專利名稱：人胎盤泌乳素診斷試劑的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種診斷血球、單向免疫擴散板，具體地說是涉及人胎盤泌乳素(HPL)的診斷血球、單向免疫擴散板的制備方法和應用。
人胎盤泌乳素(HPL)是由胎盤合體滋養層細胞分泌的，測定孕婦血中HPL的含量，能反映胎盤體積和功能的變化，目前多采用放射免疫法，雖測值可信，但由于放射性衰變和需要貴重的醫療設備，不易普及基層醫院。
本發明的目的是提供一種在孕晚期、足月或過期妊娠情況下，測定HPL值的診斷血球、單向免疫擴散板的制備方法和應用。
本發明中人胎盤泌乳素(HPL)診斷血球、單向免疫擴散板的制備方法采用如下步驟1HPL的提純1.1飽和硫酸銨鹽析正常足月分娩產婦胎盤5-10個，應用組織搗碎機勻漿，加2倍體積生理鹽水攪拌20-40分鐘，離心3000-6000r/min20分鐘，去沉淀，上清用50％飽和硫酸銨鹽析，4000-10000r/min20分鐘，棄上清，沉淀用生理鹽水溶解，以生理鹽水透析至無NH+。
1.2 sephadex G200柱層析取sephadex G20010克，按常規處理裝柱(2.5×100cm)用0.1-0.3mol/LNaCl和0.05mol/Ltris-HCl緩沖液(PH8.0)平衡，取鹽析濃縮樣品10ml，流速10-80ml/h以每管2-10ml分別收集洗脫液，應用HPL血球試劑檢查各管濃度，收集HPL高濃度管合并，用50％飽和硫酸銨沉淀，透析至無NH+。
1.3 HPL偶聯sepharose4B親和層析取瑞典pharmacia公司生產的sepharose4B10-40ml，經0.5mol/LNaCl和冷蒸餾水淋洗后冰浴，加入新配制的溴化氰3.0g/10ml，用0.2mol/LNaOH調PH值，使之維持在5-12左右，反應5-20分鐘，用布氏漏斗抽干，加入經0.1mol/LNaHCO3(PH7-11)透析的HPL抗體攪拌4℃過夜，次日裝柱，用0.01mol/L(0.5mol/LNaCI)磷酸鹽緩沖液洗至280nmOD值＜0.01為止，收集全部洗脫液，經紫外分光光度計測定280nmOD值，計算其偶聯率為78.2％。將合并的高濃度樣品5ml加入HPL抗體親和層析柱中(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PH6-8)洗脫，流速10-60ml/h洗至280nmOD值＜0.02時，改用0.1mol/L甘氨酸-HCl緩沖液(PH2.4)解吸附，流速10-80ml/h，收集HPL高濃度區，用50％飽和硫酸銨濃縮除鹽。
1.4抗人全血抗體偶聯sepharose4B親和層析柱制備與HPL抗體偶聯sepharose4B相同，其偶聯率為7.28％。將濃縮除鹽HPL樣品5ml加入抗人全血抗體親和層析柱中，(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PH7.0)洗脫，洗速為30ml/h，收集第一蛋白吸收峰，合并各管濃縮，凍干為HPL純品。
2．HPL抗血清的制備選擇2kg雄性家兔，于雙后足掌注射活卡介苗5-40mg,5-20天后向淋巴結周圍多點注射，HPL抗原加福氏完全佐劑0.5-4ml,(每千克體重50-400μgHPL抗原)。以后每間隔一周免疫一次，經5次免疫后，試血效價達到1∶64倍時(雙向瓊脂擴散法)，頸動脈放血分離血清。
3．人“O”型紅細胞的醛化取健康男性“O”型紅細胞，經戊二醛、甲醛、丙酮醛處理后，配成10％醛化血球懸液。
4．HPL抗血清致敏醛化血球取10％醛化血球離心后用0.1mol/L醋酸鈉配成1-10％血球，將HPL IgG分別稀釋成2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml濃度與等量醛化血球混合，在20-60℃恒溫振蕩水浴下反應1-3小時，經含有0.1-3％兔血清的磷酸鹽緩沖液洗去未結合IgG，配成1％血球懸液，生產出HPL凍干診斷血球。
5．將HPL抗血清用0.02mol/LTris-HCL、0.15mol/LNaCl、0.05％NaN3稀釋成100、150、200倍，于56℃滅活10-40分鐘，分別加入等體積煮沸后冷卻40-70℃的1-4％瓊脂液，混合均勻鋪板。瓊脂厚度1-4mm，打孔直徑1-5mm，孔距0.5-3cm。
本發明制備的HPL的鑒定1.8％聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳，常規制備分離膠與濃縮膠，取50μg提純的HPL純品進行聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳，電流2mA/管，用1％氨基黑染色呈現一條帶。
2．免疫電泳結果表明本室提純的HPL只與HPL抗血清和妊娠全血清呈現一條免疫沉淀弧。
3．雙向免疫交叉試驗結果表明提純的HPL與抗HCG，抗AFP，抗SP，抗人全血清無免疫沉淀線，而與抗HPL血清和抗妊娠全血清有明顯的沉淀線，從而表明所提純的HPL為胎盤泌乳素純品。
以上三種方法按“實驗免疫學技術”介紹的方法進行。
4．檢查單向免疫擴散板非特異性取非孕婦女血清9份，男性血清9份，分別加入HPL單向免疫板瓊脂孔內各30μl，放置37℃恒溫24小時判定結果，均無沉淀環出現，說明HPL單向免疫板無非特異性反應。
5．穩定性檢查將HPL單向免疫板存放4℃不同月份進行比較，每批均加入相同樣品各30μl，放置37℃恒溫24小時進行觀察，發現放置6個月以內的免疫板，其沉淀環大小和清晰度無差別，而放置6個月以上的免疫板，沉淀環清晰度略差，由于免疫板放置時間過長，導致HPL抗血清失活。經觀察比較，免疫板使用期限應在6個月以內為宜，每批使用前，均用HPL標準進行質量檢測。
下面結合實施例詳細敘述本發明。
1HPL的提純1.1飽和硫酸銨鹽析正常足月分娩產婦胎盤10個，應用組織搗碎機勻漿，加2倍體積生理鹽水攪拌30分鐘，離心4000r/min20分鐘，去沉淀，上清用50％飽和硫酸銨鹽析，5000r/min20分鐘，棄上清，沉淀用生理鹽水溶解，以生理鹽水透析至無NH+。
1.2 sephadex G200柱層析取sephadex G20010克，按常規處理裝柱(2.5×100cm)用0.2mol/LNaCl和0.05mol/Ltris-HCl緩沖液(PH8.0)平衡，取鹽析濃縮樣品10ml，流速60ml/h以每管5ml分別收集洗脫液，應用HPL血球試劑檢查各管濃度，收集HPL高濃度管合并，用50％飽和硫酸銨沉淀，透析至無NH+。
1.3HPL偶聯sepharose4B親和層析取瑞典pharmacia公司生產的sepharose 4B30ml，經0.5mol/LNaCl和冷蒸餾水淋洗后冰浴，加入新配制的溴化氰3.0g/10ml，用0.2mol/LNaOH調PH值，使之維持在11左右，反應10分鐘，用布氏漏斗抽干，加入經0.1mol/LNaHCO3(PH9)透析的HPL抗體攪拌4℃過夜，次日裝柱，用0.01mol/L(0.5mol/LNaCI)磷酸鹽緩沖液洗至280nmOD值＜0.01為止，收集全部洗脫液，經紫外分光光度計測定280nmOD值，計算其偶聯率為78.2％。將合并的高濃度樣品5ml加入HPL抗體親和層析柱中(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PH7.4)洗脫，流速30ml/h洗至280nmOD值＜0.02時，改用0.1mol/L甘氨酸-HCl緩沖液(PH2.4)解吸附，流速60ml/h，收集HPL高濃度區，用50％飽和硫酸銨濃縮除鹽。
1.4抗人全血抗體偶聯sepharose4B親和層析柱制備與HPL抗體偶聯sepharose4B相同，其偶聯率為7.28％。將濃縮除鹽HPL樣品5ml加入抗人全血抗體親和層析柱中，(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PH7.0)洗脫，洗速為30ml/h，收集第一蛋白吸收峰，合并各管濃縮，凍干為HPL純品。
2．HPL抗血清的制備選擇2kg雄性家兔，于雙后足掌注射活卡介苗20mg,10天后向淋巴結周圍多點注射，HPL抗原加福氏完全佐劑2ml,(每千克體重150μgHPL抗原)。以后每間隔一周免疫一次，經5次免疫后，試血效價達到1∶64倍時(雙向瓊脂擴散法)，頸動脈放血分離血清。
3．人“O”型紅細胞的醛化取健康男性“O”型紅細胞，經戊二醛、甲醛、丙酮醛處理后，配成10％醛化血球懸液。
4．HPL抗血清致敏醛化血球取10％醛化血球離心后用0.1mol/L醋酸鈉配成5％血球，將HPLIgG分別稀釋成2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml濃度與等量醛化血球混合，在45℃恒溫振蕩水浴下反應1.5小時，經含有1％兔血清的磷酸鹽緩沖液洗去未結合IgG，配成1％血球懸液，生產出HPL凍干診斷血球。
5．將HPL抗血清用0.02mol/LTris-HCL、0.15mol/LNaCl、0.05％NaN3稀釋成100、150、200倍，于56℃滅活10-40分鐘，分別加入等體積煮沸后冷卻56℃的2.4％瓊脂液，混合均勻鋪板。瓊脂厚度3.0mm，打孔直徑4.0mm，孔距1.5cm。
本發明應用實施例取10μl孕婦血清用1ml鹽水稀釋成100倍等待檢測用，在V型微量血凝板上，從第1孔到第5孔各加樣品稀釋水25μl，取100倍稀釋的血清25μl加到第1孔，用微量加樣器從第1孔起依次做2倍稀釋到第4孔，第5孔為空白對照，凍干HPL診斷血球用血球稀釋水2ml溶解并搖勻，4℃過夜放置后應用，取25μl稀釋血球從第1孔到第5孔各加25μl，震勻后放37℃，1小時取出判定結果。
判定標準孕婦血清中HPL能與HPL抗體致敏血球出現凝集反應(陽性)，反之，如血清中不含有或濃度較低，則不出現凝集(陰性)，依據出現血球凝集的血清最大稀釋倍數乘以致敏血球的敏感度(0.125μg/ml)，便可確定血清中HPL的濃度。
判定方法血球全部沉入孔底為陰性，根據凝集程度分為1-4各階段，凝集在2以上可判定為陽性。
計算公式血清中HPL含量(μg/ml)=血球凝集孔的血清稀釋倍數×診斷血球的敏感度(μg/ml)。
用毛細玻璃管取孕婦耳垂血0.1ml，分離出血清，用微量加樣器吸取15微升加入瓊脂孔內(注意不要溢出孔外)，加樣完畢后，放置20-30分鐘，待孔內血清沉淀完后再補加15微升血清，總計為30微升，蓋好塑料板，水平放人溫盒內，在37℃條件下擴散24小時觀察結果，分別記錄所測樣品的免疫沉淀環直徑(mm)，從標準曲線上可查出HPL值，即得該樣品的HPL含量。通過應用HPL標準品標定出血球敏感度為0.025μg/ml，確定孕38周以上大于5μg/ml為正常值，5μg/ml為警界值，小于5μg/ml為危險值。其中標準曲線的制備方法是在瓊脂板孔內分別加入4個不同濃度的HPL標準液，每孔加樣30μl，放人37℃恒溫24小時后觀察沉淀環直徑，發現選擇150倍稀釋后所做的瓊脂板，免疫沉淀環直徑比較清晰，其擴散環直徑分別為9mm、6.5mm、5.2mm、4.7mm，以標準含量為橫坐標，標準液免疫沉淀環直徑為縱坐標，繪制標準工作曲線。(參考德國Benring研究所的HPL標準)
權利要求
1.一種人胎盤泌乳素診斷血球、單向免疫擴散板的制備方法，該方法采用如下步驟(1)HPL的提純(1.1)飽和硫酸銨鹽析正常足月分娩產婦胎盤5-10個，應用組織搗碎機勻漿，加2倍體積生理鹽水攪拌20-40分鐘，離心3000-6000r/min20分鐘，去沉淀，上清用50％飽和硫酸銨鹽析，4000-10000r/min20分鐘，棄上清，沉淀用生理鹽水溶解，以生理鹽水透析至無NH+。(1.2)sephadex G200柱層析取sephadex G20010克，按常規處理裝柱(2.5×100cm)用0.1-0.3mol/LNaCl和0.05mol/Ltris-HCl緩沖液(PH8.0)平衡，取鹽析濃縮樣品10ml，流速10-80ml/h以每管2-10ml分別收集洗脫液，應用HPL血球試劑檢查各管濃度，收集HPL高濃度管合并，用50％飽和硫酸銨沉淀，透析至無NH+。(1.3)HPL偶聯sepharose4B親和層析取瑞典pharmacia公司生產的sepharose4B10-40ml，經0.5mol/LNaCl和冷蒸餾水淋洗后冰浴，加入新配制的溴化氰3.0g/10ml，用0.2mol/LNaOH調PH值，使之維持在5-12左右，反應5-20分鐘，用布氏漏斗抽干，加入經0.1mol/LNaHCO3(PH7-11)透析的HPL抗體攪拌4℃過夜，次日裝柱，用0.01mol/L(0.5mol/LNaCI)磷酸鹽緩沖液洗至280nmOD值＜0.01為止，收集全部洗脫液，經紫外分光光度計測定280nmOD值，計算其偶聯率為78.2％。將合并的高濃度樣品5ml加入HPL抗體親和層析柱中(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PH6-8)洗脫，流速10-60ml/h洗至280nmOD值＜0.02時，改用0.1mol/L甘氨酸-HCl緩沖液(PH2.4)解吸附，流速10-80ml/h，收集HPL高濃度區，用50％飽和硫酸銨濃縮除鹽。(1.4)抗人全血抗體偶聯sepharose4B親和層析柱制備與HPL抗體偶聯sepharose4B相同，其偶聯率為7.28％。將濃縮除鹽HPL樣品5ml加入抗人全血抗體親和層析柱中，(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PH7.0)洗脫，洗速為30ml/h，收集第一蛋白吸收峰，合并各管濃縮，凍干為HPL純品。(2)HPL抗血清的制備選擇2kg雄性家兔，于雙后足掌注射活卡介苗5-40mg,5-20天后向淋巴結周圍多點注射，HPL抗原加福氏完全佐劑0.5-4ml,(每千克體重50-400μgHPL抗原)。以后每間隔一周免疫一次，經5次免疫后，試血效價達到1∶64倍時(雙向瓊脂擴散法)，頸動脈放血分離血清。(3)人“O”型紅細胞的醛化取健康男性“O”型紅細胞，經戊二醛、甲醛、丙酮醛處理后，配成10％醛化血球懸液。(4)HPL抗血清致敏醛化血球取10％醛化血球離心后用0.1mol/L醋酸鈉配成1-10％血球，將HPLIgG分別稀釋成2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml濃度與等量醛化血球混合，在20-60℃恒溫振蕩水浴下反應1-3小時，經含有0.1-3％兔血清的磷酸鹽緩沖液洗去未結合IgG，配成1％血球懸液，生產出HPL凍干診斷血球。(5)將HPL抗血清用0.02mol/LTris-HCL、0.15mol/LNaCl、0.05％NaN3稀釋成100、150、200倍，于56℃滅活10-40分鐘，分別加人等體積煮沸后冷卻40-70℃的1-4％瓊脂液，混合均勻鋪板。瓊脂厚度1-4mm，打孔直徑1-5mm，孔距0.5-3cm。
2.一種人胎盤泌乳素診斷血球、單向免疫擴散板在判定胎盤功能方面的應用。
全文摘要
一種人胎盤泌乳素診斷血球、單向免疫擴散板的制備方法和應用,是應用免疫學原理,從人胎盤提取HPL,經兩次親和層析后獲得高純度的HPL,分別制成診斷血球和擴散板,本發明的HPL純品為單一成份,無非特異性,并與HPL抗血清有免疫反應,而與抗HCG、抗AFP、抗人全血清無免疫反應,應用本發明,方法簡單,操作方便,性能穩定,結果準確,一般實驗室均可操作,在臨床上對妊娠高血壓綜合癥、胎兒發育遲緩、死胎、過期妊娠等異常疾病的診斷有較大參考意義,是圍產期監護的最佳診斷試劑。
文檔編號G01N33/554GK1289926SQ99113260
公開日2001年4月4日 申請日期1999年9月24日 優先權日1999年9月24日
發明者王曉東 申請人:吉林省計劃生育科學技術研究所