專利名稱：一種利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡的制作方法
技術領域：
本發明屬于免疫檢測技術領域，具體涉及一種利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡。
背景技術：
布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌引起的一種人畜共患全身傳染病,在世界各地都廣泛流行，被世界動物衛生組織(OIE)列為B類動物疫病，我國將其列為二類動物疫病，是國際貿易檢驗中必檢的一種傳染病。布魯氏菌可感染包括人類在內的多種家畜和野生動物，主要通過消化道、皮膚黏膜、呼吸道等途徑侵入機體，感染后引起相似的臨床癥狀，如長期發熱、流產與不育、虛弱、關節痛及肝脾腫大等。1897年，丹麥醫生Bang發現了導致牛流產的布魯氏菌，又稱班活氏菌，又稱流產布魯氏菌(Brucella abortus)。布魯氏菌病在我國廣泛存在，尤其以畜牧生產為主的東北、華北、西北一帶，經常有疫情爆發的報道，直接危害人類的健康，嚴重困擾畜牧業的發展和動物及其產品的進出口貿易。為防控該病，各國學者建立了多種布魯氏菌病診斷和檢測技術，主要包括細菌學、免疫學和分子生物學等方法。目前布魯氏菌病的診斷手段主要包括病原分離鑒定、虎紅平板凝集試驗(RBT)、試管凝集試驗(SAT)、補體結合試驗(CFT)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、PCR 等。免疫膠體金技術自問世以來，得到了迅速發展。廣泛應用于化學檢測和免疫學檢測領域，尤其是膠體金免疫層析技術具有操作簡單、快速靈敏、結果清楚、易于判斷和保存，且無需任何儀器設備等優點。更適合于臨床快速診斷和基層、農村等流行病學調查大規模應用。在我國，布魯氏菌病的檢測標準方法是WS269-2007，但其敏感性和特異性差、反應時間長、假陽性率相對較高，為國際貿易已淘汰技術。酶聯免疫吸附試驗、PCR為目前較常用的該疫病的診斷方法，但均存在樣品前處理復雜、儀器設備昂貴、分析費事長、要求熟練的專業技術人員才能完成等問題。但布魯氏菌病多發于農村和牧區，基層單位特別是牧區設備簡單、技術人員缺少，很難對該病開展廣泛檢測。因此，開發簡便易行、靈敏、特異、快速的布魯氏菌病現場篩查方法具有現實與實踐意義。

發明內容
本發明的目的在于提供一種敏感度高、特異性好、操作簡單、低成本的利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原現場快速檢測試紙卡及其檢測方法。一種利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡，所述檢測試紙卡由外殼I和其內部的試紙條2構成，外殼I由上板3和下板4構成，上板3有檢測窗5和加樣孔6，試紙條2由底板7和在底板7上依次粘貼的樣品吸收墊8、膠體金標記墊9、檢測反應區10構成，樣品吸收墊8正對加樣孔6，檢測反應區10正對檢測窗5。所述膠體金標記墊9包被有牛布魯氏菌抗體-膠體金標記物。
所述牛布魯氏菌抗體-膠體金標記物的制備方法為:(I)將牛布魯氏菌抗體在0.005M/L ρΗ7.0的NaCl溶液中4°C透析過夜，4°C，10000-12000rpm 條件下離心 Ih ；(2)將0D526的膠體金溶液的pH調節至5.0-9.0 ；(3)將步驟(I)離心得到的牛布魯氏菌抗體用0.005M/L pH9.0的硼酸鹽緩沖溶液稀釋至5 μ g/ml 50 μ g/ml,取Iml稀釋后的牛布魯氏菌抗體加入到Iml膠體金溶液中,振蕩混勻，靜置5min，加入0.1mll0%的NaCl溶液，混勻后靜置2h，離心純化制得膠體金標記的牛布魯氏菌抗體。所述檢測反應區10由包被牛布魯氏菌抗體-載體蛋白偶聯物的測試區11和包被牛布魯氏菌抗原的質控區12組成。所述牛布魯氏菌抗體-載體蛋白偶聯物的制備方法為:(I)取5mg牛布魯氏菌抗體和2.5mg載體蛋白溶解在250 μ I TE buffer中，充分震蕩使其溶解，再取EDC.HC179mg充分溶解于250 μ I TE buffer中；(2)將牛布魯氏菌抗體和載體蛋白的混合溶液邊震蕩邊逐滴加入EDC.HCl溶液，在37°C搖床中反應2h以上；(3)先用S印hadex柱分離步驟(2)反應后的偶聯產物和未結合的牛布魯氏菌抗體，再透析純化，將0.5ml溶液在PBS中透析3d，每天換液兩次，每次換液200ml，透析產物分裝成20份，于_20°C保存，得到牛布魯氏菌抗體-載體蛋白偶聯物。所述載體蛋白為牛血清白蛋白、血藍蛋白或雞卵白蛋白。所述樣品吸收墊含有植物凝集素或抗紅細胞抗體。所述抗紅細胞抗體為使用人紅細胞免疫小鼠、羊或兔，常規制備的抗紅細胞單克隆抗體。上述檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡的檢測方法，按照如下步驟進行:(I)血液樣品處理:血液標本收集在潔凈、干燥的容器內，將采集的新鮮血液加入濃度為2.5%抗凝劑；(2)取經過處理的血液樣品100 μ L,滴入加樣孔；(3)待血液樣品流過測試區和質控區，判定樣品中是否含有牛布魯氏菌抗原，判定規則如下:陰性(_):僅質控區出現一條紫紅色條帶，在測試區內無紫紅色條帶出現；陽性⑴:兩條紫紅色條帶出現，一條位于測試區內，另一條位于質控區內；無效:當質控區不顯示出紫紅色條帶，則無論測試區顯示出紫紅色條帶與否，該試紙卡判為無效。本發明的檢測原理:當含有牛布魯氏菌抗原的血液樣品流經膠體金標記墊時，膠體金標記墊上的牛布魯氏菌抗體-膠體金標記物與牛布魯氏菌抗原結合，繼續流經質控區時牛布魯氏菌抗體-膠體金標記物與質控區的牛布魯氏菌抗原結合顯示紫紅色條帶，流經測試區時牛布魯氏菌抗體-膠體金標記物和牛布魯氏菌抗原的結合物與牛布魯氏菌抗體-載體蛋白偶聯物相結合，顯示紫紅色條帶，若血液樣品沒有牛布魯氏菌抗原，這種結合則不能進行，測試區不顯示紫紅色。本發明的有益效果:本發明的牛布魯氏菌抗原現場快速檢測試紙卡靈敏度和重復率高，特異性強，穩定性能好，假陽率和假陰率控制在I %以下，吸收墊含有的植物凝集素或抗紅細胞抗體能有效的凝集攔截紅細胞，避免紅細胞透過吸收墊，干擾后續的檢測，該試紙卡檢測反應容易觀察區別，使用方便，適合于臨床快速診斷和基層、農村等流行病學調查大規模應用。


圖1為本發明試紙卡結構示意圖；圖2為本發明試紙條結構示意圖；圖中，1-外殼、2_試紙條、3_上板、4_下板、5_檢測窗、6_加樣孔、7_底板8_樣品吸收墊、9-膠體金標記墊、10-檢測反應區、11-測試區、12-質控區。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明做進一步說明。實施例1利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡結構利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡，如圖1和圖2所示，所述檢測試紙卡由外殼I和其內部的試紙條2構成，外殼I由上板3和下板4構成，上板3有檢測窗5和加樣孔6，試紙條2由底板7和在底板7上依次粘貼的樣品吸收墊8、膠體金標記墊9、檢測反應區10構成，樣品吸收墊8正對加樣孔6，檢測反應區10正對檢測窗5。膠體金標記墊9包被有布魯氏菌抗體和膠體金標記物。檢測反應區10由包被布魯氏菌抗體-載體蛋白偶聯物的測試區11和包被布魯氏菌抗原的質控區12組成。載體蛋白為牛血清白蛋白、血藍蛋白或雞卵白蛋白。樣品吸收墊含有植物凝集素或抗紅細胞抗體。抗紅細胞抗體為使用人紅細胞免疫小鼠、羊或兔，常規制備的抗紅細胞單克隆抗體。實施例2檢測牛布魯氏菌抗原的方法1、牛布魯氏菌抗體-膠體金標記物的制備(I)將牛布魯氏菌抗體在0.005M/L ρΗ7.0的NaCl溶液中4°C透析過夜，4°C，10000-12000rpm 條件下離心 Ih ；(2)將0D526的膠體金溶液的pH調節至4.0-9.0 ；(3)將步驟(I)離心得到的牛布魯氏菌抗體用0.005M/L pH9.0的硼酸鹽緩沖溶液稀釋至5 μ g/ml 50 μ g/ml,取Iml稀釋后的牛布魯氏菌抗體加入到Iml膠體金溶液中,振蕩混勻，靜置5min，加入0.1mll0%的NaCl溶液，混勻后靜置2h，離心純化制得膠體金標記的牛布魯氏菌抗體。2、牛布魯氏菌抗體-載體蛋白偶聯物的制備(I)取5mg牛布魯氏菌抗體和2.5mg載體蛋白溶解在250 μ I TE buffer中，充分震蕩使其溶解，再取EDC.HC179mg充分溶解于250 μ I TE buffer中；(2)將牛布魯氏菌抗體和載體蛋白的混合溶液邊震蕩邊逐滴加入EDC.HCl溶液，在37°C搖床中反應2h以上；(3)先用S印hadex柱分離步驟(2)反應后的偶聯產物和未結合的牛布魯氏菌抗體，再透析純化，將0.5ml溶液在PBS中透析3d，每天換液兩次，每次換液200ml，透析產物分裝成20份，于_20°C保存，得到牛布魯氏菌抗體-載體蛋白偶聯物。3、血液樣品的處理取100份經過牛布魯氏菌感染的牛血液樣品，血液標本收集在潔凈、干燥的容器內，將采集的新鮮血液加入濃度為2.5%抗凝劑；血液標本在2°C 8°C冷藏可保存48小時。4、檢測步驟(I)將100份經過處理的血液樣品各100 μ L，標準牛布魯氏菌抗原100 μ L (濃度為10 μ g/ml),去離子水100 μ L,滴入加樣孔；(2)待血液樣品、標準牛布魯氏菌抗原、去離子水流過各自試紙條的測試區和質控區，判定樣品中是否含有牛布魯氏菌抗原，判定規則如下:陰性(-):僅質控區出現一條紫紅色條帶，在測試區內無紫紅色條帶出現；陽性⑴:兩條紫紅色條帶出現，一條位于測試區內，另一條位于質控區內；無效:當質控區不顯示出紫紅色條帶，則無論測試區顯示出紫紅色條帶與否，該試紙卡判為無效。判定結果為:牛血液樣品99份呈陽性，I份呈陰性。實施例3檢測牛布魯氏菌抗原的試紙條假陽性率和假陰性測試實驗1、假陽性測試(I)取100份普通牛血液樣品，采用血液前處理裝置對血液樣品進行處理；(2)將經過處理的100份普通牛血液樣品各100 μ L,去離子水100 μ L,滴入加樣孔；(2)待血液樣品、去離子水流過各自試紙條的測試區和質控區，判定樣品中是否含有牛布魯氏菌抗體，判定規則如下:陰性(-):僅質控區出現一條紫紅色條帶，在測試區內無紫紅色條帶出現；陽性⑴:兩條紫紅色條帶出現，一條位于測試區內，另一條位于質控區內；無效:當質控區不顯示出紫紅色條帶，則無論測試區顯示出紫紅色條帶與否，該試紙卡判為無效。判定結果為:牛血液樣品I份呈陽性，99份呈陰性，全部有效，假陽性率為I %。2、假陰性測試(I)取100份標準牛布魯氏菌抗原(濃度為10yg/ml)各100 μ L，去離子水100 μ L，滴入加樣孔；(2)待標準牛布魯氏菌抗原、去離子水流過各自試紙條的測試區和質控區，判定樣品中是否含有牛布魯氏菌抗原，判定規則如下:陰性(-):僅質控區出現一條紫紅色條帶，在測試區內無紫紅色條帶出現；陽性(+):兩條紫紅色條帶出現，一條位于測試區內，另一條位于質控區內；無效:當質控區不顯示出紫紅色條帶，則無論測試區顯示出紫紅色條帶與否，該試紙卡判為無效。判定結果為:牛血液樣品99份呈陽性，I份呈陰性，全部有效，假陰性率為I %。實施例4檢測牛布魯氏菌抗原的試紙條其他性能的測定
(I)布魯氏菌抗原現場快速檢測試紙卡的特異性測定應用制備的布魯氏菌抗原試紙卡檢測與布魯氏菌種系較近的5種細菌全血，其結果均為陰性，表明其特異性好，無交叉。(2)布魯氏菌抗原現場快速檢測試紙卡的敏感性取外購牛布魯氏菌陽性血清，用ELISA檢測其平均效價約為1: 8000，虎紅平板凝集抗原在血液稀釋度低于50倍時檢測為陽性；布魯氏菌抗原現場快速檢測試紙卡測到的陽性結果的血液效價為1: 6000，血液稀釋度> 6000倍時，試紙卡檢測線顯色不清晰或無顯色。故布魯氏菌抗體現場快速檢測實在卡的靈敏度明顯高于虎紅平板凝集試驗，但其靈敏度仍低于ELISA。(3)布魯氏菌抗原現場快速檢測試紙卡的重復性進行平行檢測5個試紙卡，其檢測結果一致，說明該檢測方法具有可重復性。(4)布魯氏菌抗原現場快速檢測試紙卡的穩定性4°C放置布魯氏菌抗原現場快速檢測試紙卡，定期檢測標準陽性血清，結果顯示其穩定性可保存I年，I年后金釋放速度減慢，層析速度減慢等現象。產品的穩定性為4°c環境為I年。
權利要求
1.一種利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡，其特征在于，所述檢測試紙卡由外殼⑴和其內部的試紙條⑵構成，外殼⑴由上板⑶和下板⑷構成，上板⑶有檢測窗(5)和加樣孔￠)，試紙條(2)由底板(7)和在底板(7)上依次粘貼的樣品吸收墊(8)、膠體金標記墊(9)、檢測反應區(10)構成，樣品吸收墊(8)正對加樣孔(6)，檢測反應區(10)正對檢測窗(5)。
2.根據權利要求1所述一種利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡，其特征在于，所述膠體金標記墊(9)包被有牛布魯氏菌抗體-膠體金標記物。
3.根據權利要求2所述一種利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡，其特征在于，所述牛布魯氏菌抗體-膠體金標記物的制備方法為: (1)將牛布魯氏菌抗體在0.005M/LpH7.0的NaCl溶液中4°C透析過夜，4°C，10000-12000rpm 條件下離心 Ih ； (2)將OD526的膠體金溶液的pH調節至5.0-9.0 ； (3)將步驟(I)離心得到的牛布魯氏菌抗體用0.005M/L pH9.0的硼酸鹽緩沖溶液稀釋至5 μ g/ml 50 μ g/ml,取Iml稀釋后的牛布魯氏菌抗體加入到Iml膠體金溶液中,振蕩混勻，靜置5min，加入0.1ml 10%的NaCl溶液，混勻后靜置2h，離心純化制得膠體金標記的牛布魯氏菌抗體。
4.根據權利要求1所述一種利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡，其特征在于，所述檢測反應區(10)由包被牛布魯氏菌抗體-載體蛋白偶聯物的測試區(11)和包被牛布魯氏菌抗原的質控區(12)組成。
5.根據權利要求4所述一種利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡，其特征在于，所述牛布魯氏菌抗體-載體蛋白偶聯物的制備方法為:(1)取5mg牛布魯氏菌抗體和2.5mg載體蛋白溶解在250 μ I TE buffer中，充分震蕩使其溶解，再取EDC.HC179mg充分溶解于250 μ I TE buffer中； (2)將牛布魯氏菌抗體和載體蛋白的混合溶液邊震蕩邊逐滴加入EDC.HCl溶液，在37°C搖床中反應2h以上； (3)先用Sephadex柱分離步驟(2)反應后的偶聯產物和未結合的牛布魯氏菌抗體，再透析純化，將0.5ml溶液在PBS中透析3d，每天換液兩次，每次換液200ml，透析產物分裝成20份，于_20°C保存，得到牛布魯氏菌抗體-載體蛋白偶聯物。
6.根據權利要求1所述一種利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡，其特征在于，所述載體蛋白為牛血清白蛋白、血藍蛋白或雞卵白蛋白。
7.根據權利要求1所述一種利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡，其特征在于，所述樣品吸收墊含有植物凝集素或抗紅細胞抗體。
8.根據權利要求7所述一種利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡，其特征在于，所述抗紅細胞抗體為使用人紅細胞免疫小鼠、羊或兔，常規制備的抗紅細胞單克隆抗體。
9.應用權利要求1所述檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡的檢測方法，其特征在于，按照如下步驟進行: (I)血液樣品處理:血液標本收集在潔凈、干燥的容器內，將采集的新鮮血液加入濃度為2.5%抗凝劑；(2)取經過處理的血液樣品100μ L，滴入加樣孔； (3)待血液樣品流過測試區和質控區，判定樣品中是否含有牛布魯氏菌抗原，判定規則如下: 陰性(_):僅質控區出現一條紫紅色條帶，在測試區內無紫紅色條帶出現； 陽性(+):兩條紫紅色條帶出現，一條位于測試區內，另一條位于質控區內； 無效:當質控區不顯示出紫紅色條帶，則無論測試區顯示出紫紅色條帶與否，該試紙卡判為無 效。
全文摘要
本發明公開了屬于免疫檢測技術領域的一種利用夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡。該所述檢測試紙卡由外殼和其內部的試紙條構成，外殼由上板和下板構成，上板有檢測窗和加樣孔，試紙條由底板和在底板上依次粘貼的樣品吸收墊、膠體金標記墊、檢測反應區構成，樣品吸收墊正對加樣孔，檢測反應區正對檢測窗。本發明還公開了應用上述試紙條檢測牛布魯氏菌抗原的方法。本發明的牛布魯氏菌抗原現場快速檢測試紙卡靈敏度和重復率高，特異性強，穩定性能好，假陽率和假陰率低，使用方便，容易觀察區別，適合于臨床快速診斷和基層、農村等流行病學調查大規模應用。
文檔編號G01N33/569GK103149356SQ20131003307
公開日2013年6月12日 申請日期2013年1月29日 優先權日2013年1月29日
發明者張明洲, 王旻子, 程曄, 魏建良, 吳海芬, 陳宗倫 申請人:杭州迪恩科技有限公司