一種基于上轉換熒光納米粒子快速檢測農藥殘留的免疫層析試紙及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種基于上轉換熒光納米粒子快速檢測農藥殘留的免疫層析試紙及其制備方法，屬于化學鑒定技術領域領域。本發明的農藥試紙包含試紙板、樣品滴加單元、檢測單元以及樣品回收單元；樣品滴加單元、檢測單元以及樣品回收單元均連接于所述試紙板上；所述檢測單元位于所述試紙板的中間；所述檢測單元包含抗原包被液以及封閉液。本發明的有益效果為：試紙具有“快速、簡便、特異、敏感、低成本”的特點，特別是其“快速、簡便”的特點，特別適合于廣大基層單位、野外作業人員以及大批量時間緊的檢測和大面積普查等，顯示巨大的發展潛力和應用前景，被認為是食品安全檢測最有前途的新技術之一，已成為食品安全檢測的主要發展趨勢。
【專利說明】
一種基于上轉換熒光納米粒子快速檢測農藥殘留的免疫層析 試紙及其制備方法
技術領域
[0001] 本發明涉及化學鑒定技術領域，特別是一種基于上轉換熒光納米粒子快速檢測農 藥殘留的免疫層析試紙及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 在20世紀80年代初，在西方發達國家興起了一種快速檢測的技術，其原理是通過 膠體金結合墊、納米材料結合墊、量子點結合墊、熒光素結合墊等的毛細管作用，用與結合 墊相對應的材料進行標記，經過硝酸纖維素膜作用，抗體和抗原在此特異性結合，將此技術 稱為免疫層析試紙檢測技術。用于標記的這些物質都具有肉眼可見或在紫外光激發下看出 抗體與抗原特異性結合的顏色或熒光顯現。免疫層析試紙條因其快速、簡便及操作簡單等 特點，其使用領域也越來越廣，且得到了很好的發展。用于試紙條標記的材料也越來越多。
[0003] 免疫層析試紙主要組成部分為樣品墊、標記物結合墊、硝酸纖維素 (Nitrocellulose，NC)膜、T線（檢測線）、C線（質控線）、吸水墊、聚氯乙稀 (Polyvinlchloride，PVC)底板。如膠體金試紙，由于膠體金的特點，試紙制備原理分為競爭 法和夾心法。競爭法：當聯有待測抗原的樣品滴加到樣品墊上時，通過毛細管作用，樣品向 前移動，到膠體金結合墊上時，樣品中的抗原會與抗體特異性結合。到達T線時，T線上的抗 體會與樣品中剩余的抗體特異性結合，變紅。樣品再繼續移動，到達C線時，再次與C線上的 抗體反應，變紅。當試紙條上出現兩條紅線時，說明樣品中的抗原含量低于檢測線，呈陰性。 反之，當樣品中的抗原含量高于檢測限時，在膠體金結合墊上抗原大部分與抗體特異性結 合，T線未出現紅色，而C線出線紅色，則為陽性。無論樣品中的待測抗原高于還是低于檢測 線，C線都應出現，否則試紙條無效。與之實驗結果相反，出現兩條紅線為陽性，一條紅線為 陰性的方法為夾心法。
[0004] 農藥殘留問題是隨著農藥大量生產和廣泛使用而產生的。到目前為止，世界上化 學農藥年產量近200萬噸，約有1000多種人工合成化合物被用作殺蟲劑、殺菌劑、殺藻劑、除 蟲劑、落葉劑等類農藥。農藥尤其是有機農藥大量施用，造成嚴重的農藥污染問題，成為對 人體健康的嚴重威脅。
[0005] 免疫試紙技術在醫學、獸醫診斷，農業，生物福利，食品安全，環境安全，工業檢測， 甚至新出現的分子診斷及納米治療領域都有廣泛的應用，具有非常廣泛的應用前景。在食 品安全檢測領域里，主要涉及到獸藥、農藥殘留，違禁添加物、生物毒素、重金屬、環境毒素 等，基本上大多數的食品安全檢測涉及的都可以應用到。技術上來說，免疫試紙檢測技術具 有"快速、簡便、特異、敏感、低成本"的特點，特別是其"快速、簡便"的特點，適用于現場巨量 樣品檢測，有著巨大的應用前景，被認為是食品安全檢測最有前途的新技術之一，已成為食 品安全檢測的主要發展趨勢。
[0006] 目前農藥殘留分析主要采用儀器分析和免疫分析方法。我們國家用的最多的，按 照試驗數來算的話，就是試紙。其他的技術當然都在用，但是試驗的絕對數都沒有試紙多， 氣-質色譜、液-質色譜難以應付巨量的樣品。其中儀器分析法具有靈敏度、準確度高和精密 度好等優點，但存在樣品前處理繁瑣、試劑用量大、費時、分析成本高，需昂貴的儀器設備等 缺點，不適合現場快速檢測。納米生物技術是納米技術與生物技術交叉滲透形成的新技術， 利用納米生物技術對細胞內外物質分析和檢測、疾病早期診斷、生物分子的示蹤標記等研 究一直是國內外相關領域的研究重點。為了能實現食品及環境中農藥殘留的快速檢測，科 學工作者開始關注上轉換(將長波長光轉換為短波長光發射的過程)納米熒光材料。上轉換 納米熒光材料是一類用980nm紅外光做激發光源的材料，用此激發光做激發源的材料光穿 透度較深，在生物組織內不會發光，故不產生背景熒光，對生物組織的損傷幾乎為零。合成 該類材料的物質毒性較小，且具有良好的化學穩定性，發光強度較好，它的吸收和發射帶 窄，從而降低檢測背景，提高信噪比，這些特征導致上轉換納米熒光材料擁有非常好的生物 應用前景。建立起基于上轉換納米材料快檢農藥多（單)殘留的方法無疑是非常重要的，到 目前為止，上轉換納米熒光材料已在細胞標記、生物大分子檢測、小動物成像、光動力學療 法及藥物輸送等方面得到了應用。但將上轉換納米熒光材料用作標記物，與免疫層析技術 相結合進行小分子農藥殘留的分析還未見報道。利用上轉換納米材料快速檢測農藥多(單） 殘留的分析方法，對發展快檢農藥多殘留檢測技術具有重要的理論研究和實際應用意義。

【發明內容】

[0007] 本發明的目的在于克服現有技術的不足，制作出納米級上轉換發光材料。本發明 提供快速檢測農藥殘留的免疫層析試紙，所述試紙包含:試紙板、樣品滴加單元、檢測單元 以及樣品回收單元;樣品滴加單元、檢測單元以及樣品回收單元依次相連且均連接于所述 試紙板上;所述樣品滴加單元與樣品回收單元位于所述試紙板的兩端，所述檢測單元位于 所述試紙板的中間;所述檢測單元包含納米粒子標記結合墊、檢測線和質控線;所述檢測線 位于所述納米粒子標記結合墊和所述質控線之間；所述納米粒子標記結合墊包含抗原包被 液以及上轉換焚光納米粒子標記抗體試樣;所述上轉換焚光納米粒子標記抗體試樣為β-NaYF4: Yb3+/Er3+標記 2，4-D-IgG 的 PBS 溶液。
[0008] 優選地，所述檢測線以及質控線均位于層析膜上，納米粒子標記結合墊與所述層 析膜相連;所述層析膜為NC硝酸纖維素膜。
[0009] 優選地，所述納米粒子標記抗體試樣中i3-NaYF4: Yb3+/Er3+標記2，4-D-IgG的含量為 0.00666-0.132yg/mL〇
[0010] 優選地，所述檢測線上的標記物為2，4-D-0VA，所述質控線的標記物為羊抗兔二 抗。
[0011] 本發明還保護檢測農藥殘留試紙的制備方法，包含下列步驟:S1.制備水溶性稀土 上轉換納米材料;S2.制備農藥多克隆抗體以及檢測所述農藥多克隆抗體的效價;S3.利用 所述步驟S1制備的產物標記所述農藥多克隆抗體;S4.利用所述步驟S3產物制備檢測農藥 殘留試紙。
[0012]優選地，所述步驟S1包含：
[0013] S1.1將稀土氯化物、油酸以及十八烯置于燒瓶中攪拌抽真空30min，后停止攪拌加 執. ，
[0014] S1.2將NaOH、NH4HF2以及甲醇置于燒杯中放入攪拌子，封上封口膜，于磁力攪拌器 上常溫攪拌；
[0015] S1.3將所述步驟SI. 1產物加熱到150°C，保溫15~20min即可，隨即關閉攪拌，關閉 加熱，使之降低至室溫；
[0016] S1.4盡量少進空氣的情況下滴加S1.2溶液，反應完全后通入N2,將滴加過程中進 入的空氣排盡；
[0017] S1.5 將體系加熱至75-85。(：，保溫1.511;
[0018] S1.6在0.5h內將所述步驟S1.5的產物升溫至310°C，N2保護下保溫2h，隨即在N 2保 護及攪拌下冷卻至室溫；
[0019] S1.7洗滌產物；
[0020] S1.8利用所述步驟S1.7產物制備水溶性0-NaYF4:Yb3+，Er 3+納米粒子。
[0021 ]優選地，所述步驟S1.8包含:SI. 8.1將所述步驟S1.7的產物、環己烷、叔丁醇、去離 子水以及K<03溶液室溫下混合攪拌；S1.8.2將KMn〇4和NaI〇4水溶液緩慢滴入所述步驟 SI. 8.1的產物，40°C下反應48h，用95 %乙醇洗滌離心得初產物；S1.8.3初產物溶于HC1中， 常溫下攪拌反應，反應結束后離心洗滌離心得到產物。
[0022] 優選地，所述步驟S3包含：S3.1分別配置pH=5以及pH = 7.4的磷酸緩沖鹽溶液； S3.2制備水溶性 0-NaYF4: Yb，Er 標記 2，4-D-I gG。
[0023] 優選地，所述步驟S3.2為:S3.2.1取經KMn〇4_NaI〇4氧化溶于水的P_NaYF4: Yb，Er制 成溶液A，向所述溶液A中加入所述步驟S3.1制備的pH=5的roS緩沖液后，加入EDC與Sulfo-NHS，常溫攪拌;S3.2.2向所述步驟S3.2.1的產物中加入2，4-D-IgG，常溫反應2h，離心出產 物;將所述產物用PBS洗2遍后定容于所述步驟S3.1制備的pH=7.4的PBS緩沖液中。
[0024] 本發明的優點和積極效果是:上轉換納米熒光材料具有有機染料和量子點材料無 法比擬的優勢，如毒性小、化學穩定性高、發光強度高、光穩定性好、吸收和發射帶窄和熒光 壽命長等;此外980nm紅外激光作激發源也有許多優勢，例如較深的光穿透深度、對生物組 織幾乎無損傷、生物組織不會發光(無背景熒光），從而降低檢測背景，提高信噪比，這些特 征導致上轉換納米熒光材料擁有非常好的生物應用前景。建立起基于上轉換納米材料快檢 農藥多殘留的方法無疑是非常重要的，利用上轉換納米材料快速檢測農藥多(單)殘留的分 析方法，對發展快檢農藥多殘留檢測技術具有重要的理論研究和實際應用意義。免疫試紙 技術在醫學、獸醫診斷，農業，生物福利，食品安全，環境安全，工業檢測，甚至新出現的分子 診斷及納米治療領域都有廣泛的應用，具有非常廣泛的應用前景。在食品安全檢測領域里， 主要涉及到獸藥、農藥殘留，違禁添加物、生物毒素、重金屬、環境毒素等，基本上大多數的 食品安全檢測涉及的都可以應用到。技術上來說，免疫試紙檢測技術具有"快速、簡便、特 異、敏感、低成本"的特點，特別是其"快速、簡便"的特點，特別適合于廣大基層單位、野外作 業人員以及大批量時間緊的檢測和大面積普查等，顯示巨大的發展潛力和應用前景，被認 為是食品安全檢測最有前途的新技術之一，已成為食品安全檢測的主要發展趨勢。
【附圖說明】
[0025]圖1為合成f3_NaYF4:Yb3+，Er3+納米粒子的掃描電鏡圖；
[0026] 圖2為0-NaYF4:Yb3+，Er3+納米粒子的透射電鏡圖；
[0027] 圖3為水溶性β-NaYF4:Yb3+，Er3+上轉換納米粒子的TEM圖；
[0028] 圖4為水溶性0-NaYF4:Yb3+，Er3+上轉換納米粒子標記2,4-D-IgG后的TEM圖；
[0029]圖5為在595nm吸收波長下，BSA的濃度與吸光度的關系曲線；
[0030]圖6為檢測農藥單殘留的免疫層析試紙結構圖；
[0031]圖7為不同濃度試樣篩選結果判據圖，A-E為不同濃度的標記上轉換納米粒子的抗 體試樣；
[0032]圖8為試紙的靈敏度示意圖，A:陰性B:陽性T:檢測線C:質控線；
[0033] 圖9確定試紙條檢測2,4-D農殘靈敏度結果圖；
[0034] 圖10確定試紙條檢測2,4-D農殘靈敏度結果圖；
[0035]圖11為2,4-D標準樣的液相色譜圖；
[0036]圖12為樣品梨中的2,4-D含量；
[0037]圖13為樣品蘋果中的2,4-D含量；
[0038]圖14為樣品黃瓜中的2,4-D含量；
[0039]圖15為樣品西紅柿中的2,4_D含量；
[0040] 圖16為樣品大米中的2,4-D含量；
[0041] 圖17為樣品小米中的2,4-D含量；
[0042] 圖18為試紙條驗證結果圖，a:梨，b:蘋果，c:黃瓜，d:西紅柿，e:大米，f:小米。
[0043]附圖標記：
[0044] 1-試紙板、2-樣品滴加單元、3-納米粒子標記結合墊、4-檢測線、
[0045] 5-質控線、6-樣品回收單元、7-層析膜、A-樣品流動方向。
【具體實施方式】
[0046] 近年來因為稀土上轉換納米材料的光學性質，使其在生物領域的應用有著大量可 待開發的潛能。0-NaYF4: Yb3+，Er3+(Tm3+)是目前為止發現的上轉換效率最高的材料，故其在 生物檢測與標記方面獲得廣泛關注。但是，因制備得到的稀土上轉換納米材料是油溶性材 料，需利用KMn〇4/NaI〇4將油溶性納米粒子轉變成水溶性納米粒子。本文利用高溫熱分解法 制備了油酸包覆的f3-NaYF4: Yb3+，Er3+納米粒子。
[0047] 1、稀土上轉換納米材料的制備
[0048] (1)實驗儀器與實驗試劑
[0049] 表1實驗儀器一覽表
[0051 ] 表2化學試劑一覽表
[0054] (2)制備稀土氯化物
[0055] 將稀土氧化物10g倒入新燒杯中，加入5ml蒸餾水，加入濃度37%的HC1 50-60ml， 攪拌，若太濃稠則繼續加入HC1。
[0056]微溶后，置于鋪有石棉網的電爐上加熱至沸騰，若一直未澄清，則再加入20-30ml HC1，沸騰至剩余溶液為原來一半后仍未澄清，則繼續加入濃度為37 %的HC1，直至澄清。 [0057]澄清后的溶液沸騰蒸干至溶液開始出現大氣泡時，加入蒸餾水80ml，沖洗杯壁及 玻璃棒。反復重結晶四次左右最后一次蒸干后快速攪拌成結晶狀，裝管。
[0058] (3)高溫熱分解法制備油溶性i3_NaYF4: Yb3+，Er3+上轉換熒光納米粒子
[0059]①將稀土氯化物（2mmol)[YCl3 · 6H20(78%)、YbCl3.6H20(20%)、ErCl3.6H20 (2 % ) ]、90 %油酸（12ml)、90 %十八烯（30ml)置于三口燒瓶中，放入攪拌子，抽真空，30min 后加熱。抽真空時放在熱電偶上，只攪拌不加熱。
[0060] ②將Na0H(5mmol)、NH4HF2(5mmol)、無水甲醇（10ml)置于小燒杯中，放入攪拌子，封 上封口膜，置于磁力攪拌器上常溫攪拌。
[0061 ]③步驟①中抽真空完畢，在15min內將三口燒瓶中溶液加熱到150 °C，保溫15~ 20min即可，隨即關閉攪拌，關閉加熱，使之降低至室溫。
[0062]④盡量少進空氣的情況下加入步驟2中的溶液，緩慢逐滴滴加，使之充分反應。滴 加結束后開始通入N2，通入30min左右，將滴加過程中進入的空氣排盡。
[0063]⑤排盡空氣后將體系加熱至80°C(15-20min左右升至80°C)，溫度變化范圍在5°C 以內，不能低于80°C，保溫1.5h。
[0064] ⑥保溫1.5h后，在0.5h內將溶液升溫至310°C，充分反應，N2保護下保溫2h。隨即在 N2保護及攪拌下冷卻至室溫。
[0065] ⑦洗滌產物:將離心機調至9000r/min，時間設定為lOmin，用無水乙醇將產物洗滌 一遍;環己烷:無水乙醇以1:3比例混合將產物洗滌兩遍;無水乙醇將產物洗滌兩遍;95 %乙 醇將產物洗滌兩遍。將離心管放入干燥箱干燥產物。
[0066] (4)水溶性0_NaYF4: Yb3+，Er3+納米粒子的制備
[0067] 將上述制備好的0-似丫?4:￥133+31'3+(5〇11^)、環己燒（5〇1111)、叔丁醇（351111)、去離子 水（51111)以及5￥七％1( 20)3溶液（2.51111)室溫下混合攪拌2〇1^11。將1〇1111含2.85111111〇1疆11〇4和 0.0525mmol NaI〇4水溶液緩慢滴入。40°C下反應48h，用95%乙醇洗滌離心（9000r/min)產 物得初產物。初產物溶于12.5ml pH為4-5的HC1，常溫下攪拌反應30min。反應結束9000r/ min離心，最后用95%乙醇洗滌離心得到產物。將產物分散于15ml去離子水中待用。
[0068] (5 )0-NaYF4: Yb3+，Er3+納米粒子的表征
[0069] a)SEM 分析
[0070]從圖1的SEM照片可看到高溫熱解法合成的i3_NaYF4: Yb3+，Er3+上轉換納米粒子，其 形貌為實心的納米球，顆粒大小均勾，粒徑為30nm左右，從SEM圖片也可觀察到產物物相純 凈。
[0071] b)TEM 分析
[0072]從圖2的TEM照片可看到高溫熱解法合成的i3-NaYF4:Yb3+，Er3+納米粒子，其形貌為 實心的納米球，顆粒大小均勾，粒徑為30nm左右，從TEM圖片也可觀察到產物物相純凈。 [0073] 從圖3可看出，氧化后的i3_NaYF4:Yb，Er納米粒子的形貌和粒徑尺寸均未發生改 變，仍為粒徑在30nm左右的球狀粒子。
[0074] 2、農藥多克隆抗體的制備及效價
[0075] (1) 2，4-D農藥多克隆抗體(IgG)的制備及效價
[0076]將一定量免疫抗原（2，4-D-BSA)的生理鹽水溶液與等量的弗氏完全佐劑混合，充 分乳化，免疫2只新西蘭白兔(2-2.5kg)，皮下免疫400yg/次，2-3周免疫一次，免疫4次。在每 次加強免疫后第10天于耳靜脈采血，離心獲得血清，以ELISA方法測定血清效價，直至效價 大于1:50,000進行最終采血制備抗血清，使用Protein A親和純化的方法獲得高效價多克 隆抗體(IgG)。
[0077] 表3抗體間接Elisa結果
[0079] (2)水溶性0-NaYF4:Yb3+，Er3+納米粒子標記農藥多克隆抗體(2,4-D-IgG)
[0080] a)水溶性 0-NaYF4: Yb，Er 標記 2，4-D-IgG
[0081 ] i ·磷酸緩沖鹽溶液(PBS)的配制(0 · 01M)
[0082] 將似<：1(0.88)、1((：1(0.0028)、似2耶04(0.1448)、1〇12?04(0.0248)用水定容至 100ml，即可得到pH=7 · 4的PBS溶液。
[0083] 配制pH=5的PBS溶液，用30 % HC1將上述溶液pH調至5 · 0即可。
[0084] i i ·水溶性0-NaYF4: Yb3+，Er3+標記2，4-D-IgG的方法
[0085] 取經KMn〇4_NaI〇4氧化溶于15ml水的0-他￥?4:￥133+34 +，向上述溶液中加入1511^ 卩85(卩!1=5)緩沖液后，加入0.011528(0.000384\301111#0(：與0.032578 5111化-顯5 (0 · 00108565 X 30ml)，常溫攪拌30min，活化羧基。加入50yL(C= 260mg/ml) IgG，常溫反應 2Κ9000γρπι離心出產物，產物用PBS(pH=7.4)洗2遍后定容于15ml PBS(pH=7.4)中。
[0086] 從圖4可看出，0-似￥?4^3+也3+偶聯2,4-〇-186后，與偶聯前的氧化產物相比（見 圖4)，因此其形貌發生了變化，納米粒子的表面覆蓋了一層物質，粒徑約為50nm左右。
[0087] b)考馬斯亮藍法定量分析蛋白的含量
[0088] ①配制布拉德福德試劑:取考馬斯亮藍G-250 50mg置于200ml燒杯中，加入25ml的 95%乙醇使其溶解，隨后加入60ml 85% (w/v)的磷酸，轉移至500ml容量瓶，用去離子水稀 釋至500ml。溶液需現配現用。
[0089] ②配置 BSA 濃度分別為0，0 · 02，0 · 04,0 · 06，0 · 08 和0 · 10mg/mL的標準液各 1 · OOmL。
[0090] ③取②中的配置好的BSA溶液中分別放入指定試管中，根據順序分別加入5.OOmL 的布拉德福德試劑，搖晃均勻，反應2min后，用作待測液。設定紫外分光光度計的吸收波長 在595nm，用待測液進行吸光度測定。
[0091] 根據順序的得到的測定結果如下:0，0.164，0.349，0.508，0.648，0.813。由濃度及 吸光度作圖可知二者有如下的線性關系。見圖5,回歸方程為：Y = 8.108X+0.0089(R2 = 0.998)
[0092] X為BSA濃度，Y為吸光度。經測定，樣品0-似￥?4:￥133+此3+標記2,4-〇-186的吸光度 為〇. 195，根據蛋白質標準曲線計算出i3-NaYF4: Yb，Er標記2，4-D-IgG表面的2，4-D-IgG偶聯 率為2 · 67% (含2，4-D-IgG 23 · lyg/mL)。這個結果進一步表明，2，4-D-IgG已被f3-NaYF4: Yb， Er納米粒子成功標記。
[0093] 3、農藥單殘留檢測免疫層析試紙的制備
[0094] 表4化學材料一覽表
[0096] 表5實驗儀器一覽表
[0098] (1)免疫層析試紙條的組裝
[0099] 農藥單殘留檢測免疫層析試紙條的結構如圖6所示。試紙條包含試紙板1、樣品滴 加單元2、檢測單元以及樣品回收單元6。
[0100] 樣品滴加單元2、檢測單元以及樣品回收單元6依次相連且均連接于所述試紙板1 上;所述試紙板1為PVC膠板。所述樣品滴加單元2與樣品回收單元6位于所述試紙板1的兩 端，所述檢測單元位于所述試紙板1的中間。
[0101 ]所述檢測單元包含納米粒子標記結合墊3、檢測線4和質控線5;所述納米粒子標記 結合墊3包含抗原包被液以及上轉換焚光納米粒子標記抗體試樣;所述上轉換焚光納米粒 子標記抗體試樣為0-NaYF4: Yb3+/Er3+標記2，4-D-IgG的roS溶液。所述抗原包被液以及所述 上轉換焚光納米粒子標記抗體試樣可由前述制備方法制得。
[0102] 檢測線4以及質控線5均位于層析膜7上。納米粒子標記結合墊3與層析膜7相連，層 析膜7為NC硝酸纖維素膜。
[0103] (i)利用水溶性綠色0-NaYF4: Yb3+，Er3+納米粒子標記2，4-D-IgG檢測2，4-D免疫層 析試紙的制備方法
[0104] a)抗原包被液的選擇
[0105] 用于農藥試紙檢測線(T線）的確定。準確稱取2,4-D 250mg，加入10mL DMF(N，N-二 甲基甲酰胺）溶解，再向此溶液中依次加入50.OyL 99%三正丁胺和30yL 98%氯丁酸異丁 酯，室溫磁力攪拌過夜；再將此溶液在攪拌狀態下緩慢滴加到溶有450mg 0VA的 20mL0 · 05mol/L pH9 · 6的碳酸緩沖液中，攪拌反應24h;此反應液在4°C下對0 · 01mol/L pH7.4的磷酸緩沖液透析(透析6次，每次6小時、500ml透析液，透析袋用之前需用沸水煮10 分鐘，透析時需放入4°C冰箱中），透析液3500rpmn離心10min，上清液冷凍干燥，得合成抗 原。取10mg合成抗原定容于50mL容量瓶，配成0.2mg/mL包被液。
[0106] b)納米粒子標記抗體濃度的選擇：
[0107] 備用試紙條的確定。配制不同濃度的標記上轉換納米粒子的抗體試樣，在980nm光 的激發下，觀察所劃線的發光強度選擇最適濃度。
[0108] A: 200yL含 0 · O33Oμg/ml0-NaYF4: Yb3+/Er3+標記 2，4-D-IgG 的 PBS 溶液；
[0109] B: 200yL含0 · 1665μg/ml0-NaYF4: Yb3+/Er3+標記 2，4-D-IgG 的 PBS 溶液；
[0110] C: 200yL含 0 · 333Oμg/ml0-NaYF4: Yb3+/Er3+標記 2，4-D-IgG 的 PBS 溶液；
[0111] D: 200yL含 0 · 4995μg/ml0-NaYF4: Yb3+/Er3+標記 2，4-D-IgG 的 PBS 溶液；
[0112] E: 200yL含 0 · 66OOμg/ml0-NaYF4: Yb3+/Er3+標記 2，4-D-IgG 的 PBS 溶液。
[0113] 實驗結果如圖7以及表6所示：
[0114]表6 代表熒光強度）
[0116]如圖7所示，在980nm波長光照射NC膜進行結果判定。由包被液篩選結果(表6和圖 7)可知，不同濃度的標記上轉換納米粒子的抗體試樣C: 200yL含0.3330μg/mlf3-NaYF4: Yb3+/ Er3+標記IgG的PBS溶液，NC膜上的線熒光強度最強，其他濃度納米粒子標記抗體試樣的試紙 條熒光強度就弱。由上述結構可知，當不同濃度的標記上轉換納米粒子的抗體試樣中含有 C: 200yL含 Ο · 333Oμg/ml0-NaYF4: Yb3+/Er3+標記 2，4-D-IgG 的 PBS 溶液時效果最佳，檢測線（T 線)為2,4-D包被抗原，質控線(C線）為羊抗兔二抗，將該試樣滴加在樣品墊上，干燥后可作 為檢測2，4-D含量的備用試紙條。
[0117] (2)水溶性綠色0-NaYF4: Yb3+，Er3+納米粒子標記2，4-D-IgG檢測2，4-D免疫層析試 紙的靈敏度確定
[0118] 由（1)中制得的備用試紙條進行下一步操作。用免疫層析試紙技術檢測時有競爭 法和夾心法兩種方法，因2,4_D屬于小分子化合物，即用競爭法來檢測。由試紙條原理可知， T線上的標記物為2,4-D-0VA，C線的標記物為羊抗兔二抗，制備得到的含有2,4-D抗原的樣 品滴加到試紙條的樣品墊上，樣品會隨著試紙條的納米粒子結合墊、NC膜向前移動，如果樣 品中含有的2,4-D低于試紙條的檢測限，在到達T線時，會與線上的2,4-D-0VA反應，反應后 的T線在980nm光的激發下可看到一條綠色熒光線。然后樣品繼續向前移動，到達C線時，與C 線的標記物羊抗兔二抗反應，反應后的C線在980nm光的激發下也可看到一條綠色熒光線。 若同時出現兩條綠色熒光線，則說明樣品呈陰性(如圖8-A)。相反，如果樣品中的2,4-D高于 檢測限濃度時，樣品到達納米粒子結合墊時大部分會與抗原先反應，剩余的少量部分繼續 向前移動，此時的抗原較少，不夠與T線上的2,4-D-0VA發生反應，所以在980nm光的激發下， 不能看見綠色熒光。然后樣品繼續向前移動，到達C線時，與C線的標記物羊抗兔二抗反應， 反應后的C線在980nm光的激發下也可看到一條綠色熒光線。當只有一條綠色熒光線時（如 圖8-B )，樣品呈陽性。若兩條線都不出現，說明試紙條失敗。
[0119] (3)2,4_D農藥殘留檢測限的確認
[0120] 表7靈敏度的測定(500~lng)
[0122] (備注："+"、分別表示陽性和陰性）
[0123] 表8靈敏度的測定（10~lng)
[0125] (備注："+"、分別表示陽性和陰性）
[0126] 由表7、8和圖9、10可知，試紙條檢測含量在10ng/mL以上的2,4-D標準液時，結果都 為陽性。對此濃度進一步實驗，發現在檢測濃度為5ng/mL的2,4-D時，可觀測到樣本試紙條T 線。因此，試紙條的檢測靈敏度確定為5ng/mL。
[0127] 由上述實驗可得，因為確定了 2,4-D包被OVA的濃度，將檢測線定在5ng/mL。當在適 當范圍內調節2,4-D包被0VA的濃度可調節試紙條的靈敏度。檢測線可變。
[0128] (4)免疫層析試紙條使用方法
[0129] 將適量樣品提取液滴加到NC膜上，lOmin后，用980nm波長光照射NC膜部位進行結 果判定：
[0130]①如T線和C線出現相同的熒光，則為陰性，即農藥含量低于設計檢測限量，見圖7-B〇
[0131] ②如T線不產生熒光，C先有熒光，則為陽性，即農藥含量高于設計檢測限量，見圖 7_A〇
[0132] ③如T線和C先均不產生熒光，說明檢測失敗。
[0133] (5)基于上轉換納米粒子免疫層析試紙檢測農殘含量與儀器分析法對比
[0134] 1)液相色譜分析水果、蔬菜及原糧中的2,4_D含量與上轉換納米粒子免疫層析試 紙檢測農藥含量對比
[0135] 表9化學試劑一覽表
[0137] 實驗儀器
[0138] 配備德國Nacalai Tesque公司C0SM0SIL-C18色譜柱的島津高效液相色譜儀、0.45 μπι過濾膜、20yL進樣器、旋轉蒸發儀以及粉碎機。
[0139] 2)樣品前處理
[0140]①稱取梨、蘋果、黃瓜、西紅柿及粉碎后過20目篩的大米及小米試樣各20g，分別添 加2mg的2,4-D標準物質。
[0141] ②分別向以上六種樣品中加入5mL 30%甲醇-PBS溶液，研磨。
[0142] ③將研磨后的產物離心，用30%甲醇-PBS溶液洗滌2-3次，每次用量5mL。
[0143] ④減壓蒸餾濃縮提取液至2.0mL(lmg/mL)。將制備好的六種樣品分別配成250ng/ mL的溶液。
[0144] ⑤過孔徑為0·45μπι的過濾膜待測。
[0145] 4)實驗條件
[0146] ①流動相：甲醇-磷酸水溶液=70 % : 30 % (ΡΗ=3.0);
[0147] ②保留時間：20min;
[0148] ③流速：lmL/min;
[0149] ④檢測波長：278nm;
[0150] ⑤進樣量:20yL。
[0151] 5)實驗結果與分析
[0152] ①樣品中實際添加2,4-D質量的計算：
[0154] 其中，Μ-一標準溶液中2，4-D峰面積的平均值;A2-一試樣溶液中2，4_D峰面積的 平均值;mi--標樣中2，4-D的質量(g);m2--試樣的質量(g)。
[0155] 2,4_D標準樣的2,4_D含量見圖11;各個樣品a:梨，b:蘋果，c:黃瓜，d:西紅柿，e:大 米，f:小米的2,4-D含量見圖12-17以及表10。
[0156] 表10水果、蔬菜及原糧中的2,4_D測量結果
[0158] (6)實驗結果與試紙條結果對比
[0159] 采用本發明制備的試紙條驗證結果如圖18所示(a:梨，b:蘋果，c:黃瓜，d:西紅柿， 6:大米，1；':小米)。
[0160] 由表10及圖18可知，液相色譜檢測時2,4-D加入量為5ng，試紙條可檢測出樣品呈 陰性，符合檢測結果。
【主權項】
1. 檢測農藥殘留試紙，其特征在于所述試紙包含:試紙板、樣品滴加單元、檢測單元以 及樣品回收單元； 樣品滴加單元、檢測單元以及樣品回收單元依次相連且均連接于所述試紙板上； 所述樣品滴加單元與樣品回收單元位于所述試紙板的兩端，所述檢測單元位于所述試 紙板的中間； 所述檢測單元包含納米粒子標記結合墊、檢測線和質控線;所述檢測線位于所述納米 粒子標記結合墊和所述質控線之間;所述納米粒子標記結合墊包含抗原包被液以及上轉換 焚光納米粒子標記抗體試樣;所述上轉換焚光納米粒子標記抗體試樣為0-NaYF4: Yb3+/Er3+ 標記2，4-D-IgG的PBS溶液。2. 根據權利要求1所述的檢測農藥殘留試紙，其特征在于，所述檢測線以及質控線均位 于層析膜上，納米粒子標記結合墊與所述層析膜相連;所述層析膜為NC硝酸纖維素膜。3. 根據權利要求1所述的檢測農藥殘留試紙，其特征在于，所述納米粒子標記抗體試樣 中 0-NaYF4: Yb3+/Er3+標記 2，4-D-IgG 的含量為0.00666-0.132yg。4. 根據權利要求1所述的檢測農藥殘留試紙，其特征在于，所述檢測線上的標記物為2， 4-D-0VA，所述質控線的標記物為羊抗兔二抗。5. 檢測農藥殘留試紙的制備方法，其特征在于，包含下列步驟：51. 制備稀土上轉換納米材料；52. 制備農藥多克隆抗體以及檢測所述農藥多克隆抗體的效價；53. 利用所述步驟S1制備的產物標記所述農藥多克隆抗體；54. 利用所述步驟S3產物制備檢測農藥殘留試紙。6. 根據權利要求5所述的檢測農藥殘留試紙的制備方法，其特征在于，所述步驟S1包 含： S1.1將稀土氯化物、油酸以及十八烯置于燒瓶中攪拌抽真空30min，后停止攪拌加熱； S1.2將NaOH、NH4HF2以及甲醇置于燒杯中放入攪拌子，封上封口膜，于磁力攪拌器上常 溫攪拌； S1.3將所述步驟S1.1產物加熱到150 °C，保溫15~20miη即可，隨即關閉攪拌，關閉加 熱，使之降低至室溫； S1.4盡量少進空氣的情況下滴加 S1.2所述溶液，反應完全后通入Ν2，將滴加過程中將進 入的空氣排盡； 31.5將體系加熱至75-85°(：，保溫1.511; S1.6在0.5h內將所述步驟S1.5的產物升溫至310°C，Ν2保護下保溫2h，隨即在Ν2保護及 攪拌下冷卻至室溫； S1.7洗滌產物； S1.8利用所述步驟S1.7產物制備水溶性0-NaYF4:Yb，Er納米粒子。7. 根據權利要求6所述的檢測農藥殘留試紙的制備方法，其特征在于，所述步驟S1.8包 含： SI. 8.1將所述步驟S1.7的產物、環己烷、叔丁醇、去離子水以及K2C〇3溶液室溫下混合攪 拌； S1.8.2將KMn〇4和NaI〇4水溶液緩慢滴入所述步驟SI. 8.1的產物，40°C下反應48h，用 95%乙醇洗滌離心得初產物； S1.8.3初產物溶于HC1中，常溫下攪拌反應，反應結束后離心洗滌離心得到產物。8. 根據權利要求5所述的檢測農藥殘留試紙的制備方法，其特征在于，所述步驟S3包 含： S3.1分別配置pH=5以及pH=7.4的磷酸緩沖鹽溶液； S3 · 2 制備水溶性 0-NaYF4: Yb，Er 標記 2，4-D-IgG。9. 根據權利要求8所述的檢測農藥殘留試紙的制備方法，其特征在于，所述步驟S3.2 為： S3.2.1取經KMn〇4_NaI〇4氧化溶于水的FNaYF4: Yb，Er制成溶液A，向所述溶液A中加入 所述步驟S3.1制備的pH=5的PBS緩沖液后，加入EDC與Sulfo-NHS，常溫攪拌； S3.2.2向所述步驟S3.2.1的產物中加入2，4-D-IgG，常溫反應2h，離心出產物;將所述 產物用PBS洗2遍后定容于所述步驟S3.1制備的pH=7.4的PBS緩沖液中。
【文檔編號】G01N21/64GK106018374SQ201610590578
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月26日
【發明人】華瑞年, 國婷婷, 張偉, 于基成, 那立艷
【申請人】大連民族大學