一種蛋白質傳感膜及其制備方法和用途
【專利摘要】本發明公開了一種蛋白質傳感膜及其制備方法和用途，所述蛋白質傳感膜由三層結構組成：底層是基片，中間層是納米銀粒子層，上層是無熒光基團的聚合物薄膜；蛋白質傳感膜的制備方法如下：利用巰基硅烷偶聯劑使基片硅烷化；將硅烷化的基片置于納米銀溶膠中浸泡，形成納米銀基底；將無熒光基團的聚合物溶解后旋涂在納米銀粒子層表面形成聚合物層，即得到基于自組裝納米銀粒子的蛋白質傳感膜，對某些具有熒光特性的蛋白質等物質的檢測信號可增強到數倍，應用于具有熒光特性蛋白質的快速檢測；本發明所提供的制備方法簡單，易于實施，可操作性強。
【專利說明】一種蛋白質傳感膜及其制備方法和用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種基于自組裝納米銀粒子的蛋白質傳感膜及其制備方法和用途。
【背景技術】
[0002]傳感技術作為現代信息技術的三大支柱之一，在國家安全、科學試驗、環境監測及醫療衛生等方面發揮著重要作用。生物傳感技術是傳感技術的一個重要分支，它與生物信息學、仿生學、生物計算機等學科一起，處在生命科學和信息科學的交叉領域。生物傳感技術的研究重點是將生物活性材料與傳感器有機結合，成為新型分析儀器和檢測技術的重點發展領域。
[0003]傳統的生物傳感技術通常需要標記、靈敏度低、過程繁瑣、效率低，其中大部分的工作量用于標記，使用放射性同位素、熒光基團做標示物，安全性和穩定性差，不能滿足快速、靈敏、低污染的需求，迫切需要新型的高靈敏度、高效、方便、經濟的生化分子檢測方法和技術。因此，近年來橢圓偏振光、石英晶振微天平、表面等離子共振技術等無標記傳感技術得到迅速發展。
[0004]金、銀等金屬納米粒子具有高度活躍的外層電子，當光波輻射到粒徑遠小于其激發波長的金屬納米粒子時，產生的表面等離子體波被限域在納米結構的附近，當入射光頻率與自由電子集體震蕩頻率相當時則產生共振。當金屬粒子與熒光體間距離在一定范圍內時，金屬粒子會使熒光體的輻射衰減速率增加或發生共振能量轉移，使熒光體的熒光強度增強，大大提高了對目標物檢測的靈敏度。以其方便快捷、靈敏度高等多項特點，深受研究人員的青睞。目前的研究大多將蛋白質等熒光生物大分子直接附著在金屬粒子層表面，存在金屬粒子裸露于空氣中、且生物大分子與金屬粒子之間距離不可調等問題，導致許多技術問題還沒有解決，限制了其應用。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于提供一種蛋白質傳感膜及其制備方法和用途。主要技術方案是在納米銀粒子層上覆蓋一層無熒光基團的隔離層，通過納米銀的局域表面等離子體共振效應，利用隔離層吸附蛋白質，通過蛋白質等熒光物質的熒光光譜增強實現這些蛋白質的快速、靈敏檢測。
[0006]本發明提供的一種蛋白質傳感膜，其由三層結構組成:底層是基片，中間層是納米銀粒子層，上層是無熒光基團的聚合物薄膜，所述基片為玻璃片或石英片。
[0007]本發明還提供一種所述的蛋白質傳感膜的制備方法，包括如下步驟:
(1)將納米銀前驅體、還原劑分別溶于蒸餾水，得到納米銀前驅體溶液和還原劑溶液；將納米銀前驅體溶液加熱煮沸一段時間，然后邊攪拌，邊向其中滴加入還原劑溶液，繼續加熱一段時間后停止加熱，冰水浴降至室溫，離心除去上層清液，得到納米銀溶膠；
(2)將偶聯劑溶于甲醇形成偶聯劑溶液，將干凈的基片通過等離子表面處理30min，然后常溫下置于偶聯劑溶液中浸泡一段時間，使基片表面硅烷化，自然風干后得到硅烷化基片;
(3)將步驟(2)中得到的硅烷化基片浸泡在步驟(1)得到的納米銀溶膠中一段時間，然后取出，真空干燥后在硅烷化基片表面形成納米銀粒子層，得到納米銀基片；
(4)將無熒光基團的聚合物溶解于有機溶劑得到旋涂液，進而采用旋涂法在步驟(3)得到的納米銀基片上制備聚合物薄膜，自然風干后即得到蛋白質傳感膜。
[0008]步驟(1)中所述納米銀前驅體為硝酸銀、醋酸銀中的一種，前驅體溶液中，前驅體與蒸餾水的質量比為0.1-0.5:500 ;前驅體溶液加熱煮沸溫度為120°C~140°C，加熱煮沸時間為0.5^1h ;所述還原劑為檸檬酸鈉，還原劑溶液中，還原劑與蒸餾水的質量比為f 10:500，向前驅體溶液滴加入還原劑溶液后保持溫度不變，繼續加熱時間為5~20min ;前驅體溶液與還原劑溶液體積比1:1。
[0009]步驟(2)中所述偶聯劑為Y-巰丙基三甲氧基硅烷、Y-巰丙基三乙氧基硅烷中的一種，偶聯劑與甲醇的質量比為I~2:100 ;基片為玻璃片或石英片，基片在偶聯劑溶液中浸泡時間為0.5~2h。
[0010]步驟(3)中所述的浸泡時間為0.5~lh。
[0011]步驟(4)旋涂液中，無熒光基團聚合物與有機溶劑的質量比為0.01-0.2:1000，所述無熒光基團聚合物為聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯醇中的一種，聚甲基丙烯酸甲酯數均分子量為1.0 X IO5~1.6 X 105，聚乙烯醇平均聚合度為1600~3000，醇解度≥98%，有機溶劑為四氫呋喃、乙醇中的一種；旋涂法制備聚合物薄膜的轉速為100(T3000rpm，時間為2(T60s。
[0012]本發明還提供一種蛋白質傳感膜的用途，應用于具有熒光特性蛋白質的快速檢測，具體是應用于骨形態發生蛋白或牛血清蛋白的快速檢測。
[0013]本發明的有益效果:
本發明利用巰基與銀的相互作用，采用自組裝法在載玻片或石英片上負載了一層具有一定有序性的納米銀粒子，使其成為具有局域表面等離子體共振效應的基底。將親水性聚合物旋涂在納米銀基底表面成膜，與納米銀基底相比，不僅可調節納米銀粒子與熒光物質之間的距離，進而調整熒光增強效應，而且還可以隔絕納米銀與空氣，阻礙納米銀被氧化。本發明制備工藝簡單，操作性強。
[0014]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為本發明基于自組裝納米銀的蛋白質傳感膜的結構示意圖(其中:1為基片，2為納米銀粒子層，3為無熒光基團的聚合物薄膜)。
[0016]圖2為本發明中實施例1硅烷化基片上納米銀粒子的掃描電鏡圖。
[0017]圖3為本發明中實施例2硅烷化基片上納米銀粒子的掃描電鏡圖。
[0018]圖4為本發明中實施例3硅烷化基片上納米銀粒子的掃描電鏡圖。
[0019]圖5為本發明實施例1傳感膜與石英基片上測定骨形態發生蛋白的熒光光譜對比圖(圖5a、b分別為石英基片與傳感膜上骨形態發生蛋白的熒光光譜曲線)。
[0020]圖6為本發明實施例2傳感膜與石英基片上測定牛血清蛋白的熒光光譜對比圖(圖6c、d分別為石英基片與傳感膜上牛血清蛋白的熒光光譜曲線)。
[0021]圖7為本發明實施例3傳感膜與石英基片上測定牛血清蛋白的熒光光譜對比圖(圖7e、f分別為石英基片與傳感膜上牛血清蛋白的熒光光譜曲線)。
[0022]
【具體實施方式】
[0023]下面結合具體的實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于下列實施例，應包括權利要求書中的全部內容。
[0024]實施例1
(I)將納米銀前驅體硝酸銀、還原劑檸檬酸鈉分別溶于蒸餾水，得到納米銀前驅體溶液和還原劑溶液，前驅體溶液中質量比硝酸銀:蒸餾水為0.5:500，還原劑溶液中質量比檸檬酸鈉:蒸餾水為10:500 ;將前驅體溶液加熱至130°C煮沸lh，然后邊攪拌，邊向其中滴加入還原劑溶液，保持溫度繼續加熱20min ;冰水浴降至室溫，離心除去上層清液，得到納米銀溶膠。前驅體溶液與還原劑溶液體積比1:1。
[0025](2)將偶聯劑Y-巰丙基三甲氧基硅烷溶于甲醇形成偶聯劑溶液，質量比Y-巰丙基三甲氧基硅烷:甲醇為1:100 ;將干凈石英片通過等離子表面處理30min，然后常溫下置于偶聯劑溶液中浸泡2h，使石英片表面硅烷化，自然風干后得到硅烷化基片。
[0026](3)將步驟(2)中得到的硅烷化基片在步驟(I)得到的納米銀溶膠中浸泡0.5h，然后取出，真空干燥后在硅烷化基片表面形成納米銀粒子層，得到納米銀基片。如附圖2所
/Jn ο
[0027](4)將聚甲基丙烯酸甲酯(數均分子量為1.0X IO5)溶解于四氫呋喃得到旋涂液，質量比聚甲基丙烯酸甲酯:四氫呋喃為0.2:1000 ;進而采用旋涂法在步驟(3)得到的納米銀基片上制備聚合物薄膜，自然風干后即得到蛋白質傳感膜。旋涂法制備聚合物薄膜的轉速為lOOOrpm，時間為30s。
[0028](5)分別在石英基片和上述制備的蛋白質傳感膜上滴加骨形態發生蛋白(BMP-2)的水溶液，真空干燥后測定熒光發射光譜，結果如附圖5 (a)、圖(b)所示。
[0029]實施例2
(I)將納米銀前驅體硝酸銀、還原劑檸檬酸鈉分別溶于蒸餾水，得到納米銀前驅體溶液和還原劑溶液，前驅體溶液中質量比硝酸銀:蒸餾水為0.1:500，還原劑溶液中質量比檸檬酸鈉:蒸餾水為1:500 ;將前驅體溶液加熱至120°C煮沸0.5h，然后邊攪拌，邊向其中滴加入還原劑溶液，保持溫度繼續加熱5min ;冰水浴降至室溫，離心除去上層清液，得到納米銀溶膠。前驅體溶液與還原劑溶液體積比1:1。
[0030](2)將Y-巰丙基三乙氧基硅烷溶于甲醇形成偶聯劑溶液，質量比Y-巰丙基三乙氧基硅烷:甲醇為2:100 ;將干凈的玻璃片通過等離子表面處理30min，然后常溫下置于偶聯劑溶液中浸泡lh，使玻璃片表面硅烷化，自然風干后得到硅烷化基片。
[0031](3)將步驟(2)中得到的硅烷化基片在步驟(I)得到的納米銀溶膠中浸泡lh，然后取出，真空干燥后在硅烷化基片表面形成納米銀粒子層，得到納米銀基片。如附圖3所示。
[0032](4)將聚乙烯醇(平均聚合度為2400，醇解度> 98%)溶解于有機溶劑乙醇得到旋涂液，質量比聚乙烯醇:乙醇為0.01:1000 ;進而采用旋涂法在步驟(3)得到的納米銀基片上制備聚合物薄膜，自然風干后即得到蛋白質傳感膜。旋涂法制備聚合物薄膜的轉速為2000rpm，時間為 60s。[0033](5)分別在石英基片和上述制備的蛋白質傳感膜上滴加牛血清蛋白(BSA)的水溶液，真空干燥后測定熒光發射光譜，結果如附圖6 (C)、圖6 (d)所示。
[0034]實施例3
(I)將納米銀前驅體醋酸銀、還原劑檸檬酸鈉分別溶于蒸餾水，得到納米銀前驅體溶液和還原劑溶液，前驅體溶液中質量比醋酸銀:蒸餾水為0.3:500，還原劑溶液中質量比檸檬酸鈉:蒸餾水為5:500 ;將前驅體溶液加熱至120°C煮沸lh，然后邊攪拌，邊向其中滴加入還原劑溶液，保持溫度繼續加熱20min ;冰水浴降至室溫，離心除去上層清液，得到納米銀溶膠。前驅體溶液與還原劑溶液體積比1:1。
[0035](2)將偶聯劑Y-巰丙基三甲氧基硅烷溶于甲醇形成偶聯劑溶液，質量比Y-巰丙基三甲氧基硅烷:甲醇為1.5:100 ;將干凈的石英片通過等離子表面處理30min，然后常溫下置于偶聯劑溶液中浸泡lh，使石英片表面硅烷化，自然風干后得到硅烷化基片。
[0036](3)將步驟(2)中得到的硅烷化基片在步驟(I)得到的納米銀溶膠中浸泡0.8h，然后取出，真空干燥后在硅烷化基片表面形成納米銀粒子層，得到納米銀基片。如附圖4所
/Jn ο
[0037](4)將聚乙烯醇(平均聚合度為1600，醇解度> 98%)溶解于乙醇得到旋涂液，質量比聚乙烯醇:乙醇為0.2:1000 ;進而采用旋涂法在步驟(3)得到的納米銀基片上制備聚合物薄膜，自然風干后即得到蛋白質傳感膜。旋涂法制備聚合物薄膜的轉速為2000rpm，時間為 40s。
[0038](5)分別在石英基片和上述制備的蛋白質傳感膜上滴加牛血清蛋白(BSA)的水溶液，真空干燥后測定熒光發射光譜，結果如附圖7 (e)、圖7 (f)所示。
【權利要求】
1.一種蛋白質傳感膜，其特征在于:其由三層結構組成:底層是基片，中間層是納米銀粒子層，上層是無熒光基團的聚合物薄膜，所述基片為玻璃片或石英片。
2.—種權利要求1所述的蛋白質傳感膜的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (1)將納米銀前驅體、還原劑分別溶于蒸餾水，得到納米銀前驅體溶液和還原劑溶液；將納米銀前驅體溶液加熱煮沸一段時間，然后邊攪拌，邊向其中滴加入還原劑溶液，繼續加熱一段時間后停止加熱，冰水浴降至室溫，離心除去上層清液，得到納米銀溶膠； (2)將偶聯劑溶于甲醇形成偶聯劑溶液，將干凈的基片通過等離子表面處理30min，然后常溫下置于偶聯劑溶液中浸泡一段時間，使基片表面硅烷化，自然風干后得到硅烷化基片; (3)將步驟(2)中得到的硅烷化基片浸泡在步驟(1)得到的納米銀溶膠中一段時間，然后取出，真空干燥后在硅烷化基片表面形成納米銀粒子層，得到納米銀基片； (4)將無熒光基團的聚合物溶解于有機溶劑得到旋涂液，進而采用旋涂法在步驟(3)得到的納米銀基片上制備聚合物薄膜，自然風干后即得到蛋白質傳感膜。
3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于:步驟(1)中所述納米銀前驅體為硝酸銀、醋酸銀中的一種，前驅體溶液中，前驅體與蒸餾水的質量比為0.1-0.5:500 ;前驅體溶液加熱煮沸溫度為 120°C~140°C，加熱煮沸時間為0.5^1h ;所述還原劑為檸檬酸鈉，還原劑溶液中，還原劑與蒸懼水的質量比為廣10:500,向前驅體溶液滴加入還原劑溶液后保持溫度不變，繼續加熱時間為5~20min ;前驅體溶液與還原劑溶液體積比1:1。
4.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于:步驟(2)中所述偶聯劑為Y-巰丙基三甲氧基硅烷、Y _疏丙基二乙氧基硅烷中的一種，偶聯劑與甲醇的質量比為I~2:100 ;基片為玻璃片或石英片，基片在偶聯劑溶液中浸泡時間為0.5~2h。
5.權利要求2所述的制備方法，其特征在于:步驟(3)中所述的浸泡時間為0.5~lh。
6.權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)旋涂液中，無熒光基團聚合物與有機溶劑的質量比為0.01、.2:1000，所述無熒光基團聚合物為聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯醇中的一種，聚甲基丙烯酸甲酯數均分子量為1.0X IO5UXlO5,聚乙烯醇平均聚合度為1600-3000，醇解度> 98%，有機溶劑為四氫呋喃、乙醇中的一種；旋涂法制備聚合物薄膜的轉速為100(T3000rpm，時間為20~60s。
7.—種權利要求1所述的蛋白質傳感膜的用途，其特征在于:應用于具有熒光特性蛋白質的快速檢測，具體是應用于骨形態發生蛋白或牛血清蛋白的快速檢測。
【文檔編號】G01N21/64GK103995104SQ201410153514
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年4月17日 優先權日:2014年4月17日
【發明者】易國斌, 劉念, 梁真飛, 俎喜紅, 羅洪盛, 劉順彭 申請人:廣東工業大學