一種用于中藥藥代動力學評價的多組分高通量定量分析技術的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物藥物分析領域，具體涉及用于評價中藥藥代動力學的生物樣品中 多組分同時定量分析的UPLC-MS/MS技術。
【背景技術】
[0002] 中藥藥代動力學是中藥藥效物質基礎研究與闡述的重要手段，是采用現代分析技 術測定生物樣品中各中藥組分的濃度，運用數學原理和模型闡述生物體內中藥組分隨時間 變化的規律，并與中藥的臨床表征關聯以闡釋中藥的藥效物質。傳統的中藥藥代動力學常 規方法依照化學藥物藥代動力學模式，僅僅檢測生物樣品中極少數可獲得標準對照品的指 標成分并評價其藥代動力學行為特征，但少數指標成分的藥動學行為難以闡釋整體中藥的 多組分、多靶點的協同作用機制。因此，中藥藥效物質的整體藥代動力學評價方法亟待建 立。但是，中藥的藥效物質組分復雜、并且其中的大多數難以獲得標準對照品，這是中藥多 組分整體藥代動力學評價的技術瓶頸。
[0003] 為了解決這一技術瓶頸，吉林大學顧景凱等提出了 "一種用于多組分中藥的藥 物代謝動力學的分析方法"（中華人民共和國國家知識產權局.發明專利.發明【申請號】 201010613662. 8 ;申請公布號：CN102175783A)，該方法以原料藥為"標準品"，相對定量生 物樣品中各組分的濃度，并以此評價中藥多組分的藥動學行為特征，初步解決了在沒有標 準品的情況下，實現對生物樣品中多組分中藥進行"相對定量"分析。他們運用該技術以升 麻總皂苷原料藥為"標準品"，對升麻總皂苷中的14種已知和未知組分進行了藥代動力學 評價，并對其中3種已知組分與對照品外標法進行了比較，部分藥動學參數，如體內滯留時 間MRT cm、達峰時間Tmax和半衰期t1/2等評價結果一致。
[0004] 然而，該技術仍然存在2個無法克服的缺陷：①運用該技術測得的數據，僅能夠對 諸如體內滯留時間MRT(h)、達峰時間T max(h)和半衰期t1/2(h)等以時間為單位的藥動學參 數進行定量評價；而無法評價諸如峰濃度C max(y g/mL)、曲線下面積AUC(y g/mL*h)、表觀 分布容積Vd(L/kg)及腎清除率CL(L/kg/h)等多項與濃度或量有關的重要指標；②原料藥 進入生物體內后可產生I相與II相代謝產物，這些代謝產物常與中藥的原形組分具有協同 作用，需要同時分析與評價。但該技術僅能夠實現對原料藥中存在的原形組分的監測，而對 于生物體內產生的代謝產物則無法進行監測與評價。

【發明內容】

[0005] 為了克服常規方法與上述新技術的缺陷，本發明建立了一種基于不加校正因子的 內參比物多組分高通量分析技術，以實現僅需少數標準對照品即可對生物樣品中中藥的原 形組分及其代謝產物進行多組分的同時定量，進而全面評價中藥的整體藥代動力學特征。 具體的技術方案是：
[0006] (1)制備一定濃度的中藥（單味或復方）提取物溶液（以下稱為"原藥液"）；
[0007] (2)給予實驗動物原藥液后收集動物尿液（以下稱為"尿液"）；
[0008] (3)采用液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS)多反應監測（MRM)模式，建立原藥液 與尿液中各組分及代謝產物的離子反應的母離子與子離子等定性定量參數；
[0009] (4)建立并驗證所選取的內參比物的分析法，包括：內標物、生物樣品預處理、內 參比物的線性范圍與定量限、方法精密度與準確度、回收率與基質效應等；
[0010] (5)實驗動物給予原藥液后按擬定時間點采集生物樣品；
[0011] (6)依據步驟（3)建立的各組分及代謝產物的分析條件記錄各時間點生物樣品中 各組分的質譜響應信號；
[0012] (7)依據步驟⑷建立的各內參比物標準曲線計算步驟（6)獲得的各時間點生物 樣品中各內參比物及其相關組分的濃度；
[0013] (8)建立各組分的濃度-時間曲線，并計算藥代動力學參數；
[0014] (9)經與藥效動力學的生物效應-時間曲線擬合，評價各組分的PK-ro相關性；
[0015] (10)將各組分的濃度通過數學模型"整合"后，以"整合"濃度與藥效動力學的生 物效應響應擬合，最終評價并驗證中藥的藥效物質及其作用機制。
[0016] 所述的中藥為植物性中藥材、中成復方及中藥的各種現代劑型。所述的中藥溶液 為用中藥制成的供口服或注射用的溶液。所述的給予優選經灌胃或靜脈注射給予。所述的 實驗動物為小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬。所述的生物樣品優選動物血清、血漿。所述的動物排泄 物優選動物尿液、糞便。所述的現代分析技術優選液相色譜-質譜（LC-MS)、液相色譜-串 聯質譜（LC-MS/MS)技術，其中液相色譜優選高效液相色譜（HPLC)、超高效液相色譜（UPLC 或Ultra-HPLC)。所述的分析條件優選選擇離子監測模式（SM)的特征離子、多反應離子監 測模式（MRM)模式的反應離子對。所述的原形組分為中藥中存在的可監測的已知與未知組 分。所述的代謝產物為中藥在動物體內經I相與II相代謝所產生的I相代謝物與II相代 謝物。所述的內參比物為一類具有共同結構特征的系列化合物的典型結構化合物。所述的 相關組分為與內參比物具有共同結構特征的同類系列化合物。所述的計算為使用內參比物 的標準曲線計算包括內參比物在內的具有共同結構特征的同類系列化合物的濃度。
[0017] 本發明還提供了基于權利要求1的方法原理編制的數據采集與處理程序。所述的 數據為檢測的質譜信號以及由此衍生出來的生物樣品中各組分濃度、整合組分濃度、中藥 藥代動力學參數。所述的整合組分濃度為生物樣品中各效應組分濃度經一定的數學模型整 合的表觀效應濃度。所述的效應組分為與生物效應存在相關性（包括正相關和負相關）的 可檢測組分。所述的表觀效應濃度為所有可檢測效應組分的綜合濃度。所述的數學模型包 括但不限于以下數學公式：
【主權項】
1. 一種用于中藥藥代動力學評價的多組分高通量分析方法，具有以下步驟： 制備一定濃度的供口服或注射用的中藥溶液； 經灌胃或靜脈注射給予實驗動物由步驟（1)制備的溶液后收集動物尿液或糞便排泄 物，并制成相應的溶液； 米用液相色譜_質譜（LC-MS)、液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS)等現代分析技術，建立 由步驟（1)與步驟（2)制備的溶液中所含的中藥原形組分及其已知或未知I相或II相代 謝產物的定性定量參數； 采用由步驟（3)建立的組分分析條件，建立并驗證所選取的內參比物的分析方法，包 括：生物樣品預處理、內參比物的線性范圍與定量限、方法精密度與準確度、回收率與基質 效應等； 給予實驗動物由步驟（1)制備的溶液后按擬定時間點采集生物血清、血漿樣品； 采用由步驟（3)建立的分析條件，檢測并記錄各時間點生物樣品中各組分的質譜響 應信號；采用步驟（4)建立的方法計算各內參比物及其相關組分的濃度；建立各組分的濃 度-時間曲線，并計算藥代動力學參數。
2. -種中藥藥代動力學評價軟件，其特征在于：基于權利要求1的方法原理編制的數 據采集與處理程序。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述的中藥為植物性中藥材、中成復方及 中藥的各種現代劑型。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述的實驗動物為小鼠、大鼠、豚鼠、兔、 犬。
5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述的內參比物為一類具有共同結構特 征的系列化合物的典型結構化合物。
6. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述的計算為使用內參比物的標準曲線 計算包括內參比物在內的具有共同結構特征的同類系列化合物的濃度。
7. 根據權利要求2所述的軟件，其特征在于：所述的數據為檢測的質譜信號以及由此 衍生出來的生物樣品中各組分濃度、整合組分濃度、中藥藥代動力學參數。
8. 根據權利要求7所述的方法，其特征在于：所述的整合組分濃度為生物樣品中各效 應組分濃度經一定的數學模型整合的表觀效應濃度。
9. 根據權利要求8所述的方法，其特征在于：所述的表觀效應濃度為所有可檢測效應 組分的綜合濃度。
10. 根據權利要求8所述的方法，其特征在于：所述的數學模型包括但不限于以下數學 公式：
式中，f i為第i個時間點生物樣品中效應組分的"表觀效應濃度";為第i個時間 點生物樣品中第j個效應組分的濃度;矣為第j個效應組分PK-ro擬合曲線的斜率，正相關 時符號不變，當負相關時符號相反。
【專利摘要】本發明屬于組分藥物分析技術領域。采用超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)多反應監測(MRM)掃描模式，建立生物體內多組分的定量反應離子，以典型結構類型的代表組分作為“內參比物”，定量分析生物體內的中藥原形組分與生物體內代謝產物的濃度，并以中藥原形組分與代謝產物制備混合質控樣品驗證方法并監控分析過程。本發明建立的基于不加校正因子的內參比物多組分高通量分析技術，解決了多組分定量分析缺乏標準對照品的技術障礙，實現僅以少數組分的標準對照品即可對生物樣品中可監測中藥原形組分及其代謝產物進行多組分的整體定量。采用本技術對中藥復方的已知與未知組分及代謝產物進行了多組分整體藥代動力學評價。結果表明，本技術符合CFDA的相關技術要求。
【IPC分類】G01N30-88
【公開號】CN104833748
【申請號】CN201410048405
【發明人】于治國, 趙云麗, 趙星, 陳曉輝
【申請人】沈陽藥科大學
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2014年2月11日