一種檢測乳腺癌中cyclin G1蛋白表達并進行預后評估的方法
【專利摘要】一種檢測乳腺癌中cyclin?G1蛋白表達并進行預后評估的方法，將cyclin?G1蛋白作為分子標記，利用cyclin?G1單克隆抗體，結合免疫組化試劑盒，檢測cyclin?G1蛋白在乳腺癌組織中的相對表達量；特異性抗cyclin?G1蛋白的抗體用于制備確定乳腺癌手術預后的制劑或試劑盒；將乳腺癌組織切片進行免疫組化染色；每張病理切片多點拍攝，計算腫瘤組織中cyclin?G1蛋白分子表達量；根據陽性細胞百分率和染色強度進行半定量分析。本發明的優點：首次明確提出了cyclin?G1蛋白能夠用于制備判斷乳腺癌患者預后的蛋白分子標記，操作簡便易行，對于乳腺癌病人術后監控和序貫治療具有重要的臨床指導意義。
【專利說明】—種檢測乳腺癌中cycl in G1蛋白表達并進行預后評估的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，特別提供了一種檢測乳腺癌中cyclin Gl蛋白表達并進行預后評估的方法，為乳腺癌的預后判斷提供了一種新的分子標記。
【背景技術】
[0002]乳腺癌是一種嚴重危害人類的疾病。在我國發病率位居女性惡性腫瘤之首，且發病率逐年升高，每年用于乳腺癌治療的支出大大增加，乳腺癌已嚴重危害我國人民生命財產安全，制約社會經濟發展。乳腺癌發生發展是一個多因素參與并相互作用的復雜過程。涉及癌細胞本身、癌細胞與癌周微環境及宿主免疫狀態的多因素異常參與了乳腺癌的不良預后。國內外研究發現不少的癌基因、生長因子等與乳腺癌細胞復發轉移密切相關，可能成為乳腺癌的預后指標。但由于傳統的臨床預后指標有其自身的局限性，尚不能完全反映乳腺癌的生物學特性，也難以滿足臨床上對乳腺癌預測的要求。隨著分子生物學技術的發展，為了進一步指導乳腺癌的治療和預后的判斷，闡明乳腺癌發生發展的分子機制，尋找相關標志物和干預靶點一直以來都是乳腺癌研究領域的熱點。
[0003]因此，加大對乳腺癌腫瘤標記物和預后因子的研究勢在必行，本領域迫切需要尋找能預測乳腺癌病情及預后的相關基因和/或蛋白，這將對臨床治療具有重要意義和價值。
[0004]細胞周期素Gl (Cyclin Gl)基因是1993年Tamura等在鼠成纖維細胞中尋找新的Src家族成員過程中發現的，定位于染色體5q32_q34區域。有6個外顯子,其cDNA長約3.17kb。作為一種新的細胞周期素，cyclin Gl通過與MDM2、PP2A等分子相互作用，參與了細胞多種生物學過程，如細胞周期和增殖、DNA損傷修復、細胞凋亡等。更為重要的是，cyclin Gl與抑癌基因p53關系密切,cyclin Gl與p53相互結合,形成交互負反饋調節,提示該分子的異常表達可能在腫瘤發生發展中起到了重要作用。近年來研究證實，cyclin Gl高表達對成骨肉瘤細胞、結腸癌細胞、伯基特淋巴瘤等腫瘤細胞的生長有促進作用，并且與急性淋巴細胞白血病、慢性粒細胞白血病等惡性血液病密切相關。最新的研究表明，cyclinGl還參與調控肝癌細胞的上皮間質轉化和復發轉移的過程，并對肝癌起始細胞起到了促進和維持作用。但是作為重要的癌基因，cyclin Gl在乳腺癌中的作用在國內外尚無任何報道，因此本研究主要分析了乳腺癌中cyclinGl的表達及其臨床意義，同時我們在此基礎上也初步評價了 cyclin Gl作為乳腺癌預后指標和干預靶點的價值，對乳腺癌的個體化治療和預后判斷具有重要的理論意義和潛在的臨床應用價值。
[0005]乳腺癌做為對人類健康威脅最大的腫瘤之一，至今其發生發展的分子機制仍不十分清楚，對其的預后評估仍缺少特異性的分子標志物，盡管cyclin Gl已被證明是重要的腫瘤調節蛋白，但是其在乳腺癌中的表達及和對乳腺癌患者預后評估的作用國內外尚無任何報道。
【發明內容】

[0006]本發明的目的是采用免疫組化方法檢測cyclin Gl蛋白在乳腺癌組織中的相對表達量，能夠判斷乳腺癌患者術后出現復發轉移的風險及生存狀況，基于cyclin Gl蛋白的相對表達量與乳腺癌的這種相關性，以該蛋白作為分子標記對其表達量進行檢測可以用于指導乳腺癌的預后判斷，特提供了一種檢測乳腺癌中cyclin Gl蛋白表達并進行預后評估的方法。
[0007]本發明提供了一種檢測乳腺癌中cyclin Gl蛋白表達并進行預后評估的方法，其特征在于:將cyclin Gl蛋白作為分子標記,利用cyclin Gl單克隆抗體,結合免疫組化試劑盒，檢測cyclin Gl蛋白在乳腺癌組織中的相對表達量；所述的cyclinGl單克隆抗體購自Santa Cruz公司(sc_8016);相應的,特異性抗cyclin Gl蛋白的抗體用于制備確定乳腺癌手術預后的制劑或試劑盒；
[0008]包括以下內容:
[0009](a)利用本試劑盒中的二甲苯，乙醇，3%H202甲醇液，1%BSA封閉液，DAB顯色試劑，蘇木素和辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG將乳腺癌組織切片進行免疫組化染色；
[0010](b)每張病理切片利用顯微鏡和成像裝置在癌及癌旁組織多點拍攝，每張切片拍攝癌及癌旁各3張數碼照片；
[0011](C)兩名以上病理科醫生分析腫瘤和瘤旁組織中陽性信號強度及陽性細胞百分率，給出評分；
[0012](d)根據評分計算腫瘤組織中cyclin Gl蛋白分子表達量。
[0013]所述的體外檢測cyclin Gl蛋白在乳腺癌組織中的表達量的方法，具體步驟如下:
[0014](I)制備乳腺癌組織石蠟切片，50?70°C烤箱過夜；
[0015](2)切片脫臘至水；
[0016]二甲苯 8min — 二甲苯 8min — 二甲苯 12min — 100% 乙醇 5min — 95% 乙醇5min — 85% 乙醇 5min — 75% 乙醇 5min —雙蒸水 5min
[0017]⑶3%H202甲醇液，室溫放置20?30min ；
[0018](4)雙蒸水洗三次,每次5min ；
[0019](5)抗原修復:切片放入0.0IM檸檬酸鹽緩沖液(ρΗ6.0)中煮沸5min，停火lOmin，再煮沸5min ；
[0020](6)自然冷卻至室溫,雙蒸水洗三次,每次5min ;
[0021](7) 1%BSA 封閉 30min，37 °C ；
[0022](8)甩去封閉液，不洗，直接加一抗，所述的一抗為鼠cyclin Gl單克隆抗體，可識別人組織中cyclin Gl蛋白，購自美國Santa Cruz公司，稀釋比例1:25 ;置入濕盒中30min，37°C，然后4°C冰箱過夜16小時；
[0023](9)4°C取出，室溫復溫10?20min，然后0.0lM PBS洗四次，每次5min ;
[0024](10)滴加二抗，所述的二抗為辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG，購自丹麥DAKO公司，即用型，無需稀釋，45min，37°C ；
[0025](11)0.0lM PBS 洗四次，每次 5min，DAB 顯色 2-10min，鏡下觀察；
[0026](12)雙蒸水終止顯色，蘇木素復染10秒；[0027](13)分化后自來水返藍，蒸餾水浸泡；
[0028](14)脫水透明，蓋玻片覆蓋；
[0029](15)顯微鏡下觀察陽性染色，分別于乳腺癌組織和癌旁組織各隨機選取3個視野，拍照；
[0030](16)采用結果判定:細胞胞漿或細胞膜呈清晰黃褐色顆粒為陽性表達；高倍鏡(X400)下在乳腺癌及癌旁組織各隨機觀察3個視野并拍照，根據陽性細胞百分率和染色強度進行半定量分析；
[0031]染色強度:無染色O分，染色弱但強于陰性對照記I分，染色清晰記2分；陽性細胞數〈10%記O分，10%~25%記I分，25%~50%記2分，>50%記3分；
[0032]兩項指標乘積之和O~I分為陰性病例(_)，≥2分為陽性病例(+)，≥4分為強陽性病例(++);由兩位病理科醫師雙盲法計數，差異超過10%需重新計數；cyclin Gl高低表達標準以119例乳腺癌組織中cyclinGl表達評分的中位數(2.5)為界。
[0033]本發明的cyclin Gl蛋白與乳腺癌相關性的發現為預測乳腺癌遠處轉移風險以及患者術后的生存或死亡提供一條全新的途徑，對判斷乳腺癌患者預后具有重要作用，對于乳腺癌病人術后監控和輔助治療也具有重要的指導意義。當癌組織cyclinGl免疫組化評分高于2.5時，乳腺癌患者易出現復發或遠處轉移，術后易死亡。
[0034]由以上試驗結果可知，通過采用免疫組化的方法檢測cyclin Gl蛋白分子相對表達量能預測乳腺癌遠處轉移風險以及患者術后的生存或死亡。當癌組織cyclin Gl免疫組化評分高于2.5時，乳腺癌易出現遠處轉移，乳腺癌患者術后總體生存期較短。顯然，cyclinGl蛋白的表達與乳腺癌的預后負向相關，因此，以cyclin Gl蛋白作為分子標記物，對其表達量進行檢測并合理分析能較準確的預測乳腺癌患者手術后復發轉移及存活死亡等事件，是乳腺癌預后評估的新靶點。
[0035]本發明的優點:
[0036]本發明所述的檢測乳腺癌中cyclin Gl蛋白表達并進行預后評估的方法，利用免疫組化技術、病理評分測定腫瘤組織及其相對的瘤旁組織中cyclin Gl蛋白相對表達量，并結合術后隨訪信息，確定cyclin Gl蛋白相對表達量與手術后乳腺癌患者預后存在的相關性，明確了 cyclin Gl蛋白能夠用于制備判斷乳腺癌患者預后的蛋白分子標記，操作簡便易行，對于乳腺癌病人術后監控和序貫治療具有重要的臨床指導意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]下面結合附圖及實施方式對本發明作進一步詳細的說明:
[0038]圖1為cyclin Gl在乳腺癌和癌旁組織中的高表達和低表達的免疫組化染色圖片;
[0039]圖2為cyclin Gl在119例的乳腺癌樣本中，癌組織較癌旁組織中呈現高表達(ρ〈0.05)；
[0040]圖3為cyclin Gl高表達病例乳腺癌組織切片免疫組化染色結果，腫瘤組織中可見cyclin Gl強陽性著色；
[0041]圖4為cyclin Gl高表達病例乳腺癌組織切片免疫組化染色結果，腫瘤組織中可見cyclin Gl陽性著色；[0042]圖5為依據cyclin Gl表達高低將乳腺癌患者分組的總體生存曲線圖；
[0043]圖6為依據cyclin Gl表達高低將乳腺癌患者分組的無瘤生存曲線圖。
【具體實施方式】
[0044]實施例1:
[0045]本發明采用免疫組化方法檢測cyclin Gl蛋白在乳腺癌組織中的相對表達量，具體步驟為: [0046](I)制備乳腺癌組織石蠟切片，60°C烤箱過夜；
[0047](2)切片脫臘至水；
[0048](二甲苯 IOmin — 二甲苯 IOmin — 二甲苯 IOmin — 100% 乙醇 5min — 95% 乙醇5min — 85% 乙醇 5min — 75% 乙醇 5min —雙蒸水 5min)
[0049](3) 3%H202 甲醇液，室溫放置 20min ；
[0050](4)雙蒸水洗三次,每次5min ；
[0051](5)抗原修復:切片放入0.0IM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中煮沸5min，停火lOmin，再煮沸5min ；
[0052](6)自然冷卻至室溫,雙蒸水洗三次,每次5min ;
[0053](7) 1%BSA 封閉 30min，37 °C ；
[0054](8)甩去封閉液，不洗，直接加cyclin Gl 一抗(1:25)。置入濕盒中30min，37°C，然后4°C冰箱過夜16小時；
[0055](9)4°〇取出，室溫復溫151^11，然后0.0謹PBS洗四次，每次5min ;
[0056](10)滴加鼠二抗，45min，37°C ;
[0057](11)0.01M PBS洗洗四次，每次5min，DAB顯色2-10min，鏡下觀察;
[0058](12)雙蒸水終止顯色，蘇木素復染10秒；
[0059](13)分化后自來水返藍，蒸餾水浸泡；
[0060](14)脫水透明，蓋玻片覆蓋；
[0061](15)顯微鏡下觀察陽性染色，分別于乳腺癌組織和癌旁組織各隨機選取3個視野，拍照；
[0062](16)2名病理科醫生給出評分；具體方法為，細胞胞漿或細胞膜呈清晰黃褐色顆粒為陽性表達。高倍鏡(X400)下隨機觀察5個視野，根據陽性細胞百分率和染色強度進行半定量分析[16]，染色強度:無染色O分，染色弱但強于陰性對照記I分，染色清晰記2分；陽性細胞數〈10%記O分，10%~25%記I分，25%~50%記2分，>50%記3分。兩項指標積分之和O~I分為陰性病例(2), > 2分為陽性病例(+),3 4分為強陽性病例(++)。由兩位病理科醫師雙盲法計數，差異超過10%需重新計數[18]。cyclin Gl高低表達標準以119例肝癌組織中cyclin Gl表達評分的中位數(2.5)為界；
[0063]如圖1所示，分別為cyclin Gl在乳腺癌和癌旁組織中的高表達和低表達的免疫組化染色圖片，經多組實驗驗證，如圖2所示，cyclin Gl在119例的乳腺癌樣本中，癌組織較癌旁組織中呈現高表達(P〈0.05)。
[0064]實施例2:
[0065]本發明提供了一種檢測乳腺癌中cyclin Gl蛋白表達并進行預后評估的方法，其特征在于:將cyclin Gl蛋白作為分子標記,利用cyclin Gl單克隆抗體,結合免疫組化試劑盒，檢測cyclin Gl蛋白在乳腺癌組織中的相對表達量；所述的cyclinGl單克隆抗體購自Santa Cruz公司(sc_8016);相應的,特異性抗cyclin Gl蛋白的抗體用于制備確定乳腺癌手術預后的制劑或試劑盒；
[0066]包括以下內容:
[0067](a)利用本試劑盒中的二甲苯，乙醇，3%H202甲醇液，1%BSA封閉液，DAB顯色試劑，蘇木素和辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG將乳腺癌組織切片進行免疫組化染色；
[0068](b)每張病理切片利用顯微鏡和成像裝置在癌及癌旁組織多點拍攝，每張切片拍攝癌及癌旁各3張數碼照片；
[0069](C)兩名以上病理科醫生分析腫瘤和瘤旁組織中陽性信號強度及陽性細胞百分率，給出評分；
[0070](d)根據評分計算腫瘤組織中cyclin Gl蛋白分子表達量。
[0071]所述的體外檢測cyclin Gl蛋白在乳腺癌組織中的表達量的方法，具體步驟如下:
[0072](I)制備乳腺癌組織石蠟切片，50?70°C烤箱過夜；
[0073](2)切片脫臘至水；
[0074]二甲苯 8min — 二甲苯 8min — 二甲苯 12min — 100% 乙醇 5min — 95% 乙醇5min — 85% 乙醇 5min — 75% 乙醇 5min —雙蒸水 5min
[0075]⑶3%H202甲醇液，室溫放置20?30min ；
[0076](4)雙蒸水洗三次,每次5min ；
[0077](5)抗原修復:切片放入0.0IM檸檬酸鹽緩沖液(ρΗ6.0)中煮沸5min，停火lOmin，再煮沸5min ；
[0078](6)自然冷卻至室溫,雙蒸水洗三次,每次5min ;
[0079](7) 1%BSA 封閉 30min，37 °C ；
[0080](8)甩去封閉液，不洗，直接加一抗，所述的一抗為鼠cyclin Gl單克隆抗體，可識別人組織中cyclin Gl蛋白，購自美國Santa Cruz公司，稀釋比例1:25 ;置入濕盒中30min，37°C，然后4°C冰箱過夜16小時；
[0081](9)4°C取出，室溫復溫10?20min，然后0.0lM PBS洗四次，每次5min ;
[0082](10)滴加二抗，所述的二抗為辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG，購自丹麥DAKO公司，即用型，無需稀釋，45min，37°C ；
[0083](11)0.0lM PBS 洗四次，每次 5min，DAB 顯色 2-10min，鏡下觀察；
[0084](12)雙蒸水終止顯色，蘇木素復染10秒；
[0085](13)分化后自來水返藍，蒸餾水浸泡；
[0086](14)脫水透明，蓋玻片覆蓋；
[0087](15)顯微鏡下觀察陽性染色，分別于乳腺癌組織和癌旁組織各隨機選取3個視野，拍照；
[0088](16)采用結果判定:細胞胞漿或細胞膜呈清晰黃褐色顆粒為陽性表達；高倍鏡(X400)下在乳腺癌及癌旁組織各隨機觀察3個視野并拍照，根據陽性細胞百分率和染色強度進行半定量分析；[0089]染色強度:無染色O分，染色弱但強于陰性對照記I分，染色清晰記2分；陽性細胞數〈10%記O分，10%~25%記I分，25%~50%記2分，>50%記3分；
[0090]兩項指標乘積之和O~I分為陰性病例(_)，≥2分為陽性病例(+)，≥4分為強陽性病例(++);由兩位病理科醫師雙盲法計數，差異超過10%需重新計數；cyclin Gl高低表達標準以119例乳腺癌組織中cyclinGl表達評分的中位數(2.5)為界。
[0091]本發明的cyclin Gl蛋白與乳腺癌相關性的發現為預測乳腺癌遠處轉移風險以及患者術后的生存或死亡提供一條全新的途徑，對判斷乳腺癌患者預后具有重要作用，對于乳腺癌病人術后監控和輔助治療也具有重要的指導意義。當癌組織cyclinGl免疫組化評分高于2.5時，乳腺癌患者易出現復發或遠處轉移，術后易死亡。
[0092]由以上試驗結果可知，通過采用免疫組化的方法檢測cyclin Gl蛋白分子相對表達量能預測乳腺癌遠處轉移風險以及患者術后的生存或死亡。當癌組織cyclin Gl免疫組化評分高于2.5時，乳腺癌易出現遠處轉移，乳腺癌患者術后總體生存期較短。顯然，cyclinGl蛋白的表達與乳腺癌的預后負向相關，因此，以cyclin Gl蛋白作為分子標記物，對其表達量進行檢測并合理分析能較準確的預測乳腺癌患者手術后復發轉移及存活死亡等事件，是乳腺癌預后評估的新靶點。
[0093]樣本:某乳腺癌細胞癌患者腫瘤的組織切片，采用以上免疫組化方法的試驗步驟檢測cyclinGl蛋白在乳腺癌組織中的相對表達量。乳腺癌組織的顯微圖片如圖3所示。經計算，其癌組織cyclinGl免疫組化評分為3.5。
[0094]經術后隨訪知，該患者術后6個月死亡，無瘤生存期僅3個月。
[0095]由以上試驗結果可知，通過采用免疫組化的方法檢測cyclin Gl蛋白分子相對表達量能預測乳腺癌遠處轉移風險以及患者術后的生存或死亡。當癌組織cyclinGl免疫組化評分高于2.5時，乳腺癌易出現遠處轉移，乳腺癌患者術后易死亡。顯然，cyclinGl蛋白與乳腺癌具有相關性，因此，以cyclinGl蛋白作為蛋白質分子標記對其表達量進行檢測能預測乳腺癌手術后復發轉移等事件，并判斷預后。總之，特異性抗cyclinGl蛋白的單克隆抗體能用于制備確定乳腺癌手術預后的制劑或試劑盒，操作簡便易行，有臨床應用的可行性。
[0096]以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特征和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等同物界定。
【權利要求】
1.一種檢測乳腺癌中cyclin Gl蛋白表達并進行預后評估的方法，其特征在于:將cyclin Gl蛋白作為分子標記,利用cyclin Gl單克隆抗體,結合免疫組化試劑盒,檢測cyclin Gl蛋白在乳腺癌組織中的相對表達量；相應的，特異性抗cyclin Gl蛋白的抗體用于制備確定乳腺癌手術預后的制劑或試劑盒； 包括以下內容: (a)利用本試劑盒中的二甲苯，乙醇，3%H202甲醇液，1%BSA封閉液，DAB顯色試劑，蘇木素和辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG將乳腺癌組織切片進行免疫組化染色； (b)每張病理切片利用顯微鏡和成像裝置在癌及癌旁組織多點拍攝，每張切片拍攝癌及癌旁各3張數碼照片； (C)兩名以上病理科醫生分析腫瘤和瘤旁組織中陽性信號強度及陽性細胞百分率，給出評分； Cd)根據評分計算腫瘤組織中cyclin Gl蛋白分子表達量。
2.按照權利要求1所述的檢測乳腺癌中cyclinGl蛋白表達并進行預后評估的方法，其特征在于:所述的體外檢測cyclin Gl蛋白在乳腺癌組織中的表達量的方法，具體步驟如下: (1)制備乳腺癌組織石蠟切片，50~70°C烤箱過夜； (2)切片脫臘至水； 二甲苯 8min — 二甲苯 8min — 二甲苯 12min — 100% 乙醇 5min — 95% 乙醇 5min — 85%乙醇5min — 75%乙醇5min —雙蒸水5min (3)3%H202甲醇液，室溫放置20~30min ； (4)雙蒸水洗三次(置于搖床上)，每次5min； (5)抗原修復:切片放入0.01M檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中煮沸5min，停火lOmin，再煮沸5min，在高壓鍋中煮沸，要求達到1.5個大氣壓； (6)自然冷卻至室溫,雙蒸水洗三次,每次5min；
(7)1%BSA 封閉 30min, 37°C ； (8)甩去封閉液，不洗，直接加一抗，所述的一抗為鼠cyclinGl單克隆抗體，可識別人組織中cyclin Gl蛋白，稀釋比例1:25 ;置入濕盒中，可維持濕性環境的密閉盒子，保持30min，37°C ;然后4°C冰箱過夜16小時； (9)4°C取出，室溫復溫10~20min，然后0.01M PBS洗四次，每次5min ； (10)滴加二抗，所述的二抗為辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG，購自丹麥DAKO公司，即用型，無需稀釋，45min，37°C ； (11)0.01M PBS洗四次，每次5min，DAB顯色2_10min，鏡下觀察； (12)雙蒸水終止顯色，蘇木素復染10秒； (13)分化后自來水返藍,蒸餾水浸泡； (14)脫水透明，蓋玻片覆蓋； (15)顯微鏡下觀察陽性染色，分別于乳腺癌組織和癌旁組織各隨機選取3個視野，拍昭.(16)采用結果判定:細胞胞漿或細胞膜呈清晰黃褐色顆粒為陽性表達；高倍鏡(X400)下在乳腺癌及癌旁組織各隨機觀察3個視野并拍照，根據陽性細胞百分率和染色強度進行半定量分析； 染色強度:無染色O分，染色弱但強于陰性對照記I分，染色清晰記2分；陽性細胞數<10%記O分，10%~25%記I分，25%~50%記2分，>50%記3分； 兩項指標積分之和O~I分為陰性病例(2)，> 2分為陽性病例(+)，> 4分為強陽性病例(++);由兩位病理科醫師雙盲法計數，差異超過10%需重新計數；cyclin Gl高低表達標準以119例乳腺癌組織中cy·clinGl表達評分的中位數(2.5)為界。
【文檔編號】G01N33/574GK103592444SQ201310618890
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月27日 優先權日:2013年11月27日
【發明者】謝曉冬, 韓濤, 劉兆喆, 郭放, 樸瑛, 宋敏, 孫慶慶 申請人:中國人民解放軍沈陽軍區總醫院