一種新穎的免疫細胞示蹤方法
【專利摘要】本申請提供了一種免疫細胞示蹤方法，所述方法包括以下步驟：(1)提供免疫細胞；(2)用偶聯熒光染料的抗體標記步驟(1)獲得的免疫細胞，然后體外檢測標記免疫細胞的熒光強度；(3)將標記好的免疫細胞注射到實驗動物體內；(4)采用動物活體成像儀檢測實驗動物體內熒光強度；(5)計算數據，確定免疫細胞在體內的分布、遷徙和存活時間。本申請還提供了用于免疫細胞示蹤方法的試劑盒。本申請的方法及試劑盒不引進新的基因、不添加底物，操作簡便，快捷，可為生命科學領域特別是免疫學研究領域深入了解免疫活性細胞殺傷腫瘤細胞的機制以及腫瘤的過繼性免疫細胞治療的基礎科研工作和臨床應用提供技術支持，將進一步促進腫瘤臨床治療技術的發展。
【專利說明】
一種新穎的免疫細胞示蹤方法
技術領域
[0001] 本申請屬于免疫醫學研究領域，涉及一種檢測免疫細胞的方法和試劑盒，具體涉 及一種示蹤法檢測免疫細胞的方法和試劑盒。
【背景技術】
[0002] 隨著環境污染對人們生存空間和食品安全的影響，以及社會發展導致人們生活方 式的改變，心血管疾病、癌癥、糖尿病和慢性肺部疾病等非傳染性疾病引起的死亡率不斷上 升，據統計在2012年導致全球死亡總數的68%，比2000年的60%有所上升。其中，特別是全 球癌癥病例將迅猛增長，因此抗腫瘤藥物和療法市場極其巨大。
[0003] 傳統的癌癥治療方法化療、放療、手術治療后因其強烈的副作用和免疫排斥反應， 治療效果并不盡人意。免疫細胞過繼療法出現后，正方興未艾，因其來源于患者自體細胞， 可在一定程度上避免發生強烈免疫排斥反應，因此成為未來癌癥在治療的新技術發展方 向。
[0004] 腫瘤過繼性細胞免疫治療屬于生物治療方法中的一種，它是將體外激活的自體或 異體免疫效應細胞，先進行擴增和功能的鑒定，最后再輸送到患者體內，以殺傷患者體內腫 瘤細胞。過繼免疫細胞在體內發揮作用受許多因素的影響，其中一個重要因素就是免疫效 應細胞能否到達靶器官，實現與腫瘤細胞的直接接觸，從而有效殺傷腫瘤細胞，因此在過繼 免疫細胞療法的臨床前研究中，用快速、方便、低成本的監測方法了解免疫活性細胞的分 布、迀徙和存活時間成為限制過繼免疫細胞療法的臨床前研究以及癌癥治療新技術的關鍵 和重要技術。
[0005] 當前觀察免疫活性細胞的分布、迀徙和存活時間的方法包括組織病理學技術、核 素成像技術、磁共振成像技術、光學成像技術。其中，組織病理學技術須在不同的時間點將 組織從活體中取出或者處死實驗動物進行標記從而了解細胞在體內的情況，具有不能實時 動態觀察同一移植細胞在體內的分布和迀移的缺陷；核素成像技術即應用相機、單光子發 射計算機斷層顯像(SPECT)和正電子發射斷層顯像(PET)等技術，所需PET和SPECT都是觀察 體內細胞分布方面高靈敏度和高分辨率的儀器，儀器昂貴并且需采取專門措施防護輻射污 染。磁共振成像技術即利用人體組織中某種原子核的核磁共振現象，將所得射頻信號經過 電子計算機處理，重建出人體某一層面的圖像的診斷技術，儀器也較昂貴，且需要造影劑， 造影劑存在一定毒性。
[0006] 最近，運用生物發光劑和內源性熒光報告基因或者是外源性探針檢測分子和生化 進程的光學成像技術因其無放射性污染并且不許昂貴儀器優勢，成為觀察免疫活性細胞的 分布、迀徙和存活時間的新發展方向。但是采用檢測內源性報告基因示蹤免疫細胞的方法 由于需要將外源性基因轉導到細胞內，可能存在一些不可預知的影響。常規生物發光劑(如 熒光素酶）需要額外的向體內注射發光底物，且單次注射后持續發光時間短，并且特異性 差，檢測信號中包含多種非靶標細胞，影響對目標細胞種類及含量的正確評估。
[0007] 因此，在過繼免疫細胞治療研究領域，仍然亟待一種新的，簡便高效，特異性強，可 區分不同免疫細胞種類及同種免疫細胞不同亞群的分布、迀徙和存活時間的免疫細胞示蹤 方法。

【發明內容】

[0008] 本申請的目的是提供一種無創，簡便高效，特異性強的免疫細胞示蹤方法，用于免 疫細胞示蹤的試劑盒和偶聯熒光染料的抗體在制備用于免疫細胞示蹤的試劑盒中的用途。
[0009] 本申請根據抗原抗體特異性結合反應以及抗體結合的熒光物質的激發光和發射 光靠近偏紅外，可穿過組織和皮膚而被檢測到的原理，采用偶聯熒光染料的特異性熒光抗 體標記免疫細胞，將熒光抗體標記的免疫細胞注射到實驗小動物體內，用小動物活體成像 儀檢測注射部位熒光信號強弱情況，確定免疫細胞的分布情況和數量。
[0010] 本申請提供了一種免疫細胞示蹤方法，所述方法包括以下步驟：（1)提供免疫細 胞；（2)用偶聯熒光染料的抗體標記步驟（1)獲得的免疫細胞，然后體外檢測標記免疫細胞 的熒光強度；（3)將標記好的免疫細胞注射到實驗動物體內；（4)采用動物活體成像儀檢測 實驗動物體內熒光強度；（5)計算數據，確定免疫細胞在體內的分布、迀徙和存活時間。在一 些實施方案中，所述免疫細胞選自T細胞、B細胞、NK細胞、DC細胞、免疫調節細胞、造血母細 胞。在一些實施方案中，所述T細胞包括⑶3+、⑶4+;所述B細胞包括⑶19+;所述NK細胞包括 CD3-/CD(16+56) + ;所述免疫調節細胞包括CD4+/CD29+;所述造血母細胞包括CD33+和CD34 +。在一些實施方案中，所述免疫細胞為T細胞，所述T細胞為CD3+。在一些實施方案中，所述 熒光抗體上偶聯的熒光染料選自共輒結合探針、Alexa Fluor系列熒光染料、Cy系列熒光染 料、細胞功能探針、熒光蛋白和其他探針。在一些實施方案中，所述共輒結合探針包括 Allophycocyanin(APC)、Texas Red;所述Alexa Fluor系列焚光染料包括Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647;所述Cy系 列熒光染料包括Cy3.5;所述細胞功能探針包括SNARF、Flu〇-3;所述熒光蛋白包括TagYFP、 EYFP和Topaz。在一些實施方案中，所述熒光抗體為別藻藍蛋白-抗CD3抗體(APC anti-human CD3)。在一些實施方案中，所述步驟(2)是將免疫細胞與熒光抗體混勻后冰浴條件下 孵育，所述孵育反應體系中，所述熒光抗體的用量為0.2~7.8yL，所述免疫細胞的用量為1 ~15X10 6個細胞，所述熒光抗體和免疫細胞結合的孵育時間為5mins~60mins，結合熒光 抗體的免疫細胞體外檢測的曝光時間為〇. Is~200s。在一些實施方案中，所述步驟(2)是將 免疫細胞與熒光抗體混勻后冰浴條件下孵育，所述孵育反應體系中，所述熒光抗體的用量 為1~6yL，所述免疫細胞的用量為3~7 X106個細胞，所述熒光抗體和免疫細胞結合的孵育 時間為18mins~40mins，所述結合焚光抗體的免疫細胞體外檢測的曝光時間為0.1 s~80s。 在一些實施方案中，所述步驟(3)中，將熒光抗體標記的免疫細胞注射入小動物體內遵守如 下操作要求:A、所述小動物包括裸鼠，兔子，狗、貓，綿羊;B、熒光抗體標記的免疫細胞注射 入小動物體內的部位選自腹部皮內注射，背部皮內注射，體內經尾靜脈注射中的一種;C、接 受所述熒光抗體標記的免疫細胞注射的小動物年齡為整個存活周期，優選存活中期;D、所 述注射深度為皮下〇~lcm組織。
[0011] 在本申請的免疫細胞示蹤方法的一個具體實施例中，免疫細胞為CD3+T細胞。
[0012]本申請的新穎的免疫細胞示蹤方法的一些具體實施例中，熒光抗體是APC anti-human CD3〇
[0013]本申請的新穎的免疫細胞示蹤方法的一個具體實施例中，APC anti-human⑶3的 用量為0.2此。
[0014]本申請的新穎的免疫細胞示蹤方法的一個具體實施例中，APC anti-human⑶3的 用量為1此。
[0015]本申請的新穎的免疫細胞示蹤方法的一個具體實施例中，APC anti-human⑶3的 用量為3yL。
[0016]本申請的新穎的免疫細胞示蹤方法的一個具體實施例中，APC anti-human⑶3的 用量為4.6yL。
[0017]本申請的新穎的免疫細胞示蹤方法的一個具體實施例中，APC anti-human⑶3的 用量為5.4此。
[0018]本申請的新穎的免疫細胞示蹤方法的一個具體實施例中，APC anti-human⑶3的 用量為6.6此。
[0019]本申請的新穎的免疫細胞示蹤方法的一個具體實施例中，APC anti-human⑶3的 用量為7.8此。
[0020] 本申請的新穎的免疫細胞示蹤方法的一個具體實施例中，T細胞的用量為3X106 個細胞。
[0021] 本申請的新穎的免疫細胞示蹤方法的一個具體實施例中，T細胞的用量為5X106 個細胞。
[0022] 本申請的新穎的免疫細胞示蹤方法的一個具體實施例中，T細胞的用量為7X106 個細胞。
[0023] 本申請的新穎的免疫細胞示蹤方法的一個具體實施例中，T細胞的用量為9X106 個細胞。
[0024] 本申請的新穎的免疫細胞示蹤方法的一個具體實施例中，熒光抗體和免疫細胞結 合的孵育時間為18mins。
[0025] 本申請的新穎的免疫細胞示蹤方法的一個具體實施例中，熒光抗體和免疫細胞結 合的孵育時間為30mins。
[0026] 本申請的新穎的免疫細胞示蹤方法的一個具體實施例中，熒光抗體和免疫細胞結 合的孵育時間為60mins。
[0027] 本申請的新穎的免疫細胞示蹤方法的一個具體實施例中，結合熒光抗體的免疫細 胞體外檢測的曝光時間為1 s。
[0028] 本申請的新穎的免疫細胞示蹤方法的一個具體實施例中，結合熒光抗體的免疫細 胞體外檢測的曝光時間為50s。
[0029] 本申請的新穎的免疫細胞示蹤方法的一個具體實施例中，結合熒光抗體的免疫細 胞體外檢測的曝光時間為200s。
[0030] 本申請的新穎的免疫細胞活體示蹤方法的一實施方式中，小動物為裸鼠。
[0031 ]本申請的新穎的免疫細胞活體示蹤方法的一個具體實施例中熒光抗體標記的免 疫細胞從腹部皮內注射入小動物體內。
[0032]本申請的新穎的免疫細胞活體示蹤方法的一個具體實施例中熒光抗體標記的免 疫細胞從背部皮內注射入小動物體內。
[0033] 本申請的新穎的免疫細胞示蹤方法的一個具體實施例中熒光抗體標記的免疫細 胞經尾靜脈注射入小動物體內。
[0034] 本申請的新穎的免疫細胞活體示蹤方法的一具體實施例中，免疫細胞注射深度為 皮下0 ? 5cm。
[0035] 本申請的一個具體實施例中，所述小動物是裸鼠。
[0036] 本申請還提供了一種用于免疫細胞示蹤的試劑盒，包括偶聯熒光染料的抗體和緩 沖液，其中，所述熒光抗體上偶聯的熒光染料包括共輒結合探針、Alexa Fluor系列熒光染 料、Cy系列熒光染料、細胞功能探針、熒光蛋白，所述緩沖液為磷酸緩沖液(PBS)。
[0037] 本申請還提供了偶聯熒光染料的抗體在制備用于免疫細胞示蹤的試劑盒中的用 途，當使用所述試劑盒時，包括以下步驟：（1)提供免疫細胞；（2)用偶聯熒光染料的抗體標 記步驟（1)獲得的免疫細胞，然后體外檢測標記免疫細胞的熒光強度；（3)將標記好的免疫 細胞注射到實驗動物體內；（4)采用動物活體成像儀檢測實驗動物體內熒光強度；（5)計算 數據，確定免疫細胞在體內的分布、迀徙和存活時間。在一些實施方案中，所述免疫細胞選 自T細胞、B細胞、NK細胞、DC細胞、免疫調節細胞、造血母細胞。在一些實施方案中，所述T細 胞包括CD3+、CD4+;所述B細胞包括CD 19+;所述NK細胞包括CD3-/CD (16+56) + ;所述免疫調節 細胞包括⑶4+/⑶29+;所述造血母細胞包括⑶33+和⑶34+。在一些實施方案中，所述免疫細 胞為T細胞，所述T細胞為CD3+。在一些實施方案中，所述熒光抗體上偶聯的熒光染料選自共 輒結合探針、A1 exa Fluor系列熒光染料、Cy系列熒光染料、細胞功能探針、熒光蛋白和其他 探針。在一些實施方案中，所述共輒結合探針包括Allophycocyanin(APC)、Texas Red;所述 Alexa Fluor系列焚光染料包括Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、 Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647;所述Cy系列焚光染料包括Cy3.5;所述細胞功能探針 包括SNARF、Flu〇-3;所述熒光蛋白包括TagYFP、EYFP和Topaz。在一些實施方案中，所述熒光 抗體為別藻藍蛋白 -抗CD3抗體(APC anti-human CD3)。在一些實施方案中，所述步驟(2)是 將免疫細胞與熒光抗體混勻后冰浴條件下孵育，所述孵育反應體系中，所述熒光抗體的用 量為0.2~7.8yL，所述免疫細胞的用量為1~15 X106個細胞，所述熒光抗體和免疫細胞結 合的孵育時間為5mins~60mins，結合焚光抗體的免疫細胞體外檢測的曝光時間為0 . Is~ 200s。在一些實施方案中，所述步驟(2)是將免疫細胞與熒光抗體混勻后冰浴條件下孵育， 所述孵育反應體系中，所述熒光抗體的用量為1~6yL，所述免疫細胞的用量為3~7 X106個 細胞，所述熒光抗體和免疫細胞結合的孵育時間為18mins~40mins，所述結合熒光抗體的 免疫細胞體外檢測的曝光時間為〇. Is~80s。在一些實施方案中，所述步驟(3)中，所述步驟 (3)中，熒光抗體標記的免疫細胞注射入小動物體內的方式包括但不限于腹部皮內注射，背 部皮內注射，體內經尾靜脈注射。
[0038] 以上本申請的免疫細胞示蹤方法，用于免疫細胞示蹤的試劑盒和偶聯熒光染料的 抗體在制備用于免疫細胞示蹤的試劑盒中的應用才用到的免疫細胞注射操作，為免疫研究 實驗領域普通的熟練技術人員按照有關實驗手冊和實驗室制定的操作規程如國家實驗動 物規范中心發布的《實驗動物常規手冊》(//www.dxy.cn/bbs/topic/5936828)、《動物 免疫技術操作規程》或操作注意事項都能容易掌握的一種常規操作技術。注射免疫細胞到 小動物體內的操作不存在個體差異，能重復再現，是能夠產業化的。
[0039] 本申請的有益效果是，本申請的基于熒光抗體的新穎免疫細胞示蹤方法及試劑盒 能實現特異性強，快速、準確對特定種類免疫細胞及其細分亞群和免疫細胞內的細胞器和 特定分子在不同發育時期，各種實驗動物中的分布、迀徙和存活時間、含量進行實時動態的 觀察，并且不引進新的基因、不添加底物，可為生命科學領域特別是免疫學研究領域深入了 解免疫活性細胞殺傷腫瘤細胞的機制以及腫瘤的過繼性免疫細胞治療的基礎科研工作和 臨床應用提供技術支持，將進一步促進腫瘤臨床治療技術的發展。
[0040] 本申請的其它特征和優點將在隨后的說明書中闡述，并且，部分地從說明書中變 得顯而易見，或者通過實施本申請而了解。本申請的目的和其他優點可通過在說明書、權利 要求書以及附圖中所特別指出的結構來實現和獲得。
【附圖說明】
[0041] 附圖用來提供對本申請技術方案的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本 申請的實施例一起用于解釋本申請的技術方案，并不構成對本申請技術方案的限制。
[0042] 圖1 .T細胞經APC anti-human⑶3標記后流式細胞儀檢測結果；
[0043] A.流式細胞儀檢測經APC anti-human⑶3標記的T細胞的散點圖 [0044](橫坐標:前向角散射，縱坐標:側向角散射）
[0045] B.P1門樣品（多通道)檢測直方圖
[0046] (橫坐標:別藻藍蛋白A濃度，縱坐標:T細胞和別藻藍蛋白A標記的T細胞計數）
[0047] 圖2.不同體積APC anti-human⑶3標記3 X 106個細胞后檢測到的光子數。橫坐標 為APC Anti-human CD3體積(此），縱坐標為熒光強度(光子/s);
[0048] 圖3.以測得的APC anti-human CD3標記T細胞的最適比例，即5yL/3X106個細胞 標記小動物后檢測熒光強度(光子/s)和細胞數的關系。橫坐標為細胞個數，縱坐標為熒光 強度，數據見表2;
[0049] 圖4.96孔板檢測不同濃度的APC anti-human⑶3標記T細胞產生熒光，其中孔A1、 3、5細胞數為9X106,孔A7、9、ll細胞數為7X106,孔Cl、3、5細胞數為5X10 6,孔C7、9、ll細胞 數為3 X 106，孔E1、3、5細胞數為1 X 106，孔E7、9、11細胞數為9 X 105，孔G1、3、5細胞數為7 X 105，孔G7、9、11細胞數為5 X 105。孔F12為陰性對照，細胞數為1 X 107;
[0050] 圖5 ?以APC anti-human CD3標記T細胞的最適比例，即5yL/3X106個細胞標記5X 1〇5個細胞后檢測熒光強度(光子/s)隨時間的變化。橫坐標為時間(min)，縱坐標為熒光強 度(光子/s)，數據見表3;
[00511圖6 .為APC標記殺傷性T細胞體外檢測和經腹部皮內注射體內檢測（左側為對照 鼠，右側為實驗鼠）:A為APC標記殺傷性T細胞體外檢測;B為A中APC標記殺傷性T細胞經皮內 注射后體內檢測;C將B圖中小鼠翻轉時候熒光檢測;D為B中小鼠次日熒光檢測圖；E為在體 夕Kin vitro)和體內第1天（in vivol)和第2天（in vivo2)光子/s隨細胞數的變化關系坐 標圖，其中縱坐標為熒光強度，橫坐標為細胞數。
[0052]圖7 .APC標記殺傷性T細胞體外檢測和經背部皮內注射體內檢測:A為APC標記殺傷 性T細胞體外檢測;B為A中APC標記殺傷性T細胞經皮內注射裸鼠背部后體內檢測;C為B中小 鼠次日熒光檢測圖;D為在體外(A)和體內（B)光子/s隨細胞數的變化關系；
[0053]圖8.在體外（in vitro)和在體內檢測APC標記殺傷性T細胞體：左側為對照鼠，右 側為實驗鼠。圖A、B、C:A為尾靜脈注射前;B為尾靜脈注射后立即檢測；圖C為尾靜脈注射后 lh檢測。
【具體實施方式】
[0054]下面將以實施例的方式對本申請作進一步的詳細描述，以使本領域技術人員能夠 實踐本申請。應當理解，可以采用其他實施方式，并且可以做出適當的改變而不偏離本申請 的精神或范圍。為了避免對于使本領域技術人員能夠實踐本申請來說不必要的細節，說明 書可能省略了對于本領域技術人員來說已知的某些信息。因此，以下詳細描述不應以限制 性的意義來理解，且本申請的范圍僅由所附權利要求界定。需要說明的是，在不沖突的情況 下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互任意組合。
[0055] 以下的實施例便于更好地理解本申請，但并不用來限制本申請的范圍。
[0056] 下述實施例中所使用的各原料，除特別指出的以外，均可由市售獲得。
[0057]實驗儀器：
[0058] 流式細胞儀 BECKMAM COVLTER Cytollcx 小動物活體成像儀 SI Imaging AmiX 離心機 Thermo ST40R 禹心機 .Eppendorl、 5424R 顯微鏡 Nikon ECLIPSE Ty-S % 孔板 Nesi Brolech 滅菌鍋 上海博迅實業有限公司 YXQ-LS-100G 注射器 江蘇治宇醫療器材有限公司 1ML ( 0.45x 16 )
[0059] 試劑：
[0060] APC anti-human CD3 Biolegend Catalog:300312
[0061] 無熒光鼠糧 北京科澳協力飼料有限公司
[0062] 怡美寧(異氟烷） 山東科瀝制藥有限公司
[0063] 實驗動物：
[0064] 裸鼠 斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司
[0065] 實施例1流式細胞儀檢測APC anti-human⑶3標記的T細胞
[0066] 將培養基中T細胞計數后，取1X106細胞于lmL離心管中，800g離心6min，將上清棄 去，用預冷的PBS重懸細胞后，800g離心6min，將上清棄去，用100yL預冷的PBS重懸細胞，取 APC anti-human⑶3抗體lyL加入細胞中，混勻后冰浴條件下孵育30min，加入600yL預冷的 PBS重懸細胞，800g離心6min，將上清棄去，重復洗滌一次，用100此預冷的roS重懸，作為實 驗組。在對照組中用緩沖液代替APC anti-human CD3抗體，其他操作與實驗組完全相 同。流式細胞儀分析APC anti-human 0)3標記的T細胞(圖1)。
[0067] 從圖1的A和B判斷，APC標記人T細胞后形成APC-Anti-human CD3。
[0068] 實施例2.APC anti-human CD3標記人T細胞的最適用量
[0069] 用不同體積APC anti-human CD3標記3X106個細胞，以0.2yL梯度取0-7.8yL間的 40個點。檢測空板(background)和加入細胞后(細胞+空板)的光子數(表1)
[0070] 具體步驟如下：將培養基中T細胞計數后，取1.5 X 108細胞于50mL離心管中，800g 離心6min，將上清棄去，用預冷的roS重懸細胞后，800g離心6min，將上清棄去，用預冷的PBS 重懸細胞至終濃度3 X 107/mL，將細胞分裝成40管，每管lOOyL，按0、0.2、0.4……7.4、7.6、 7.8yL以0.2yL梯度每管加 APC anti-human CD3抗體(表1)，混勻后冰浴條件下孵育60min， 800g離心6min，將上清棄去，用500此預冷的PBS重懸，800g離心6min，將上清棄去，用lOOyL 預冷的PBS重懸細胞，將細胞懸液置于96孔板中，使用小動物成像儀測定熒光強度。
[0071] 圖2中，熒光強度(光子/s)與APC anti-human⑶3用量呈拋物線趨勢，二項式曲線 y = -l X 107x2+l X 108x+l X 108，R2 = 0.914,即APC anti-human CD3最適體積為5yL/3 X 106 個細胞（圖2)。采用0.2~7.8yL的體積APC anti-human CD3都可獲得可檢測的標記T細胞， APC anti-human CD3最適體積為5yL/3X106個細胞。
[0072] 表1.96孔板對應上樣孔和加入不同體積APC anti-human CD3標記3 X 106個細胞 后檢測到的光子數
[0074]實施例3.以最適體積標記人T細胞后可檢測到熒光的最小細胞數 [0075] 以APC anti-human CD3的最適體積標記T細胞，即5yL/3X106個細胞。每組設有三 個平行孔，1〇〇此細胞懸液中的細胞數分別為5 X 105、7 X 105、9 X 105、1 X 106、3 X 106、5 X 106、7\106、9\106，分別進行18、10 8、208、308、508、1008、2008曝光。具體步驟如下：將培養 基中T細胞計數后，取1X108細胞于50mL離心管中，800g離心6min，將上清棄去，用預冷的 PBS重懸細胞后，800g離心6min，將上清棄去，用預冷的PBS重懸細胞，取APC anti-human CD3抗體167yL加入細胞中，混勻后冰浴條件下孵育50min，800g離心6min，將上清棄去，用 5mL預冷的PBS重懸，800g離心6min，將上清棄去，用lmL預冷的PBS重懸細胞至終濃度IX 108/mL，按下表中的濃度用預冷的PBS稀釋細胞后，將細胞懸液置于96孔板中，使用小動物 成像儀測定焚光強度。每個樣做3次重復。對照組:未經APC an t i -human CD3標記的T細胞。 將分裝好的96孔板，按不同條件曝光后觀察并記錄結果。
[0076]由圖3可見，結果都只能在9 X 106、7 X 106、5 X 106和3 X 106個細胞處有效檢測到熒 光（圖3,曝光200s)。在10s到200s曝光條件下的R2值分別為0.975、0.975、0.974、0.973、 0.969和0.961。在Is曝光條件下，在3 X 106~9 X 106個細胞范圍內光子數與細胞個數呈良好 的線性關系R2 = 〇.976(表2和圖4)。可有效檢測到熒光的最少T細胞數為3X106個細胞。 [0077] 表2 ?曝光Is條件下，以APC anti-human CD3標記T細胞的最適比例，即5yL/3X106 個細胞，標記細胞后檢測不同細胞數的熒光強度(光子/s)
[0079] 實施例4.以最適體積標記人T細胞后熒光強度隨時間的變化關系
[0080] 以得到的APC anti-human CD3的最適體積標記T細胞，即5yL/3X106個細胞。每組 設三個平行孔，每個孔有5 X 106個細胞。分別在標記0、2、4……18、20、25……50、55、60min 進行Is曝光(表3)。
[0081 ] 具體步驟如下：將培養基中T細胞計數后，取1.5 X 107細胞于50mL離心管中，800g 離心6min，將上清棄去，用預冷的roS重懸細胞后，800g離心6min，將上清棄去，用預冷的PBS 重懸細胞，取APC anti-human CD3抗體25此加入細胞中，混勻后冰浴條件下孵育40min， 800g離心6min，將上清棄去，用500此預冷的PBS重懸，800g離心6min，將上清棄去，用300此 預冷的重懸細胞至終濃度5X10 7/mL，按表3中的濃度用預冷的roS稀釋細胞后，將細胞 懸液置于96孔板中，使用小動物成像儀測定熒光強度。
[0082] 由圖5可知，在APC anti-human⑶3與免疫細胞孵育0至60min光子數無明顯變化， 都可有效檢測到熒光。
[0083] 表3 ?曝光Is條件下，以APC anti-human CD3標記T細胞的最適比例，即5yL/3X106 個細胞，標記5X105個細胞后檢測熒光強度(光子/s)隨時間的變化
[0085]實施例5裸鼠體內檢測APC標記殺傷性T細胞
[0086] 以APC anti-human CD3的最適體積標記細胞，即5yL/3X106個細胞。
[0087]經皮內注射裸鼠腹部
[0088]皮內注射裸鼠腹部具體步驟如下：將培養基中T細胞計數后，取7X 107細胞于50mL 離心管中，800g離心6min，將上清棄去，用預冷的roS重懸細胞后，800g離心6min，將上清棄 去，用預冷的PBS重懸細胞，取APC anti-human⑶3抗體110.5yL加入細胞中，混勻后冰浴避 光條件下孵育25min，800g離心6min，將上清棄去，用5mL預冷的PBS重懸，800g離心6min，將 上清棄去，用7mL預冷的PBS重懸細胞至終濃度1 X l〇VmL。分成3組，每組分別取重懸液lmL、 2mL和-LdOOg離心6min，將上清棄去，每組用200yL預冷的roS重懸細胞。每組細胞重懸液 用規格為0.45X16的無菌注射器經皮內注射lOOiiL，使用小動物成像儀測定熒光強度。
[0089] 在5\106、1\107和2乂107個細胞注射的部位均可見到形狀規則的熒光信號，在曝 光時間相同的條件下(曝光50s)，這與體外檢測結果基本一致（圖6A、B)，將小鼠翻轉之后沒 有檢測到明顯的熒光信號（圖6C)。次日，對經皮內注射的裸鼠腹部進行跟蹤檢測，腹部仍可 檢測到形態規則的熒光信號（圖6D)。
[0090] 經皮內注射裸鼠背部
[0091] 皮內注射裸鼠背部具體步驟如下:將培養基中T細胞計數后，取4X107細胞于50mL 離心管中，800g離心6min，將上清棄去，用預冷的roS重懸細胞后，800g離心6min，將上清棄 去，用預冷的PBS重懸細胞，取APC anti-human CD3抗體66.5yL加入細胞中，混勻后冰浴避 光條件下孵育30min，800g離心6min，將上清棄去，用lmL預冷的PBS重懸，800g離心6min，將 上清棄去，用4mL預冷的roS重懸細胞至終濃度1 X l〇VmL。分成3組，每組分別取重懸液600y L、1.4mL和SmLSOOg離心6min，將上清棄去，每組用200yL預冷的PBS重懸細胞。每組細胞重 懸液用規格為0.45 X 16的無菌注射器經皮內注射lOOyL，使用小動物成像儀測定熒光強度。 [0092]在7 X 106和1 X 107個細胞注射部位均可見到形狀規則的熒光信號，在曝光時間相 同的條件下（曝光50s)，這與體外檢測結果基本一致（圖7A、B)。次日，對經皮內注射的裸鼠 背部進行跟蹤檢測，背部檢測不到形態規則的熒光信號（圖7C)。與APC anti-human⑶3標 記的T細胞經皮內注射在裸鼠背部相比，皮內注射在裸鼠腹部熒光持續時間更長。
[0093]經尾靜脈注射裸鼠體內
[0094]具體步驟如下：將培養基中T細胞計數后，取2X107細胞于50mL離心管中，800g離 心6min，將上清棄去，用預冷的PBS重懸細胞后，800g離心6min，將上清棄去，用預冷的roS重 懸細胞，取APC anti-human CD3抗體33.5yL加入細胞中，混勻后冰浴避光條件下孵育 30min，800g離心6min，將上清棄去，用lmL預冷的PBS重懸，800g離心6min，將上清棄去，200ii L預冷的PBS重懸細胞。細胞重懸液用規格為0.45X16的無菌注射器經皮內注射100yL，使用 小動物成像儀測定熒光強度。
[0095] 以APC anti-human CD3的最適體積標記細胞，即5yL/3X106個細胞。1X107個細 胞，在腹部左下處檢測到熒光信號（圖8B)，lh后檢測到熒光信號形態變規則（圖8C)。
[0096]由本實施例可知，經腹部、背部尾部皮內注射APC anti-human CD3標記的免疫細 胞，都可采用小動物成像儀檢測熒光信號形態變了解到免疫細胞在動物體內的分布和迀徙 及數量信息。本申請為研究免疫細胞在動物體內的分布和迀徙及數量信息提供了一種簡單 有效及特異性強的方法。
[0097]雖然本申請所揭露的實施方式如上，但所述的內容僅為便于理解本申請而采用的 實施方式，并非用以限定本申請。任何本申請所屬領域內的技術人員，在不脫離本申請所揭 露的精神和范圍的前提下，可以在實施的形式及細節上進行任何的修改與變化，但本申請 的專利保護范圍，仍須以所附的權利要求書所界定的范圍為準。
【主權項】
1. 一種免疫細胞示蹤方法，所述方法包括以下步驟： (1) 提供免疫細胞； (2) 用偶聯熒光染料的抗體標記步驟（1)獲得的免疫細胞，然后體外檢測標記免疫細胞 的熒光強度； (3) 將標記好的免疫細胞注射到實驗動物體內； (4) 采用動物活體成像儀檢測實驗動物體內熒光強度； (5) 計算數據，確定免疫細胞在體內的分布、迀徙和存活時間。2. 根據權利要求1所述的免疫細胞示蹤方法，其中，所述免疫細胞選自T細胞、B細胞、NK 細胞、DC細胞、免疫調節細胞、造血母細胞。3. 根據權利要求2所述的免疫細胞示蹤方法，其中，所述T細胞包括CD3+、CD4+;所述B細 胞包括CD19+;所述NK細胞包括CD3-/CD( 16+56) +;所述免疫調節細胞包括CD4+/CD29+;所述 造血母細胞包括⑶33+和⑶34+。4. 根據權利要求1所述的免疫細胞示蹤方法，其中，所述免疫細胞為T細胞，所述T細胞 為CD3+。5. 根據權利要求1所述的免疫細胞示蹤方法，其中，所述熒光抗體上偶聯的熒光染料選 自共輒結合探針、Alexa Fluor系列熒光染料、Cy系列熒光染料、細胞功能探針、熒光蛋白和 其他探針。6. 根據權利要求5所述的免疫細胞示蹤方法，其中，所述共輒結合探針包括 Allophycocyanin(APC)、Texas Red;所述Alexa Fluor系列焚光染料包括Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647;所述Cy系 列熒光染料包括Cy3.5;所述細胞功能探針包括SNARF、Flu〇-3;所述熒光蛋白包括TagYFP、 EYFP和Topaz。7. 根據權利要求1所述的免疫細胞示蹤方法，其中，所述熒光抗體為別藻藍蛋白-抗CD3 抗體(APC anti-human CD3)。8. 根據權利要求1所述的免疫細胞示蹤方法，其中，所述步驟(2)是將免疫細胞與熒光 抗體混勻后冰浴條件下孵育，所述孵育反應體系中，所述熒光抗體的用量為0.2~7. SyL，所 述免疫細胞的用量為1~15 X IO6個細胞，所述熒光抗體和免疫細胞結合的孵育時間為 5mins~60mins，結合焚光抗體的免疫細胞體外檢測的曝光時間為0.1 s~200s。9. 根據權利要求1所述的免疫細胞示蹤方法，其中，所述步驟(2)是將免疫細胞與熒光 抗體混勻后冰浴條件下孵育，所述孵育反應體系中，所述熒光抗體的用量為1~6yL，所述免 疫細胞的用量為3~7 X IO6個細胞，所述熒光抗體和免疫細胞結合的孵育時間為18mins~ 40mins，所述結合焚光抗體的免疫細胞體外檢測的曝光時間為0.1 s~80s。10. 根據權利要求1所述的免疫細胞示蹤方法，其中，所述步驟(3)中，將熒光抗體標記 的免疫細胞注射入小動物體內遵守如下操作要求： A、 所述小動物包括裸鼠，兔子，狗、貓，綿羊； B、 熒光抗體標記的免疫細胞注射入小動物體內的部位選自腹部皮內注射，背部皮內注 射，體內經尾靜脈注射中的一種； C、 接受所述熒光抗體標記的免疫細胞注射的小動物年齡為整個存活周期，優選存活中 期； D、所述注射深度為皮下O~Icm組織。11. 一種用于免疫細胞示蹤的試劑盒，包括偶聯熒光染料的抗體和緩沖液，其中，所述 熒光抗體上偶聯的熒光染料包括共輒結合探針、Alexa Fluor系列熒光染料、Cy系列熒光染 料、細胞功能探針、熒光蛋白，所述緩沖液為磷酸緩沖液(PBS)。12. 偶聯熒光染料的抗體在制備權利要求11的用于免疫細胞示蹤的試劑盒中的用途， 當使用所述試劑盒時，包括以下步驟： (1) 提供免疫細胞； (2) 用所述偶聯熒光染料的抗體標記步驟(1)獲得的免疫細胞;然后體外檢測標記免疫 細胞的熒光強度； (3) 將標記好的免疫細胞注射到實驗動物體內； (4) 采用小動物活體成像儀檢測實驗動物體內熒光強度； (5) 計算數據，確定免疫細胞在體內的分布、迀徙和存活時間。13. 根據權利要求12所述的用途，其中，所述免疫細胞選自T細胞、B細胞、NK細胞、DC細 胞、免疫調節細胞、造血母細胞。14. 根據權利要求13所述的用途，其中，所述T細胞包括⑶3+、CD4+;所述B細胞包括⑶19 + ;所述NK細胞包括⑶3-/⑶（16+56) + ;所述免疫調節細胞包括⑶4+/⑶29+;所述造血母細胞 包括 CD33+和 CD34+。15. 根據權利要求12所述的用途，其中，所述免疫細胞為T細胞，所述T細胞為CD3+。16. 根據權利要求12所述的用途，其中，所述熒光抗體上偶聯的熒光染料選自共輒結合 探針、Alexa Fluor系列熒光染料、Cy系列熒光染料、細胞功能探針、熒光蛋白和其他探針。17. 根據權利要求16所述的用途，其中，所述共輒結合探針包括Al Iophycocyanin (APC)、Texas Red;所述Alexa Fluor系列焚光染料包括Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647;所述Cy系列焚光染料包括 Cy3.5;所述細胞功能探針包括SNARF、Flu〇-3;所述熒光蛋白包括TagYFP、EYFP和Topaz。18. 根據權利要求12所述的用途，其中，所述熒光抗體為別藻藍蛋白-抗CD3抗體(APC anti-human CD3)〇19. 根據權利要求12所述的用途，其中，所述步驟(2)是將免疫細胞與熒光抗體混勻后 冰浴條件下孵育，所述孵育反應體系中，所述熒光抗體的用量為〇. 2~7. SyL，所述免疫細胞 的用量為1~15\106個細胞，所述熒光抗體和免疫細胞結合的孵育時間為51^1^~6〇1^11 8， 結合熒光抗體的免疫細胞體外檢測的曝光時間為0.1s~200s。20. 根據權利要求12所述的用途，其中，所述步驟(2)是將免疫細胞與熒光抗體混勻后 冰浴條件下孵育，所述孵育反應體系中，所述熒光抗體的用量為1~6yL，所述免疫細胞的用 量為3~7\10 6個細胞，所述熒光抗體和免疫細胞結合的孵育時間為181^1^~4〇11^1^，所述 結合熒光抗體的免疫細胞體外檢測的曝光時間為0.1s~80s。21. 根據權利要求12所述的用途，其中，所述步驟(3)中，熒光抗體標記的免疫細胞注射 入小動物體內的方式包括但不限于腹部皮內注射，背部皮內注射，體內經尾靜脈注射。
【文檔編號】G01N33/50GK105929146SQ201610237612
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月15日
【發明人】宮健, 劉書磊, 徐義, 韓化敏
【申請人】拜西歐斯（北京）生物技術有限公司