一種制備光合色素的定量標準品方法
【專利摘要】本發明公開了一種制備光合色素的定量標準品方法，通過對淡水藻類進行單種培養，在避光條件下，提取單種培養淡水藻類中的混合光合色素，再通過分離和純化，得到目標光合色素，然后濃縮得到富集目標光合色素，對富集目標光合色素進行定量，即得到光合色素的定量標準品。本發明方法能快速、經濟地制備至少包括全部淡水藻類光合色素中常見的9類目標診斷光合色素的定量標準品，產品使用方便，重復性好，準確性和可靠性高，可廣泛地應用于研究浮游植物或超微型浮游植物類群組成研究等諸領域中。
【專利說明】一種制備光合色素的定量標準品方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及環境監測【技術領域】，尤其涉及一種制備浮游植物光合色素的定量標準品方法。
【背景技術】
[0002]浮游植物是水生生態系統中初級生產力的主要貢獻者，也是水華等生態災害的元兇。浮游植物的生物量及群落結構特征是水體環境評估的一個重要指標。浮游植物生物量及群落結構特征的常見分析方法有:紫外可見分光光度法、突光分光光度法及顯微鏡鏡檢等方法。顯微鏡分析雖然可以獲得詳細的浮游植物種類組成信息，但其具有工作量大、耗時長等缺點；且分析者需要很強的浮游植物分類學知識和背景，不同實驗室之間對樣品的分析結果存在較大的差異；另外，顯微鏡觀察前必須進行細胞固定及濃縮，部分浮游植物在固定濃縮過程中會產生細胞破裂，導致分析結果產生誤差；尤其是顯微鏡檢測對于5微米以下的超微型浮游植物存在極大困難。紫外可見分光光度法及熒光分光光度法是基于浮游植物均含有葉綠素a、且其與浮游植物生物量存在較好的相關性這一基礎而建立起來的，但此法只能提供浮游植物生物量的信息，而無法取得浮游植物群落結構等具體的特征信息。
[0003]浮游植物細胞除了都含有葉綠素aGhlorophyll a)外，不同浮游植物類群中還具有特異性的葉綠素類及類胡蘿卜素組成。如硅藻中含有墨角藻黃素(巖藻黃素，fucoxanthin),甲藻中含有多甲藻素(peridinin),藍藻中含有玉米黃素(zeaxanthin),綠藻中含有葉綠素b (chlorophyll b),隱藻中含有別藻黃素(alloxanthin)。在這些特定浮游植物類群的細胞中，特異性的葉綠素類及類胡蘿卜素含量與葉綠素a含量的比值相對穩定。隨著高效液相色譜技術的不斷發展，浮游植物細胞中各種光合色素都能得到有效分離，以光合色素為生物標志物的化學分類法很快被提出。以光合色素為生物標志物的化學分類法從上個世紀90年代被提出，經過20多年發展，已經成為一個成熟可靠的研究方法，目前已被廣泛應用于河口、近海、陸架及開放大洋區域。相對于海洋，淡水中浮游植物光合色素的研究起步較晚。目前，有關淡水湖泊及河流中的化學分類法均基于海洋藻類的特征色素與葉綠素比值而建立起來。但由于淡水藻類在色素組成及其特征色素與葉綠素a的比值與海洋藻類存在一定差異，直接將海洋藻類的特征色素與葉綠素a的比值外推到淡水藻類，可能會導致對淡水浮游植物類群組成的分析結果與實際情況存在差異。因此，非常有必要開展淡水常見優勢藻類的光合色素的組成、含量及特征色素與葉綠素a的比值等研究。
[0004]要對淡水中浮游植物光合色素組成及含量進行分析，首先要對光合色素進行定性和定量。浮游植物光合色素種類繁多，單種藻細胞的光合色素組成非常復雜。因此，浮游植物光合色素研究的定性、定量工作較為困難，其中用于光合色素分析的定量標準品的獲得就是主要困難之一。
[0005]據國外相關文獻 Antonio Picazo, et al.Spectrophotometric methods forthe determination of photosynthetic pigments in stratified lakes: a criticalanalysis based on comparisons with HPLC determinations in a model lake[J].Limnetica, 2013, 32 (I): 139-158.等報道，淡水藻類光合色素中常見的9類目標診斷色素以及含有這些目標診斷色素的部分單種藻見表1。
[0006]表1部分單種藻及含有的目標診斷色素種類
【權利要求】
1.一種制備光合色素的定量標準品方法，其特征在于包括如下步驟: (1)、對淡水藻類進行單種培養，然后提取單種培養淡水藻類中的混合光合色素； (2)、對步驟(1)得到的混合光合色素進行分離和純化，得到目標光合色素； (3 )、對步驟(2 )得到的目標光合色素進行濃縮，得到富集目標光合色素； (4)、對步驟(3)得到的富集目標光合色素進行定量，即得到光合色素的定量標準品； 上述混合光合色素、目標光合色素、富集目標光合色素和光合色素的定量標準品均不見光。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(1)所述的淡水藻類是從水華發生的淡水水域環境中分離純化得到的藻類。
3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(1)所述的單種培養條件光照為1000-40001ux,溫度為25°C，培養基為BG11、CS1、BBM、119、AF-6中的一種，有關的對比用海藻用f/2培養基培養。
4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(1)所述提取單種培養淡水藻類中的混合光合色素的方法是,將培養好的單種藻用過濾技術或者以4000~6000rpm/5min離心的方法濃縮和收集，收集于離心管中，將上清液多余水分棄去，加入預冷至O~4°C的二甲基甲酰胺，振蕩搖勻后置于-10~-20°C溫度下抽提30~50min，期間搖晃1_2次，然后將提取液用帶有聚四氟乙烯濾 膜的注射器過濾于色譜瓶中，即得到混合光合色素。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于:所述的過濾技術是這樣實現的，濾過25~47mm GF/F膜，抽濾負壓為0.01~0.02MPa，濾膜于-10~_20°C保存，樣品在過濾后24小時內進行高效液相色譜分析測定，處理在低光下進行；將濾膜用濾紙吸干水分后，剪成細條儲于5ml離心管中，離心管用黑貼紙包裹以避光。
6.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(2)所述的對混合光合色素進行分離和純化，是采用高效液相色譜法，分別根據各光合色素的保留時間，手動或自動分步收集不同保留時間的各色素而實現。
7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于:步驟(3)所述的對目標光合色素進行濃縮，是采用高效液相色譜法并重復操作1-4次實現。
8.根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于:所述高效液相色譜法，色譜柱型號為Eclipse XDB-C8、規格為3.5 μ m，4.6X 150mm，通過二極管陣列檢測器(DAD)檢測洗出峰，固定記錄波長為440nm和667nm，波長范圍為300~700nm，流動相A是體積比為甲醇:IM乙酸銨=80:20的混合溶液，流動相B為甲醇； 所述流動相A的配制方法是，將甲醇與IM乙酸銨按體積比4:1比例混合，通過pH計測定逐滴加入乙酸調節至pH=7.0~7.2，并用0.45 μ m醋酸纖維濾膜過濾，超聲波清洗器超聲脫氣20~30min ； 用于所述高效液相色譜法分析的所有試劑均為色譜純。
9.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(3)所述的富集目標光合色素，是所述對步驟(2)得到的目標光合色素進行濃縮后，再采用冷凍濃縮技術濃縮得到。
10.根據權利要求1~9任一項所述的制備方法，其特征在于:步驟(4)所述的對富集目標光合色素進行定量是這樣實現的，將富集目標光合色素用60-90%乙醇或60-90%丙酮溶解后經紫外分光光度測定其在最大吸收波長處的吸光度，并扣除在750nm處的雜質吸收，然后根據如下公式進行定量計算: 胡蘿卜素類:
【文檔編號】G01N33/00GK103792116SQ201410022083
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月17日 優先權日:2014年1月17日
【發明者】侯建軍, 胡俊, 李家園, 賀云彥, 周婷, 鄭和龍, 畢永紅 申請人:湖北師范學院