46.(新)如權利要求19所述的方法，其特征在于，所述干燥步驟包括在真空中沸騰，形成穩定的泡沫。
47.(新)如權利要求46所述的方法，其特征在于，該方法還包括將所述穩定泡沫研磨成粉末的步驟。
48.(新)如權利要求47所述的方法，其特征在于，該方法還包括第二次干燥處理所述粉末的步驟。
49.(新)一種對在干燥和在環境溫度或更高的溫度下貯存期間的生存能力的喪失敏感的病毒、細菌或其它細胞的保存方法，它包括將病毒、細菌或其它細胞與保護劑混合，形成保存用混合物，所述保護劑含有非還原性單糖和從非還原性二糖、非還原性寡糖、二糖的非還原性衍生物、寡糖的非還原性衍生物、蛋白質、高分子保護劑和谷氨酸鈉(MSG)中選出的至少一種補充化合物；該保存用混合物在真空中沸騰形成穩定的泡沫從而干燥，其中，在干燥處理和隨后的在環境溫度或較高溫度下貯存期間，所述病毒、細菌或其它細胞至少保留了一部分生存能力。
50.(新)如權利要求49所述的方法，其特征在于，所述非還原性單糖是甲基化單糖。
51.(新)如權利要求50所述的方法，其特征在于，所述甲基化單糖是甲基(α或β)-d-葡萄糖。
52.(新)如權利要求49所述的方法，其特征在于，該方法還包括在進行沸騰處理之前，對部分冷凍狀態進行蒸發，從而濃縮所述病毒、細菌或其它細胞的步驟。
53.(新)如權利要求49所述的方法，其特征在于，該方法還包括在進行沸騰處理之前，采用反滲透法濃縮所述病毒、細菌或其它細胞的步驟。
54.(新)如權利要求49所述的方法，其特征在于，該方法還包括在0-100℃溫度范圍內對所述穩定性泡沫進行第二次干燥處理的步驟。
全文摘要
本發明涉及通過干燥保存敏感的生物制品、病毒、細菌和真核細胞的制劑和方法。具體而言，本發明涉及含有病毒或細胞和保護劑，包括甲基化的單糖的保存混合物，其中，該混合物適宜于使這些樣品在脫水和隨后在環境溫度和更高溫度下的貯存時保持穩定。
文檔編號A01N1/02GK1420721SQ00817902
公開日2003年5月28日 申請日期2000年11月22日 優先權日1999年11月22日
發明者V·布龍施泰因, L·林科夫斯基 申請人:環球保藏技術股份有限公司